Размещено на http://www.allbest.ru/

Харківський національний університет імені В.Н. Каразіна

УДК: 615.9:661.185.1

ДЕЯКІ МЕХАНІЗМИ БІОЛОГІЧНОЇ ДІЇ НОНІЛБЕНЗОЛІВ

03.00.04 - біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Стеценко Світлана Олександрівна

Харків - 2005

доктор біологічних наук, професор Каліман Павло Авксентійович, Харківський національний університет імені В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України, професор кафедри біохімії, м. Харків

кандидат біологічних наук, професор Вороніна Лариса Миколаївна, Національний фармацевтичний університет Міністерства охорони здоров'я України, завідувач кафедри біохімії, м. Харків

Провідна установа: Національний медичний університет імені О.О. Богомольця Міністерства охорони здоров'я України (кафедра біоорганічної, біологічної та фармацевтичної хімії), м. Київ

Захист відбудеться “ 25 ” січня 2006 р. о 16³⁰ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.17 Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, ауд. III-15.

З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4.

Автореферат розісланий " 22” грудня 2005 року.

Учений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук Падалко В.І.

Актуальність теми. Вивчення механізмів біологічної дії нових груп ксенобіотиків і визначення їхньої потенційної небезпеки для організму є актуальною проблемою ксенобіохімії [Губский Ю.И., 1989; Волощенко О.И., Ляшенко В.И., 1996; Стежка В.А., 1999; Штабський Б.М., Гжегоцький М.Р., 1999]. Сьогодні цей напрямок досліджень набуває особливої значущості у зв'язку з несприятливою еко-логічною ситуацією в Україні, спричиненою зокрема хімічним забрудненням навко-лишнього середовища [Сердюк А.М., 1998; Кучерявий В.П., 2000; Циганенко А.Я. та співавт., 2002; Штабський Б.М. та співавт., 2004].

Група нонілбензолів у складі фенольної основи Манніха (ФОМ 9) та її оксиетильованих похідних неонолів ФОМ 9-4; ФОМ 9-12; ФОМ 9-20 належить до поширених забруднювачів водоймищ, у тому числі, джерел водопостачання населення. Це пов'язано з широким використанням цих речовин у багатьох галузях народного господарства як основи промислового випуску миючих засобів, емульгаторів, антикорозійних і бактерицидних препаратів тощо.

Актуальність вивчення механізмів біологічної дії нонілбензолів обумовлена необхідністю вирішення двох наукових проблем. Перша проблема пов'язана з недостатньою глибиною оцінки біологічної активності та відсутністю наукової інформації щодо тонких механізмів реалізації біологічної дії тих груп нонілбензолів, які широко використовуються різними галузями народного господарства. Зокрема в літературі відсутні відомості щодо досліджень неспецифічних механізмів впливу нонілбензолів на систему мікросомального окиснення, оксидантно-антиоксидантну систему, процеси неферментативного вільнорадикального окиснення та перекисного окиснення ліпідів, а також специфічних механізмів впливу на рецепторні, трансмі-терні, трансдукторні системи клітин організму тощо. Це не дає змоги науковцям - розробникам нових технологій вести активний пошук шляхів синтезу менш токсичних і більш перспективних для народного господарства хімічних сполук класу нонілбензолів. Друга проблема пов'язана з науковим обґрунтуванням заходів з охорони об'єктів навколишнього середовища, зокрема поверхневих джерел, що забруднюються стічними водами промислових підприємств, які використовують в технологічних процесах нонілбензоли [Жуков В.И. и соавт., 2000]. Саме урахування механізмів біологічної дії цих речовин є підставою для надійної реґламентації та обґрунтування заходів з охорони довкілля, а також здоров'я населення.

Таким чином, необхідність вирішення цих проблемних напрямків обумовлює актуальність досліджень щодо вивчення механізмів біологічної дії нонілбензолів у складі фенольної основи Манніха та її оксиетильованих похідних, що має теоретичне та практичне значення.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційну роботу виконано у Харківському державному медичному університеті в рамках наукової проблеми “Біохімія і патохімія обміну речовин, механізми регуляції й медична ензимологія” (№ ДР 0103U004546) та науково-дослідної роботи пріоритетного фінансування МОЗ України “Наукове обґрунтування біохімічної моделі структурно-метаболічних зрушень в організмі внаслідок впливу екологічних чинників як прогностичної основи діагностики донозологічних станів” (№ ДР 0199U001763). У вищезазначених темах автор був відповідальним виконавцем фрагментів наукових досліджень щодо вивчення біологічної дії нонілбензолів за умов перорального надходження до організму експериментальних тварин.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було встановлення механізмів біо-логічної дії нової групи ксенобіотиків - нонілбензолів (ФОМ 9, неонолів ФОМ 9-4, ФОМ 9-12, ФОМ 9-20) шляхом визначення їхнього впливу на оксидантно-антиоксидантний гомеостаз, склад біологічних мембран, стан мембранних процесів і процесів нейрогуморальної регуляції в організмі щурів.

Для реалізації поставленої мети вирішували такі задачі:

1. Оцінити біологічну активність нонілбензолів за умов короткочасного та три-валого перорального надходження до організму щурів (картина гострого отруєння, кумулятивні властивості, патоморфологічні зміни в органах і тканинах).

2. Вивчити вплив досліджуваних речовин на стан системи мікросомального окиснення за умов тривалого перорального надходження до організму експери-ментальних тварин.

3. Вивчити вплив нонілбензолів на інтенсивність вільнорадикальних процесів, перекисного окиснення ліпідів та окислювальних модифікацій білків, процесів, пов'язаних з метаболізмом оксиду азоту, та стан антиоксидантної системи.

4. Оцінити наслідки впливу досліджуваних ксенобіотиків на фосфоліпідний склад біологічних мембран, активність ферментних і рецепторних мембрано-зв'язаних комплексів.

5. Дати оцінку впливу нонілбензолів на стан нейротрансмітерних систем і сис-тем вторинних месенджерів (вміст медіаторів, циклічних нуклеотидів і ферментів їхнього метаболізму в тканинах).

