Вплив хлоридів кобальту і меркурію на пероксидне окислення ліпідів, систему тіолів та активність глутатіонзалежних антиоксидантних ферментів

Вплив сублетальної дози хлориду кобальту на динаміку адаптації до оксидативного стресу за умов блокади пропранололом в-адренорецепторів. Роль відновленого глутатіону в адаптації до пошкоджуючих ефектів хлориду кобальту у печінці та нирках щурів.

Рубрика Химия
Вид автореферат
Язык украинский
Дата добавления 28.07.2014
Размер файла 49,6 K

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Вплив хлоридів кобальту і меркурію на пероксидне окислення ліпідів, систему тіолів та активність глутатіонзалежних антиоксидантних ферментів

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Наразі сформувалось уявлення про оксидативний стрес, як про становище напруження, що обумовлене надмірною генерацією вільнорадикальних станів інертних молекул, насамперед оксигену, активовані форми якого (АФО) викликають порушення метаболічних процесів та руйнування клітинних структур [Саприн А.Н., 1999, Betteridge D.J., 2000, McCord J.M., 2000]. Реакційна агресивність АФО стримується в організмі потужною багаторівневою антиоксидантною системою (АОС) [Gutteridge J.M., 2000, Knight J.A., 2000]. Належить підкреслити, що основні АФО у нормі постають компонентами клітинного метаболізму та виконують біорегуляторні функції [Воейков В.Л., 2003, Гольдштейн Н.Н., 2002]. За умов оксидативного стресу прооксиданти порушують рівновагу сполученої системи генерації вільних радикалів, що обумовлює формування адаптивної відповіді на рівні активації антирадикального захисту організму [Bergendi L., 1999, Пасечник И.Н., 2001]. Відомо, що провідна роль в аварійному захисті від «оксигенової небезпеки» належить відновленому глутатіону і пов'язаній з ним системі антиоксидантних (АО) ферментів: глутатіонпероксидазі (ГП), глутатіонредуктазі (ГР) та глутатіонтрансферазі (ГТ) на клітинному рівні [Кулинский В.Н., 1990] та глутатіон-обумовленим механізмам формування гіпоксичного стану на рівні гомеостазу організму в цілому [Скулачев В.П., 2001]. Система внутрішньоклітинних тіолів відіграє роль зв'язуючого кільця у підтриманні рівноваги АФО АОС. Взагалі, вплив стресорів на організм розглядають у якості екзогенного індуктора розвитку. Проте, поширення техносфери викликає надходження до організму надмірної кількості речовин із прооксидантними властивостями і важкі метали не є винятком [Рудько Г.И., 2002]. Останні здатні викликати розвиток чисельних хімічних захворювань під спільною назвою «мікроелементози» [Авцын А.П., 1991]. Припускають, що підгрунтя токсичної дії важких металів полягає в їх ефектах на компоненти клітинних мембран, першочергово сульфгідрильні групи білків та жирнокислотні залишки ліпідів. Одначе, механізми прооксидантної дії металів (кобальту і меркурію), що були використані у цьому дослідженні, вивчені недостатньо [Sunderman F.W. Jr., 1988, Huang Y.L., 1996]. По-перше, часто в адаптивній реакції на інтоксикацію не відокремлюють індукцію неспецифічних універсальних механізмів регуляції метаболізму і наслідки специфічного впливу металу, як хімічного елементу з унікальними властивостями. По-друге, незважаючи на величезну кількість праць, що присвячені вивченню глутатіонзалежної АОС за умов оксидативного стресу, органспецифічні механізми регуляції активності її окремих складових (ГП, ГР, ГТ) під впливом важких металів залишаються не з'ясованими. По-третє, остаточно не сформульовані механізми антиоксидантної дії відновленого глутатіону у динаміці розвитку адаптації до прооксидантного впливу важких металів. Отже, постає актуальним дослідження токсичної дії важких металів (кобальту і меркурію) на три взаємодіючі клітинні системи: глутатіонзалежні антиоксидантні ферменти, систему внутрішньоклітинних тіолів та пероксидне окислення ліпідів (ПОЛ). Першорядне значення мало дослідження механізмів регуляції ГП, ГР і ГТ активностей у печінці та нирках щурів у динаміці розвитку оксидативного стресу, що був модельований введенням сублетальної дози хлориду кобальту, з урахуванням реалізації універсальної стресорної реакції організму в цілому. Печінка і нирки у якості досліджуваних органів були обрані не випадково, а зважуючи на специфічну їм функціональну навантаженість: у печінці відбувається детоксикація більшості прооксидантів ендогенного або екзогенного походження, через нирки останні виводяться з організму. Порівняльний аналіз адаптивної відповіді організму на проксидантну дію хлориду кобальту за умов блокади -адренорецепторів неселективним блокатором пропранололом або на тлі попереднього введення антиоксиданту - відновленого глутатіону, з необхідністю, дало змогу виявити механізми регуляції гомеостазу, що реалізують оксидативний стрес та беруть участь в адаптації до його наслідків. Тим часом, доцільність дослідження впливу сублетальної дози хлориду меркурію на розвиток адаптивних подій, грунтується на тому, що ця речовина викликала, як було зазначено, виснаження окремих ланок системи АО та внутрішньоклітинних тіолів і, у такий спосіб, обумовлювала активацію ПОЛ, що мала вторинний характер.