6. Узагальнити особливості механізмів дії нонілбензолів за умов короткочасно-го та тривалого перорального надходження до організму експериментальних тварин.

Об'єкт дослідження - механізми біологічної дії нонілбензолів в організмі щурів за умов короткочасного та тривалого впливу.

Предмет дослідження - інтенсивність вільнорадикальних процесів, антиокси-дантна система, структурно-функціональний стан біологічних мембран, активність нейротрансмітерних і месенджерних систем, патоморфологічні зміни в органах і тканинах, картина гострого отруєння за умов перорального надходження ноніл-бензолів до організму щурів.

Методи дослідження - спектрофотометричні (визначення активності ферментів і концентрацій сполук), спектрофлюориметричні (визначення швидкості окиснення сполук), хроматографічні (розділення на фракції, визначення вмісту метаболітів), хемілюмінесцентні (визначення інтенсивності хемілюмінесценції біологічних об'єктів), радіоізотопні (визначення стану рецепторних мембранозв'язаних комплексів), уніфіковані клінічні методи з використанням стандартних наборів реактивів, метод флюоресцентних зондів (визначення параметрів зв'язування медіаторів), морфофункціональні (визначення патологічних зрушень в органах і тканинах), гістохімічні (визначення активності ферментів), токсикологічні (визначення середньолетальних доз, кумулятивних властивостей), статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше одержано нові дані щодо мембраноушкоджуючого та політропного характеру дії нової групи ксенобіотиків - нонілбензолів. Показано, що речовини призводять до активації монооксигеназної системи гепатоцитів, інтенсифікації вільнорадикальних процесів, що підтверджу-ється підвищенням вмісту дієнових кон'югатів, малонового діальдегіду, карбоніль-них груп окисно-модифікованих білків, інтенсивності біохемілюмінесценції на тлі виснаження систем антирадикального й антиперекисного захисту. Уперше отримано результати, які свідчать про реалізацію ефектів нонілбензолів через інтенсифікацію продукції оксиду азоту. Виявлено зміни фосфоліпідного складу мембран з підви-щенням вмісту лізоформ, зниження активності ферментних (аденілатциклази; Na,K-АТФ-ази) і зміни афінності та кількості рецепторних (₁-,₁-адрено-, 5-НТ₁-, 5-НТ₂-серотоніно-, Д₂-дофамінових) комплексів, що підтверджує мембранотропний харак-тер дії досліджуваних речовин. Визначено, що нонілбензоли істотно впливають на стан нейротрансмітерних і месенджерних систем: стимулюють синтез катехоламінів та індоламінів, змінюють спорідненість і кількість мембранних моноамінергічних рецепторів і рецепторів нейроактивних амінокислот (глутамату, аспартату, гліцину), призводять до активації гуанілатциклазної та інгібування аденілатциклазної месенд-жерних систем, що свідчить про порушення внутрішньоклітинного метаболізму. До-ведено, що гостре отруєння організму тварин нонілбензолами характеризується пе-реважанням симптомів порушення центральної нервової, серцево-судинної й ди-хальної систем, а морфологічна картина внутрішніх органів виявляє дистрофічні та деструктивні зміни у мембранах структурно-функціональних одиниць, особливо ви-разні у печінці та головному мозку. Уперше обґрунтовано застосування методу вив-чення параметрів рецепторного зв'язування (константи дисоціації та кількості місць зв'язування) нейроактивних амінокислот за допомогою флюоресцентних зондів.

Теоретичне та практичне значення одержаних результатів. Одержані ре-зультати експериментальних досліджень є новими науковими відомостями щодо механізмів біологічної дії групи ксенобіотиків - нонілбензолів і базовою науковою основою обґрунтування біохімічних моделей структурно-метаболічних зрушень в організмі, що використовуються для розроблення профілактичних і лікувальних заходів. Практичне значення роботи полягає в тому, що її результати використано при обґрунтуванні державних стандартів вмісту досліджуваної групи хімічних речовин в об'єктах навколишнього середовища (акт про впровадження № 11-13б/318 від 10.04.02). Особливості механізмів біологічної дії нової групи азотовмісних детергентів - нонілбензолів ураховані при складанні комплексних програм профілактичних і лікувально-оздоровчих заходів на НВО “Синтез ПАВ” (м. Ше-бекіно, Росія) (акт про впровадження №12/20 від 19.12.01). На методичні прийоми, що використані в дисертаційній роботі, отримано патент “Спосіб визначення параметрів зв'язування нейроактивних амінокислот” (№ 33927 А, G01N 33/48), який занесено до реєстру галузевих нововведень МОЗ України № 18-19-2003 (№ ДР 122/18/03). Теоретичні положення дослідження впроваджено в практику навчання студентів Харківського державного медичного університету.

Особистий внесок здобувача. Особисто дисертантом було визначено програму досліджень, проведено патентно-ліцензійний пошук, пошук і реферування джерел літератури, здійснено експерименти, обрані для дослідження, отримано показники, проведено їх статистичну обробку. Аналіз та інтерпретацію результатів дослідження здійснено разом із науковим керівником. Розроблено методику визначення параметрів рецепторного зв'язування нейроактивних амінокислот у співавторстві з к.б.н. Л.Д. Поповою, що підтверджується спільними публікаціями.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи були оприлюднені на науково-практичній конференції “Региональные проблемы охраны здоровья населения центрального Черноземья” (м. Бєлгород, 2000), міжна-родній науково-технічній конференції “Экология и здоровье человека. Охрана вод-ного и воздушного бассейнов. Утилизация отходов” (м. Щелкіно, АР Крим, 2000, 2005; м. Бердянськ, 2003, 2004), науково-практичній конференції “Гигиенические проблемы охраны здоровья населения” (м. Самара, 2000), науковій конференції “Научное наследие академика И.Н. Буланкина и его развитие в современной биохи-мии” (м. Харків, 2001), на VIII Українському біохімічному з'їзді (м. Чернівці, 2002).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 14 наукових робіт, з них 5 - у фахових виданнях, одержано патент на винахід, який занесено до реєстру галузевих нововведень МОЗ України.