Зв'язок роботи з науковими програмами. Дисертаційне дослідження було частиною держбюджетної теми, що виконувалась на кафедрі біохімії ХНУ ім. В.Н. Каразіна «Клітинні та молекулярні механізми адаптації метаболізму при окисному стресі» (№ державної реєстрації 0197U008188).

Мета та задачі дослідження. Метою даної роботи було вивчення механізмів специфічного впливу хлоридів кобальту і меркурію на систему внутрішньоклітинних тіолів, активність глутатіонзалежних АО ферментів і ПОЛ. У відповідності до мети було визначено основні задачі дослідження:

1. Визначити та порівняти ключові ланки специфічності дії хлоридів кобальту і меркурію на вміст білкових і небілкових тіолів, активність глутатіонзалежних АО ферментів та динаміку активації ПОЛ у печінці і нирках щурів.

2. Вивчити вплив сублетальної дози хлориду кобальту на динаміку адаптації до оксидативного стресу за умов блокади пропранололом -адренорецепторів, з метою відокремлювання прооксидантної дії кобальту від впливу стресорного рівня катехоламінів.

3. Визначити роль та регуляторні механізми дії екзогенного відновленого глутатіону в адаптації до пошкоджуючих ефектів хлориду кобальту у печінці та нирках щурів.

Об'єкт дослідження - механізми формування адаптації за умов уражуючого впливу на організм прооксидантів довкілля. Предмет дослідження - органспецифічна регуляція активності глутатіонзалежних АО ферментів, вмісту внутрішньоклітинних тіолів та їх внесок до адаптації під час активації ПОЛ у печінці і нирках щурів за умов введення хлориду кобальту, хлориду меркурію, пропранололу або відновленого глутатіону.

Методи дослідження - вміст білкових і небілкових тіолів у печінці і нирках та концентрацію загального холестерину (ЗХ) і його фракційний склад (вільний холестерин (ВХ), етери холестерину (ЕХ)) у сироватці крові щурів визначали спектрофотометричними методами. Глутатіонпероксидазну, глутатіонредуктазну, глутатіонтрансферазну активності печінки і нирок, а також, лецитин-холестерин ацилтрансферазну (ЛХАТ) активність сироватки крові вимірювали спектрофотометрично. Вміст вторинних (сполуки з ізольованими подвійними зв'язками, дієнові кон'югати, кетодієни і сполучені триєни у фракціях нейтральних ліпідів і фосфоліпідів) і третинних (ТБК-позитивні продукти, як малоновий діальдегід (МДА)) продуктів ПОЛ у печінці і нирках та вміст загальних ліпідів у печінці, нирках і сироватці крові щурів визначали за допомогою спектрофотометричних методів дослідження. Експериментальні дані були статистично оброблені, оцінка значимості розходжень між групами отриманих даних була проведена з використанням критерію Вілкоксона-Манна-Уітні.

Наукова новизна. Вперше було встановлено, що у динамиці оксидативного стресу, спричиненого хлоридом кобальту, у підвищенні глутатіонпероксидазної і глутатіонтрансферазної активності печінки бере участь катехоламінова система стрес-гормонів. Зокрема, було показано, що за умов порушення цього способу регуляції ферментативної активності ГП і ГТ неселективним -адреноблокатором пропранололом спостерігається пригнічення даних антиоксидантних ферментів та посилення прооксидантного впливу кобальту. Для глутатіонпероксидази і глутатіонтрансферази нирок, а, також, глутатіонредуктази обох досліджених органів у динамиці оксидативного стресу катехоламін-залежного шляху регуляції ферментативної активності не було виявлено. Таким чином, у дослідженні з'ясовано прооксидантний ефект пропранолола у печінці і нирках щурів. Вперше показано, що ранішні ефекти важких металів (кобальту і меркурію) на активацію вільнорадикального окислення обумовлені специфічною взаємодією цих металів з тіолами білкової і небілкової природи: хлорид кобальту індукує підвищення концентрації небілкових сульфгідрильних груп у печінці тварин, а хлорид меркурію викликає виснаження системи тіолів як у печінці, так і у нирках щурів. Показано, що зв'язування іонів кобальту у тритіоловий комплекс з глутатіоном не запобігає активації вільно-радикальних реакцій, тоді як збільшення ємкості системи тіолів і підвищення ферментативної активності глутатіон-залежної антиоксидантної системи, обумовлене екзогенним GSH, носило адаптивний характер за умов розвитку оксидативного стресу. Вперше з'ясовано, що екзогенному відновленому глутатіону притаманна ліпід-мобілізуюча дія шляхом активуючого впливу на лецитин-холестерин ацилтрансферазу сироватки крові та прискорення, у такий спосіб, транспорту ліпідів ліпопротеїнами крові.

Теоретична і практична значимість роботи. Результати, що отримані у дослідженні, свідчать про спрямованість впливів хлоридів кобальту і меркурію на різні ланки рівноваги ПОЛ АОС. Вивчення механізмів динамічних змін ємкості глутатіонзалежної АОС печінки і нирок за умов оксидативного стресу при введенні хлориду кобальту або меркурій-індукованої інтоксикації, а також з'ясування шляхів органспецифічної регуляції активності АО ферментів дає змогу керувати захисними системами організму за умов впливу важких металів та запровадити найбільш ефективніші схеми та способи детоксикації. Практичне значення роботи полягає у тому, що завдяки досконалому вивченню антиоксидантного та з'ясування ліпідмобілізуючого впливів відновленого глутатіону, цей природний антиоксидант може бути застосований у якості протектору оксидативного стресу, а можливо й при інших гипоксія-вміщуючих паталогіях.

Особистий внесок здобувача. Всі результати, що наведені у рукопису, отримані здобувачем самостійно. Дисертантом особисто здійснено вибір досліджуваних показників, проведені всі серії експериментів та проаналізована література за темою дослідження. Обговорення встановлених механізмів та шляхів регуляції систем, що вивчались, автор провів разом з науковим керівником.

Апробація роботи. Основні положення та результати дисертаційної роботи пройшли апробацію: на науковій конференції «Фундаментальные и прикладные аспекты современной биохимии», С.-Петербург, 1998 р.; на VII Українському біохімічному з'їзді, Київ, 1997 р.; на науковій конференції молодих учених-біологів та засіданнях кафедри біохімії Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна.