Структура й обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, чотирьох розділів результатів досліджень та їх обговорення, наукового аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків, списку використаних джерел, додатків. Робота викладена на 140 сторінках машинописного тексту, ілюстрована 29 таблицями і 20 рисунками. Список використаних джерел містить 291 роботу, з яких іншомовних - 74 (25%), посилань 2000-2005 рр. - 52 (18%).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. Огляд літератури складається з двох підрозділів, у яких наведено аналіз наукової літератури щодо сучасних уявлень про біохімічні механізми дії ксенобіотиків в організмі теплокровних тварин та узагальнено основні відомості щодо особливостей біологічної дії різних груп синтетичних детергентів, до яких належать досліджувані нонілбензоли.

Матеріали та методи досліджень. Виходячи з особливостей фізико-хімічних властивостей досліджуваної групи речовин, зокрема наявності гідрофільних і гід-рофобних груп у молекулах, відносно низької молекулярної маси, здатності до хі-мічних перетворень з утворенням активно діючих сполук, було висунуто припущен-ня про мембранотропні ефекти нонілбензолів в організмі тварин як центральну лан-ку їхньої біологічної дії. Досліджувані речовини належать до іоногенних азото-вмісних детергентів. У роботі використано хімічно чисті зразки сполук, синтезовані та надані НВО “Синтез ПАВ” (м. Шебекіно, Росія). Згідно з метою та задачами дослідження, доцільним було проведення короткочасних і тривалих експериментів на статевозрілих щурах-самцях популяції Wistar масою 200-210 г. Тварин піддавали пероральній затравці за допомогою зонда водними розчинами речовин одноразово у діапазоні доз 100-5000 мг/кг маси у випадку короткочасного експерименту та щоденно протягом 30 діб у дозах 1/10, 1/100 і 1/1000 ДЛ₅₀ у випадку тривалого. Тваринам контрольної групи вводили відповідні об'єми води. Дослідження біохімічних параметрів здійснювали на 30-ту добу після початку експерименту, а для деяких - ще й на 15-ту добу у крові, яку відбирали з під'язикової вени. Програма досліджень розроблялася відповідно до діючих загальноприйнятих методів щодо вивчення механізмів біологічної дії ксенобіотиків і містила вивчення стану системи мікросомального окиснення, оксидантно-антиоксидантного гомеостазу, біомембран клітин, процесів нейрогуморальної регуляції. Для реалізації поставленої програми спочатку було проведено експерименти для визначення параметрів токсичності, кумулятивності, морфологічних змін в органах і тканинах за дії нонілбензолів.

Картину гострого отруєння вивчали згідно з методичними рекомендаціями [Елизаровa О.Н., 1971]. Розрахунок середньолетальних доз (ДЛ₅₀) здійснювали загальноприйнятими токсикологічними методами [Красовский Г.Н., 1982]. У подальших експериментах вони були підставою для розрахунку кількості речовин, необхідної для введення в організм. Кумулятивні властивості речовин вивчали за [Lim R.K. et al, 1961]. Морфофункціональні дослідження стану внутрішніх органів проводили загальноприйнятими методами за консультативної допомоги професора кафедри гістології, цитології та ембріології ХДМУ, к.мед.н. О.В.Мірошниченко.

Стан монооксигеназної системи гепатоцитів оцінювали за дихальною й фермен-тативною активністю, вмістом цитохрому Р-450. Мембрани ендоплазматичного ре-тикулума виділяли за [Komoth S.A., Narayn K.A., 1972] у модифікації [Лемешко В.В., 1980]. Вміст білка визначали за методом [Lowry O.H. et al., 1951]. Споживання кисню суспензією мікросом реєстрували за допомогою закритого платинового елек-троду Кларка; швидкість окиснення НАДФН₂ визначали флюориметричним мето-дом при довжині хвилі збудження 366 нм, флюоресценції - 420 нм; НАД(Ф)Н-цито-хром с-редуктазну активність - спектрофотометричним методом при 550 нм [Оре-хович В.Н., 1977]. Кількісне визначення цитохрому Р-450 проводили методом дифе-ренційної спектрофотометрії за допомогою двопроменевого реєструючого спектро-фотометра “Specord UV VIS” [Omura Т., Sato R., 1964; Орехович В.Н., 1977]. Швид-кість реакції окислювального деметилювання, субстратом якої був ксенобіотик р-нітроанізол, визначали спектрофотометрично за вмістом р-нітрофенолу при 436 нм.

Стан вільнорадикального перекисного окиснення ліпідів оцінювали за вмістом дієнових кон'югатів [Каухин А.Б., Ахметова Б.С., 1987] і малонового діальдегіду [Федорова Т.Н. и соавт., 1983] у сироватці крові спектрофотометричними метода-ми, а також за інтенсивністю хемілюмінесценції сироватки крові та сечі, яку реєст-рували на медичному хемілюмінометрі ХЛМЦ1-01 відповідно до загальноприйня-тих методик [Владимиров Ю.А. и соавт., 1976; Красовский Г.Н. и соавт., 1989]. Стан вільнорадикальних процесів оцінювали також за вмістом у крові метгемоглобіну ко-лориметричним ціанідним методом [Кушаковский М.С., 1968], нітритів за допомогою кольорової реакції з реактивом Грисса спектрофотометричним методом при 560 нм [Кіселик І.О. та співавт., 2001], аргініну та цитруліну методом іоно-обмінної хроматографії на автоматичному аналізаторі амінокислот ААА-339 (Чехо-словаччина) [Moncada S., Higgs E.A., 1990], за активністю НАДФН-діафорази печінки гістохімічним методом за реакцією відновлення нітросинього тетразолію [Hope B.T. et al., 1991). Оцінку окислювальних модифікацій білків крові проводили спектрофотометричним методом за вмістом 2,4-динітрофенілгідразонів при 370 нм [Дубинина Е.Е. и соавт., 1995]. Стан антиоксидантної системи еритроцитів оціню-вали за активністю глутатіонпероксидази [Моин В.М., 1986] та супероксиддисму-тази [Гуревич В.С., Конторидинова К.Н., 1990], сироватки крові - за активністю церулоплазміну [Мошков К.А. и соавт., 1986]. У гемолізатах крові визначали активність каталази й пероксидази [Дубинина Е.Е. и соавт., 1988; Лошинский А.В. и соавт., 1991] та вміст відновленого глутатіону і сульфгідрильних груп [Кочетов Т.А., 1980]. Вміст гемоглобіну у гемолізаті визначали спектрофотометричним методом [Harboe M.A.,1959].