Публікація матеріалів. За матеріалами дисертації опубліковано 7 наукових праць, з яких 5 статей надруковано у фахових виданнях.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 150 сторінках та складається з 8 розділів: вступу, огляду літератури, матеріалів і методів дослідження, результатів і їх обговорення (3 розділи), узагальнення отриманих результатів і висновків та списку використаної літератури (265 літературних джерела, 90 з яких англійською і 160 російською мовами). Робота містить 29 рисунків та 27 таблиць.

Основний зміст роботи

глутатіон пропранолол кобальт хлорид

Огляд літератури. Огляд складається з 3-х підрозділів (1.1, 1.2 та 1.3), що містять сучасні уявлення про регуляцію метаболізму за умов виникнення та перебігу оксидативного стресу, взаємодію окремих складових АОС (особливо роль відновленого глутатіону, як зв'язуючого кільця між системою тіолів і глутатіонзалежною ферментною АОС) та наслідки отруєння важкими металами (кобальтом або меркурієм). Особлива увага приділяється обговоренню можливих механізмів гормон-опосередкованій регуляції вільнорадикальних процесів та засобів АО захисту при адаптації організму до оксидативного стресу.

Матеріали та методи дослідження. Дослідження було проведено на 3-х місячних щурах лінії Вістар, вагою 180-220 г., яких утримували у стандартних умовах віварію. Розчини солей металів, пропранололу або відновленого глутатіону вводили одноразово внутрішньочеревинно у відповідній дозі: хлорид кобальту (сублетальна доза) - 3 мг/100 г. маси [Maines M.D., 1976]; хлорид меркурію (сублетальна доза) - 0,7 мг/100 г. маси [Maines M.D., 1977]; пропранолол (терапевтична доза) - 0,15 мг/100 г. маси [Bassukevitz Y., 1989]; відновлений глутатіон - 50 мг/100 г. маси [Конвай В.Д., 1988]. Тварин декапітували через 0.5 год, 2 год або 24 год відповідно до поставлених завдань. Об'єктом дослідження були печінка, нирки та сироватка крові щурів. Стан глутатіонзалежної АОС органів визначали спектрофотометричним методом шляхом вимірювання ГП [Ланкин В.З., 1981] і ГР [Герасимов А.М., 1976] активностей, які наводили в нмоль NADPH за 1 хв на 1 мг білка та ГТ [Лемешко В.В., 1987] активності з 1-хлор - 2,4 - дінітробензолом (2,4 ДНХБ), у якості субстрату, і наводили у мкмоль 2,4 ДНХБ за 1 хв інкубації на 1 мг білка. Етерифікуюча здібність сироватки крові була визначена шляхом спектрофотометричного вимірювання лецитин-холестерин ацилтрансферазної активності [Stokke K.T., 1971], яку наводили у нмолях холестерину, що етерифікується за 1 сек в 1 л сироватки крові. Вміст ТБК-позитивних продуктів [Minara M. 1980], загальних ліпідів [стандартний набір Eagle Diagnostics (США)], білкових і небілкових сульфгідрильних груп [Фоловеев В.Ф., 1981] визначали спектрофотометрично. Окремо у фракціях нейтральних ліпідів і фосфоліпідів печінки і нирок щурів спектрофотометрично визначали вміст сполук з ізольованими подвійними зв'язками ( = 220 нм), дієнових кон'югатів ( = 232 нм), кетодієнів і сполучених триєнів ( = 278 нм) за методом Волчегорського [Волчегорський И.Ф., 1989]. Вміст білка встановлювали за методом Лоурі. Експериментальні дані були статистично оброблені, оцінка значимості розходжень між групами отриманих даних була проведена з використанням критерію Вілкоксона-Манна-Уітні.