При визначенні фосфоліпідних фракцій у гомогенатах печінки та мембранах еритроцитів проводили екстракцію ліпідів [Кейтс М., 1975], випаровування екстрак-тів, розділення на фракції методом двохмірної мікротонкошарової хроматографії [Vashovsky V.E., Terekkive T.A., 1979], ідентифікацію за стандартними розчинами речовин. Кількісний вміст загальних та індивідуальних фосфоліпідів в екстрактах оцінювали за кількістю неорганічного фосфору [Brockhuse R.M., 1974]. Активність Na, K-АТФ-ази плазматичних мембран гепатоцитів визначали загальноприйнятим методом [Мешкова Н.П., Северин С.Е., 1979]. Плазматичні мембрани одержували методом диференційного центрифугування в градієнті щільності сахарози [Орехович В.Н., 1977]. Вміст білка визначали за методом [Lowry O.H. et al., 1951].

Активність рецепторних мембранозв'язаних комплексів у синаптосомах нео-кортекса головного мозку тварин визначали радіоізотопними методами за парамет-рами зв'язування - константою дисоціації (Кд) і максимальною кількістю місць зв'я-зування (Вmax) селективних лігандів ₁-адренорецепторів-³Н-WB4101[U'Prichard D. et al., 1977], -адренорецепторів - ³Н-дигідроалпренололу [Bylund D.B., Snyder S.H., 1979], Д₂-дофамінорецепторів - ³Н-спіперону [Theodoron A.E. et al., 1980], 5-НТ₁-се-ротонінорецепторів - ³Н-серотоніну і 5-НТ₂-серотонінорецепторів - ³Н-спіперону [Peroutka S.J., Snyder S.H., 1979]. Опрацювання результатів проводили з використан-ням графіків Скетчарда [Scatchard G., 1949]. Визначення параметрів зв'язування глу-тамату, аспартату, гліцину у синаптосомах головного мозку проводили за допомо-гою розробленого методу флюоресцентних зондів [Попова Л.Д., Стеценко С.А., 1999] з використанням теоретичних підходів і практичних розробок [Владимиров Ю.А., Добрецов Г.Е., 1989; Дамбинова С.А., 1989]. У ролі флюoресцентних зондів використовували МБА і АНС, включення яких у мембрану супроводжується істот-ним підвищенням виходу флюоресценції, більша частина якої належить зв'язаному зонду. Параметри зв'язування визначали на підставі даних флюоресценції, які вимі-рювали на спектрофлюориметрі MPF-4А фірми “Хітачі” (Японія). Константу зв'язу-вання визначали методом подвійних зворотних коoрдинат. Для визначення Вmax проводили вимірювання флюоресценції при двох різних концентраціях мембран та однаковій концентрації медіатора [Добрецов Г.Е., 1989]. Синаптосоми одержували за методом [Hajos F., 1975]. Білок визначали методом [Lowry O.H. et al., 1951].

Вміст моноамінів та їхніх попередників у гомогенатах головного мозку ви-значали на спектрофлюориметрі MPF-4А [Endo J., Ogura J., 1973] з використанням карбоксиметилцелюлози фірми “Reanal”. Вміст норадреналіну та дофаміну визначали після окиснення катехоламінів [Schlupt M. et al., 1998].

Для перевірки гіпотез щодо рівності генеральних середніх двох незалежних, незв'язаних вибірок використовували t-критерій Стьюдента з попередньою перевіркою нормальності розподілу варіант [Лакин Г.Ф., 1980].

Основні результати та їх обговорення

Оцінка біологічної активності нонілбензолів за умов короткочасного та тривалого перорального надходження до організму щурів. Одноразове введення нонілбензолів проводили з використанням діапазону доз 100-5000 мг/кг маси, який обирався таким чином, щоб визначити дозу летальності в інтервалі ДЛ₀-ДЛ₁₀₀ [Ели-зарова О.Н., 1971]. Спостереження за тваринами здійснювали протягом 15 діб. Од-норазове введення речовин у першу добу приводило щурів до збудження, яке поступово переходило в апатію та кволість з істотним зниженням реакції на звукові й больові подразники. Загибель тварин спостерігали в перші три доби. При морфо-логічному дослідженні визначали повнокров'я внутрішніх органів, здуття шлунку, тонкого й товстого кишечнику. На 15-ту добу тварин, що залишилися живими, забивали декапітацією. Патоморфологічне дослідження внутрішніх органів виявило порушення гемодинаміки у головному мозку, печінці, нирках, селезінці, серці та паренхіматозну дистрофію органів. У картині гострого отруєння переважали симптоми порушення центральної нервової, серцево-судинної та дихальної систем. При проведенні короткочасного досліду реєстрували час загибелі тварин і кількість уведеної речовини, на підставі чого знаходили ДЛ₅₀ [Красовский Г.Н., 1982].

У тривалих експериментах розрахунок необхідної для введення кількості речовин проводили, виходячи з ДЛ₅₀, які складали для: ФОМ 9 - 520 мг/кг, неонолів ФОМ 9-4 - 1040 мг/кг, ФОМ 9-12 - 1160 мг/кг, ФОМ 9-20 - 2020 мг/кг маси тварини. На підставі цього речовини відносяться до помірно токсичних (3 клас небезпеки) [Беспамятнов Г.П., Кротов Ю.А., 1985]. Нонілбензоли вводили у дозах із розрахунку 1/10, 1/100 і 1/1000 ДЛ₅₀, що складало відповідно для ФОМ 9 - 52,0; 5,2 і 0,52 мг/кг; неонолу ФОМ 9-4 - 104,0; 10,4 і 1,04 мг/кг; неонолу ФОМ 9-12 - 116,0; 11,6 і 1,16 мг/кг; неонолу ФОМ 9-20 - 202,0; 20,2 і 2,02 мг/кг маси.