Результати досліджень роботи та їх обговорення

Порівняльний аналіз механізмів активації глутатіонзалежної антиоксидантної системи, змін стану системи внутрішньоклітинних тіолів та динаміка пероксидного окислення ліпідів за умов впливу хлориду кобальту та хлориду меркурію. З метою узагальнення провідних шляхів взаємовпливу досліджуваних у роботі систем гомеостазу та з'ясування специфіки механізмів адаптації до токсичної дії сублетальних доз хлоридів кобальту і меркурію визначали вплив одноразової ін'єкції розчинів вищезгаданих солей металів у динаміці їх дії: 0,5 год, 2 год та 24 год впливу. Було зазначено, що солі важких металів викликають активацію ферментів АОС (рис. 1, 2). Зокрема, підвищувалась глутатіонпероксидазна і глутатіон-трансферазна активності печінки щурів через 0,5 год після введення розчину СоСl2 та глутатіонпероксидазна (в інтервалі 0,5 - 24 год) і глутатіонтрансферазна (через 0,5 год після введення розчину СоСl2) активності нирок. Хлорид меркурію впливав лише на глутатіонтрансферазна активність печінки: протягом доби (24 год) цей показник залишався значно збільшеним.

При введенні хлориду кобальту показано збільшення вмісту небілкових та зниження концентрації білкових сульфгідрільних груп протягом першої доби у печінці щурів (рис. 3), що свідчить про адаптивну роль небілкових тіолів за умов оксидативного стресу. Якщо СоСl2 у сублетальній дозі призводив до становища супервідновленості у клітинах на тлі підвищеного рівня утворення активних метаболітів кисню, то HgСl2 виявився опосередкованим індуктором вільнорадикальних процесів. Зв'язуючи доступні білкові та небілкові сульфгідрильні групи (рис. 4), меркурій в організмі призводив до порушення динамічної рівноваги ПОЛ АОЗ шляхом виснаження тіолової ланки антиоксидантної системи печінки щурів. У нирках не було виявлено суттєвого зменшення вмісту сульфгідрильних груп (рис. 4) за умов дії хлориду меркурію в інтервалі 0,5 - 2 год впливу. Можливо, це обумовлено специфічно високою активністю ниркового ізоферменту -глутамілтранспептидази [Tamano T., Yostda H., 1990].

Згідно з даними цього дослідження (табл. 1) та опублікованими результатами інших вчених [Sunderman F.W., 1988, Huang Y.L., 1996] не викликає сумніву, що солі важких металів здатні посилювати процеси ПОЛ на початкових етапах свого впливу у печінці і нирках щурів.

Таблиця 1. Вміст ТБК-позитивних продуктів у печінці і нирках щурів у різні терміни після введення СоСl2 або HgСl2 (мкмоль/мг білка, М+m, n = 6 - 7)

Чинник

Орган

Контроль

Час після введення

0,5 год

2 год

24 год

СоСl2

печінка

17,00+0,50

25,00+1,30*

24,00+1,50*

15,00+0,70

нирки

28,00+1,55

33,00+2,27

32,50+2,22

34,30+1,38*

HgСl2

печінка

12,00+0,20

17,00+0,20*

12,00+0,30

14,00+0,30*

нирки

28,00+3,00

34,00+2,00*

26,00+1,66

16,00+4,00*

* - р 0,05 відносно до контролю

Таким чином, надлишок кобальту моделював в організмі тварин перебіг оксидативного стресу, про що свідчать активація глутатіонзалежних АО ферментів, збільшення вмісту небілкових тіолів та накопичення продуктів пероксидації ліпідів у динаміці впливу цього металу. Прооксидантний ефект меркурію можна визначити як вторинний, обумовлений виснаженням системи тіолів і, зокрема, пулу відновленого глутатіону у глутатіонтрансферазних реакціях детоксикації досліджуваного металу.