На 30-ту добу впливу нонілбензоли у 1/10 і 1/100 ДЛ₅₀ мали виразні (ФОМ 9 і неонол ФОМ 9-4) і слабкі (неоноли ФОМ 9-12 і ФОМ 9-20) кумулятивні власти-вості. Доза 1/1000 ДЛ₅₀ не давала ефекту кумуляції. Мікроскопічні дослідження внутрішніх органів за дії речовин у 1/10 і 1/100 ДЛ₅₀ показали наявність деструктивних і дистрофічних змін клітинних органел, що відрізнялися лише ступенем виразності. В основі деструктивних порушень полягали зміни структури, насамперед, мітохондрій, що супроводжувалися частковим лізисом крист і зовніш-ніх мембран. Гістохімічно відзначали знижений вміст білка та відсутність глікогену у цитоплазмі. Найбільші зміни спостерігали у печінці та головному мозку, тканини яких у подальших експериментах були основними біосубстратами. Отримані резуль-тати тлумачили як показники попередньої оцінки біологічної активності сполук.

Стан оксидантно-антиоксидантного гомеостазу в організмі щурів за умов тривалого перорального надходження нонілбензолів. Тривалий вплив 1/100 ДЛ₅₀ нонілбензолів на організм щурів призводив до активації монооксигеназної системи гепатоцитів, яка є істотним джерелом утворення активних форм кисню і причиною підвищення процесів вільнорадикального окиснення (ВРО) та перекисного окиснен-ня ліпідів (ПОЛ) [Warner M., Gustafsson J.A., 1994]. Про це свідчило збільшення спо-живання кисню мікросомами в середньому на 102% і 135%, зростання швидкості окиснення НАДФН₂ на 85% і 98%, підвищення вмісту цитохромів Р-450 на 55% і 75%, деметилазної на 73% і 142% та НАД(Ф)Н-цитохром с-редуктазної активності на 15 і 30-ту добу відповідно, порівняно з контрольною групою тварин (табл. 1). Інтенсифікацію мікросомального окиснення детергентів-нонілбензолів розглядали як пусковий механізм у зміні стану оксидантно-антиоксидантного гомеостазу.

Тривале надходження нонілбензолів до організму супроводжувалося посилен-ням окислювального метаболізму, підвищенням продукції активних форм кисню, активацією процесів ПОЛ й окислювальних модифікацій білків, здатних подолати бар'єр антиоксидантного захисту. Так, нонілбензоли призводили, порівняно з конт-ролем, до накопичення в сироватці крові продуктів ПОЛ- дієнових кон'югатів (ДК), малонового діальдегіду (МДА) (табл. 2), до підвищення інтенсивності хемілюмінес-ценції (ХЛ) сироватки крові й сечі. Інтенсивність ХЛ у тварин, яким уводили 1/10 і 1/100 ДЛ₅₀ речовин, збільшувалася на 15 та 30-ту добу експерименту. Характер хемілюмінограм свідчив про накопичення гідроперекисів, перекисів, а паралельно з ними ДК та МДА, що призводить до виснаження антиоксидантної системи.

Таблиця 1 Показники активності монооксигеназної системи гепатоцитів щурів за умов впливу нонілбензолів (Mm, n=10, 30-а доба)

Примітки: ^a - нмоль О₂/хвмг білка; ^b - нмоль НАДФН₂/хвмг білка; ^c - нмоль/мг білка; ^d - нмоль р-нітрофенолу/хвмг білка; ^e- нмоль цитохрому с/хвмг білка; * - р<0,05 відносно контролю

Таблиця 2 Вміст дієнових кон'югатів і малонового діальдегіду в сироватці крові щурів за умов впливу нонілбензолів (Мm, n=10)

Примітки: вміст виражений в мкмоль/л; * - р<0,05 відносно контролю

Відомо, що активні форми кисню можуть викликати окислювальну деструкцію не тільки ліпідів, але й білків [Кличханов Н.К. и соавт., 2001; Бєленічев І.Ф. та співавт., 2002]. Нонілбензоли виявили здатність істотно підвищувати вміст карбонільних груп окисно-модифікованих білків сироватки крові (рис. 1).

Рис. 1. Вміст карбонільних груп окисно-модифікованих білків у сироватці крові щурів за умов впливу нонілбензолів у дозі 1/100 ДЛ₅₀ (Мm, n=6) Примітка: * - р<0,05 відносно контролю

На 15 і 30-ту добу відзначали зниження активності ферментів антирадикаль-ного захисту - каталази (на 23% і 44%) та пероксидази (на 17% і 45%) крові, а також ферменту антиоксидантної глутатіонзалежної системи глутатіонпероксидази еритроцитів (на 31%) (табл. 3). Дана тенденція спостерігалася й у відношенні вмісту глутатіону та SH-груп білків крові, що, можливо, пов'язано з їх окисненням та перетворенням на дисульфідні сполуки. На 15-ту добу експерименту активність супероксиддисмутази еритроцитів і церулоплазміну сироватки крові підвищувалась, порівняно з контролем, а на 30-ту - активність супероксиддисмутази мала тенденцію до зниження (на 37%), а церулоплазміну - до підвищення (на 30%), що можна розглядати як адаптивну реакцію на несприятливий вплив нонілбензолів (табл. 3).

Таблиця 3 Активність церулоплазміну сироватки крові, супероксиддисмутази та глутатіонпероксидази еритроцитів щурів за умов впливу нонілбензолів (Мm, n=6-10)

Примітки: ^a - мкмоль/л; ^{b, c} - ммоль/хвг Hb; * - р<0,05 відносно контролю

Окремий ряд експериментів свідчив про реалізацію ефектів нонілбензолів че-рез інтенсифікацію продукції оксиду азоту (NO), який має пряме відношення до процесів генерації активних форм кисню. Збільшення кількості NO й супероксид-аніону супроводжується посиленням утворення медіатора окислювального клітин-ного пошкодження - пероксинітриту, здатного пошкоджувати білки, ліпіди клітин-них мембран, порушувати біоенергетичні процеси [Moncada S. et al., 1991; Жлоба А.А., 2000]. Оцінку стану процесів, пов'язаних з метаболізмом NO, проводили за допомогою непрямих методів. Речовини у 1/10 і 1/100 ДЛ₅₀ на 30-ту добу дії призводили до підвищення вмісту цитруліну і зниження - аргініну в плазмі крові щурів (рис. 2), що може свідчити про інтенсифікацію перетворення аргініну на цитрулін і про можливе підвищення активності NO-синтази. Однак, необхідно враховувати також наявність інших шляхів метаболізму аргініну і цитруліну, не пов'язаних з NO-синтазною активністю. Спостерігали також істотне підвищення у піддослідних тварин, порівняно з контролем, вмісту метгемоглобіну крові (на 94% доза 1/10 ДЛ₅₀, на 87,5% доза 1/100 ДЛ₅₀), нітритів сироватці крові як на 15-ту (на 89%), так і на 30-ту добу (на 187%) (рис. 2), активності НАДФН-діафорази печінки.

Рис. 2. Вміст цитруліну, аргініну та нітритів у сироватці крові щурів за умов впливу нонілбензолів у дозі 1/100 ДЛ₅₀ (Мm, n=6)

Примітка: * - р<0,05 відносно контролю

Відомо, що NO є активатором розчинної форми гуанілатциклази (ГЦ), ферменту утворення цГМФ, через який реалізуються численні фізіологічні та патологічні ефекти оксиду азоту [Северина И.С., 1998]. Спостерігали підвищення в печінці активності ГЦ й фосфодіестерази циклічних нуклеотидів, що також може свідчити про стимуляцію процесів, пов'язаних з оксидом азоту.

Таким чином, підвищення активності системи біотрансформації, посилення утворення активних форм кисню та азоту, зсув оксидантно-антиоксидантної рівно-ваги у бік оксидантів разом із активацією процесів, пов'язаних з метаболізмом NO, за тривалого впливу нонілбензолів призводить до розвитку окислювального стресу, що є одним з провідних ефектів цих сполук в організмі теплокровних тварин.

Стан біологічних мембран клітин за умов тривалого перорального надход-ження нонілбензолів до організму щурів. Окислювальний стрес, що розвивається в організмі за дії нонілбензолів, здатний викликати істотні зміни у фосфоліпідному складі мембран. На 30-ту добу дії 1/100 ДЛ₅₀ речовин у фосфоліпідних фракціях мембран еритроцитів щурів визначали підвищення рівня сфінгомієліну (СМ) (в середньому на 34%), лізофосфатидилхоліну (ЛФХ) (на 81%) без змін рівнів фосфатидилетаноламіну (ФЕА), фосфатидилхоліну (ФХ) та фосфатидилсерину (ФС). Для печінки спостерігали зменшення рівня СМ (на 32%), фосфатидиліно-зитолу (ФІ) (на 53%) та істотне підвищення лізоформ фосфоліпідів - ЛФХ і лізофосфатидилетаноламіну (ЛФЕА) (табл. 4). Виявлені зміни можуть бути причи-ною дестабілізації та дезінтеграції біомембран у результаті безпосереднього впливу детергентів-солюбілізаторів, а також наслідком інтенсифікації процесів ВРО і ПОЛ.

Таблиця 4 Вміст фосфоліпідних фракцій в печінці щурів за умов впливу нонілбензолів (Mm, n=10)

Примітки: вміст виражений у % від загальної кількості фосфоліпідів; * - р<0,05 відносно контролю

Про порушення структури мембран клітин організму свідчили також проведені раніше електронномікроскопічні дослідження.

Тривала дія нонілбензолів у 1/100 ДЛ₅₀ призводила до зміни активності рецеп-торних мембранозв'язаних комплексів неокортекса головного мозку піддослідних тварин, порівняно з контролем. При аналізі зв'язування селективних лігандів ₁-, ₁-адрено-; 5-НТ₂-серотоніно- й Д₂-дофамінорецепторів виявлено наявність високо- та низькоафінного пулів. Функціональні властивості ₁-адренорецепторів характери-зувалися підвищенням спорідненості обох пулів рецепторів і зниженням кількості місць зв'язування (табл. 5), а ₁-рецепторів - збільшенням кількості. Речовини прак-тично не чинили впливу на кінетичні характеристики 5-НТ₁-рецепторів, а ефекти на 5-НТ₂-рецептори були неоднозначними, відрізнялися зниженням спорідненості та кількості місць зв'язування. Нонілбензоли знижували спорідненість і збільшували кількість місць зв'язування обох пулів Д₂-рецепторів. Отримані результати свідчать про можливий вплив нонілбензолів на конформаційний стан глікопротеїнових ре-цепторних молекул, що може реалізуватися через зміни у фосфоліпідному оточенні, а також через ефекти солюбілізації, інтерналізації рецепторних комплексів.

Таблиця 5 Параметри зв'язування ³Н-WB 4101 ₁-адренорецепторами неокортекса щурів за умов впливу нонілбензолів (Mm, n=6)

Примітки: ^a - нМ; ^b - фмоль/мг білка; * - р<0,05 відносно контролю

Тривала дія нонілбензолів призводила до активації глутаматних рецепторів у головному мозку щурів, що також може бути одним із пускових механізмів генерації вільних радикалів, причиною розвитку окислювального стресу, синтезу NO [Копаниця М.В., 1997; Комиссаров И.В. и соавт., 2003]. На 30-ту добу впливу ФОМ 9 у 1/100 ДЛ₅₀ при використанні зондів МБА і АНС спостерігали зростання спорідненості рецепторів до глутамату у лімбічній корі (на 46%), гіпокампі (на 48%) та істотне зниження у гіпоталамусі (у 5 разів), порівняно з контролем, а також зниження Вmax для глутамату у гіпокампі, гіпоталамусі (зонд МБА) і підвищення у корі, гіпоталамусі (зонд АНС). Спорідненість рецепторів до аспартату у цих тварин зростала у гіпокампі (на 40,5%), гіпоталамусі (на 40%), мозочку (на 52%) і знижувалась у лімбічній корі (на 62%). Такої односпрямованості у відношенні Вmax виявлено не було. При визначенні Кд гліцину спостерігали зниження у корі (на 46%) та істотне підвищення у гіпокампі (у 4 рази).