Динаміка розвитку оксидативного стресу при введенні хлориду кобальту на тлі блокади -адренорецепторів пропранололом. З метою відокремлювання специфічної реакції відповіді в експериментах з введенням хлориду кобальту на тлі загальної стресорної реакції організму було проведено серію досліджень за умов блокади -адренорецепторів. Для цього за 0,5 год до ін'єкції розчину солі металу вводили розчин пропранололу та вивчали сумісний вплив чинників у динаміці 0,5 год, 2 год і 24 год, починаючи з введення розчину СoCl2. Для з'ясування впливу самого пропранололу простежували динаміку його дії через 1, 2.5 та 24.5 год у печінці і нирках щурів. Дослідження дало змогу з'ясувати органспецифічний характер регуляції активності глутатіонзалежних АО ферментів. Результати експериментів свідчать про те, що у печінці глутатіонпероксидаза і глутатіонтрансфераза активуються стресорним рівнем катехоламінів (рис. 1), бо за умов блокади -адренорецепторів пропранололом їх активність зменшувалась як за умов введення хлориду кобальту (табл. 2), так і без CoCl2 (табл. 3). Активність ниркових ізоформ ферментів модулювалась надлишком субстратів і не залежала від гормонального контролю (табл. 2 і 3).

Таблиця 2. Вплив CoCl2 за умов блокади -адренорецепторів пропранололом та самого пропранололу на активність глутатіонзалежних антиоксидантних ферментів у печінці щурів (а - нмоль NADPH /(хв мг білка), b - мкмоль 2,4ДНХБ /(хв мг білка), М+m, n = 6 - 7)

Параметр,

що вимірювався

Орган

Контроль

ПРОПРАНОЛОЛ + CoCl2

час після введення CoCl21

0,5 год

2 год

24 год

ГП активністьа

печінка

124,0+7,9

135,0+10,7

90,3+10,5*

90,4+8,8*

нирки

52,6+4,4

74,3+2,8*

124,0+6,6*

68,6+8,9*

ГР активністьа

печінка

49,6+6,3

82,6+6,8*

45,9+6,0

42,8+4,7

нирки

139,0+2,9

157,0+7,0*

123,0+7,2

140,0+10,4

ГТ активністьb

печінка

130,0+4,2

146,0+9,1

96,3+6,5*

99,9+3,8

нирки

32,8+2,8

52,8+4,3*

55,4+4,8*

53,0+1,3*

Примітка: ГП - глутатіонпероксидазна активність, ГР - глутатіонредуктазна активність, ГТ - глутатіонтрансферазна активність;

1 - блокаду -адренорецепторів пропранололом здійснювали за півгодини до ін'єкції розчину хлориду кобальту, динаміку окиснювального стресу досліджували починаючи з введення розчину CoCl2; * - р 0,05 відносно до контролю.

Далі було встановлено, що на відміну від відомої протекторної дії неспецифічного блокатору -адренорецепторів пропранололу стосовно адренергічної активації ПОЛ у серці при емоційному стресі [Меерсон Ф.З., Пшеников М.Г., 1988], за умов оксидативного стресу хлоридом кобальту ні в печінці, ні в нирках пропранолол не виявив захисного ефекту (табл. 4). Навпаки, була з'ясована прооксидантна дія самого пропранололу у досліджуваних органах (табл. 5).

Таблиця 3. Вплив пропранололу на активність глутатіонзалежних антиоксидантних ферментів у печінці щурів (а - нмоль NADPH /(хв мг білка), b - мкмоль 2,4ДНХБ /(хв мг білка), М+m, n = 6 - 7)

Параметр,

що вимірювався

Орган

Контроль

ПРОПРАНОЛОЛ

час після введення

1 год

2,5 год

24,5 год

ГП активністьа

печінка

124,0+7,9

109,0+12,4

92,7+8,0*

67,0+8,7*

нирки

52,6+4,4

83,4+1,1*

74,1+2,4*

61,2+2,0

ГР активністьа

печінка

49,6+6,3

54,6+5,0

48,2+4,5

56,0+6,5

нирки

139,0+2,9

158,0+5,1*

103,0+8,3*

184,0+7,3*

ГТ активністьb

печінка

130,0+4,2

142,0+12,9

125,0+11,3

130,0+13,2

нирки

32,8+2,8

29,8+2,8

51,8+2,2*

49,1+3,1*

* - р 0,05 відносно до контролю

Таблиця 4. Вплив CoCl2 за умов блокади -адренорецепторів на вміст продуктів пероксидного окислення ліпідів у печінці та нирках щурів (а - мкмоль/мг білка, b - Е/г тканини, М+m, n = 6 - 7)