На 30-ту добу дії нонілбензолів визначали зниження базальної активності аде-нілатциклази (АЦ) синаптосом неокортекса піддослідних тварин в середньому на 50,5%. Індукована ізопротеренолом активність АЦ контрольних тварин підвищувалася лише на 8%. Ізопротеренол не виявляв стимулюючого впливу на АЦ піддослідних тварин, порівняно з рівнем базальної активності. Тривала дія нонілбензолів призводила також до зниження активності Na, K-АТФ-ази мембран гепатоцитів у середньому на 34%, що може бути причиною виникнення катіонного дисбалансу, гіпоксичного пошкодження тканин організму щурів. Вплив нонілбензолів на стан біомембран клітин організму експериментальних тварин може бути як безпосереднім, так і опосередкованим через вплив на фосфоліпідне оточення ферментних і рецепторних молекул. Зміни нейротрансмітерних процесів є результатом мембранотропних ефектів досліджуваних сполук та активації процесів ВРО в організмі, а також механізмом реалізації їхньої токсичної дії.

Стан процесів нейрогуморальної регуляції в організмі щурів за умов тривалого перорального надходження нонілбензолів. Активні форми кисню, перекисне окиснення ліпідів, білків, активація процесів, пов'язаних з NO, з позиції адаптаційної відповіді виконують роль первинних і вторинних медіаторів стресу, стимуляторів адаптаційних змін [Барабой В.А., Сутковой Д.А., 1997; Саприн А.Н., Калинина Е.В., 1999]. Нонілбензоли викликали істотну напругу адаптаційних і ком-пенсаторних механізмів: зміну стану моноамінергічних нейромедіаторних систем, систем вторинних месенджерів - аденілатциклазної та гуанілатциклазної. У головно-му мозку піддослідних тварин дія 1/100 ДЛ₅₀ речовин призводила до підвищення вмісту дофаміну (на 62%), норадреналіну (на 216%), серотоніну (на 114%), порівня-но з контролем (табл. 6). Для печінки характерним було зниження ДОФА (на 36%) і підвищення норадреналіну (на 324%), триптофану (на 53%) (табл. 6). Посилення синтезу катехол- та індоламінів може бути проявом, по-перше, окислювального ток-сичного стресу як обов'язкового компонента відповідної реакції організму на дію хі-мічних агентів, по-друге, превалюванням катаболічних процесів над анаболічними.

Таблиця 6 Вміст моноамінів та їхніх попередників у головному мозку та печінці щурів за умов впливу нонілбензолів (Mm, n=6)

Примітки: вміст виражений в нмоль/г тканини, * - р<0,05 відносно контролю

Відзначали, порівняно з контролем, зниження активності АЦ і вмісту цАМФ (на 38% доза 1/100 ДЛ₅₀) у неокортексі щурів і підвищення гуанілатциклази (ГЦ) (на 139%) і вмісту цГМФ (на 81%) на тлі збільшення активності фосфодіестерази (на 105%), що інактивує циклічні нуклеотиди (табл. 7). Нонілбензоли сприяли активації гуанілатциклазної та гальмуванню аденілатциклазної систем через зміну активності рецепторів, спряжених з циклазними системами. Це може бути однією з причин дисгомеостатичного характеру впливу на організм. Відомо, що активаторами ГЦ можуть бути ліпоперекиси, вільні радикали, посилене утворення яких спостерігалося у відповідь на тривалий вплив нонілбензолів. Зниження активності АЦ і підвищення ГЦ є наслідком мембранотропних ефектів цих сполук.

Таблиця 7 Вміст циклічних нуклеотидів, активність аденілатциклази та гуанілатциклази у мембранній фракції неокортекса головного мозку щурів за умов впливу нонілбензолів (Mm, n=6)

Примітки: ^a - пмоль цАМФ/хвмг білка; ^c - пмоль цГМФ/хвмг білка; ^b,d - пмоль/мг білка; * - р<0,05 відносно контролю

Узагальнюючи результати даного дослідження, проведеного з метою встановлення механізмів біологічної дії нової групи ксенобіотиків - нонілбензолів, перш за все слід відзначити, що досліджуваним речовинам притаманний виразний політропний характер впливу на організм щурів. Провідними ефектами нонілбен-золів в організмі є мембранотропні, які можуть бути наслідком безпосереднього контакту детергентів з мембранами, а також - ініціації та інтенсифікації процесів перекисного окиснення ліпідів, окислювальних модифікацій білків, активації про-цесів, пов'язаних з метаболізмом оксиду азоту. Вплив нонілбензолів на біологічні мембрани може призводити до солюбілізації компонентів біомембран, порушення міжмолекулярних взаємодій у мембранах, змін властивостей ферментних та рецепторних мембранозв'язаних комплексів. Це, у свою чергу, є причиною виникнення істотних структурно-функціональних змін у клітинах організму щурів.

Провідною ланкою механізму дії нонілбензолів за умов тривалого перорального надходження до організму щурів є розвиток окислювального стресу. Підтверджен-ням цього стали: активація монооксигеназної системи гепатоцитів як одного з ос-новних генераторів активних форм кисню, зокрема супероксидного аніону; інтенси-фікація продукції оксиду азоту, як одного з джерел утворення вільних радикалів і факторів модифікації білків; активація процесів перекисного окиснення ліпідів, окислювальних модифікацій білків; напруга окремих ланок антиоксидантної систе-ми з наступним її виснаженням; зміна фосфоліпідного складу біомембран (збіль-шення лізоформ фосфоліпідів), активності рецепторних і ферментних мембрано-зв'язаних комплексів; активація глутаматних рецепторів у головному мозку як одна з причин продукції вільних радикалів за рахунок кальцій-залежної ініціації каскаду арахідонової кислоти, синтезу оксиду азоту; істотна напруга адаптаційних і ком-пенсаторних механізмів: зміни стану моноамінергічних нейромедіаторних систем, систем вторинних месенджерів - аденілатциклазної та гуанілатциклазної. Зазначе-ний характер дії дозволяє говорити про розвиток дисгомеостатичних ефектів ноніл-бензолів, що призводить до негативних наслідків функціонування систем організму.

ВИСНОВКИ

У результаті проведених експериментів встановлено особливості біологічної дії нової групи азотовмісних детергентів - нонілбензолів, які мають істотне значення для ксенобіохімії в ролі базової теоретичної основи для вирішення наукового завдання: розкриття механізмів біологічної дії нових груп ксенобіотиків з метою обґрунтування та створення наукової бази для розроблення медико-біологічних і профілактичних заходів щодо захисту здоров'я населення та навколишнього середовища від несприятливого впливу хімічних сполук.

1. Механізми біологічної дії групи ксенобіотиків - нонілбензолів: фенольної основи Манніха (ФОМ 9) та її оксиетильованих похідних неонолів ФОМ 9-4, ФОМ 9-12, ФОМ 9-20 - полягають у мембраноушкоджуючій та політропній дії, зу-мовленій впливом на фізико-хімічні властивості біомембран за участю загальних не-специфічних механізмів - посилення генерації вільних радикалів, зокрема активних форм кисню, активації перекисного окиснення ліпідів, окислювальних модифікацій білків, процесів, пов'язаних з метаболізмом оксиду азоту, на тлі зниження антиокси-дантної активності. Визначено, що основною патогенетичною ланкою мембранотро-пного механізму дії нонілбензолів є окислювальний стрес, який призводить до пору-шення стану систем нейрогуморальної регуляції та внутрішньоклітинних процесів.

2. Картина гострого отруєння організму щурів нонілбензолами характери-зується перевагою симптомів порушення центральної нервової, серцево-судинної та дихальної систем. Морфологічна картина внутрішніх органів виявляє дистрофічні та деструктивні зміни у мембранах структурно-функціональних одиниць, особливо вираженими у печінці та головному мозку.

3. Нонілбензоли сприяють активації монооксигеназної системи гепатоцитів як пускового механізму у зміні стану оксидантно-антиоксидантного гомеостазу, про що свідчить збільшення дихальної, ферментативної, деметилазної активності мікро-сом, а також вмісту цитохрому Р-450.

4. Нонілбензоли є істотними чинниками ініціації та інтенсифікації процесів пе-рекисного окиснення ліпідів (підвищують вміст дієнових кон'югатів і малонового діальдегіду, інтенсивність біохемілюмінесценції), окислювальних модифікацій біл-ків (підвищують вміст карбонільних груп), процесів, пов'язаних з метаболізмом ок-сиду азоту (підвищують активність НАДФН-діафорази, гуанілатциклази, вміст нітритів, метгемоглобіну, цитруліну, цГМФ на тлі зниження аргініну), що супроводжується виснаженням систем антирадикального й антиперекисного захисту (знижують активність каталази, пероксидази, супероксиддисмутази, глутатіонперок-сидази, вміст відновленого глутатіону та сульфгідрильних груп на тлі збільшення активності церулоплазміну) та розвитком окислювального стресу.

5. Для біологічної дії нонілбензолів характерним є зміна фосфоліпідного складу біомембран (підвищення вмісту лізоформ), зміна активності мембранозв'язаних ферментних (аденілатциклази; Na, K-АТФ-ази) і кінетичних властивостей рецептор-них (₁-, ₁-адрено-, 5-НТ₁-, 5-НТ₂-серотоніно-, Д₂-дофамінових) комплексів.

6. Нонілбензоли стимулюють синтез катехоламінів та індоламінів у печінці та головному мозку, змінюють спорідненість і кількість мембранних моноамінер-гічних рецепторів і рецепторів нейроактивних амінокислот (глутамату, аспартату, гліцину), призводять до активації гуанілатциклази та фосфодіестерази циклічних нуклеотидів, інгібування аденілатциклази, зниження вмісту цАМФ і підвищення цГМФ у головному мозку.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1.Биологическая активность детергентов - производных нонилбензолов в связи с проблемой охраны водных объектов / В.И. Жуков, С.А. Стеценко, В.И. Пивень и др. - Белгород: Белвитамины, 2000. - 237 с. (С.О.Стеценко взяла участь у написанні розділів 2, 3, 5).

2.Стеценко С.А. Влияние группы азотсодержащих поверхностно-активных ве-ществ на систему микросомального окисления // Експер. і клін. медицина. - 2001. - № 1. - С. 28-30.

3.Попова Л.Д., Стеценко С.А. Оценка стабильности биологических мембран ме-тодом хемилюминесценции // Проблемы криобиологии. - 2001. - № 4. - С. 3-7. (Стеценко С.О. особисто отримала всі наведені в статті експериментальні дані щодо дії в організмі щурів нонілбензолів).

4.Стеценко С.А. Стан оксидантно-антиоксидантної системи організму білих щурів за умов впливу деяких азотовмісних детергентів // Вісник проблем біології і медицини. - 2002. - Вип. 11-12. - С. 16-19.

5.Стеценко С.А. Влияние группы азотсодержащих ПАВ на систему циклических нуклеотидов в коре головного мозга крыс // Гигиена населенных мест.- Киев: УНГЦ, 2000. - Вып. 37. - С. 216-218.

6.Стеценко С.О. Стан моноамінергічних та глюкокортикоїдних рецепторів нео-кортексу білих щурів за умов впливу азотовмісних детергентів // Актуальные проблемы медицины и биологии. - Киев: НМУ, 2002. - № 2. - С. 314-317.

7.Стеценко С.О. Система нейромедіаторних амінокислот за умов впливу ноніл-бензолів // Гигиена населенных мест. - Киев, 2004. - Вып. 44. - С. 631-636.

8.Стеценко С.А. Параметры токсичности и кумулятивные свойства группы азот-содержащих поверхностно-активных веществ // Матер. научно-техн. конф. ”Экология и здоровье человека. Охрана водного и воздушного бассейнов”. - Щелкино АР Крым, 2000. - Т.1. - С. 143-144.

9.Стеценко С.А. Влияние азотсодержащих поверхностно-активных веществ на фосфолипидный состав мембран // Матер. научно-практ. конф. „Региональные пробл. охр. здоровья населения центрального Черноземья”. - Белгород, 2000. - С. 609-613.