параметр, що

орган

контроль

час після дії чинників1

вимірювався

0,5 год

2 год

24 год

ТБК-позитивні а

печінка

17,00+0,50

25,0+1,70*

29,0+2,10*

19,0+0,60*

продукти

нирки

28,00+1,55

34,8+1,59*

35,3+2,81*

38,4+1,69*

дієнові кон'югати

печінка

2,44+0,13

4,22+0,26*

2,17+0,08

2,19+0,09

у фракції НЛ b

нирки

1,10+0,04

1,30+0,09*

1,67+0,19

1,14+0,20

дієнові кон'югати

печінка

17,40+1,72

10,1+0,99*

16,35+1,47

17,95+1,71

у фракції ФЛ b

нирки

25,35+1,50

29,60+3,00

34,1+1,50*

24,40+2,19

Примітка: НЛ - нейтральні ліпіди, ФЛ - фосфоліпіди; 1 - блокаду -адренорецепторів пропранололом здійснювали за півгодини до ін'єкції розчину хлориду кобальту, динаміку оксидативного стресу досліджували починаючи з введення розчину CoCl2; * - р 0,05 відносно до контролю.

Зазначена інтенсифікація пропранололом пероксидного окислення ліпідів, ймовірно, пов'язана з появою АФО при метаболізмі цього блокатору. Про це свідчить високий рівень ТБК-позитивних продуктів як у печінці, так і у нирках щурів на тлі відносно невеликих окиснювальних пошкоджень у фракції мембранних ліпідів (насамперед фосфоліпідів).

Попереднє введення пропранололу дало змогу встановити, що підвищення вмісту небілкових тіолів у динаміці розвитку кобальт-обумовленого оксидативного стресу є гормон-незалежним, бо блокада -адренорецепторів не упереджувала збільшення концентрації небілкових SH-груп [Каліман П.А., Соколік В.В., 2002].

Таблиця 5. Вплив пропранололу на вміст продуктів пероксидного окислення ліпідів у печінці та нирках щурів (а - мкмоль/мг білка, b - Е/г тканини, М+m, n = 6 - 7)

параметр, що

орган

контроль

час після введення пропранололу

вимірювався

1 год

2,5 год

24,5 год

ТБК-позитивні а

печінка

17,00+0,50

22,0+0,90*

19,0+0,80*

23,0+0,60*

продукти

нирки

28,00+1,55

35,3+1,93*

32,5+0,99*

35,5+2,40*

дієнові кон'югати

печінка

2,44+0,13

4,04+0,16*

3,58+0,26*

2,74+0,33

у фракції НЛ b

нирки

1,10+0,04

2,05+0,10*

2,48+0,17*

1,35+0,03

дієнові кон'югати

печінка

17,40+1,72

16,20+2,00

19,60+1,61

13,5+0,93*

у фракції ФЛ b

нирки

25,35+1,50

23,80+2,48

37,40+3,28

28,10+2,73

Примітка: НЛ - нейтральні ліпіди, ФЛ - фосфоліпіди; * - р 0,05 відносно до контролю

Таким чином, було з'ясовано, що пропранолол викликав блокування механізму активації ферментів АОС печінки і, у такий спосіб, діяв у якості прооксиданту, а не адаптогену в організмі. Тому його застосування при лікуванні серцево-судинних захворювань має бути досить обережним, з урахуванням виявленої побічної дії.

Вплив відновленого глутатіону на розвиток оксидативного стресу. Як відомо, індукція утворення активних форм оксигену обумовлює адаптивну відповідь клітин і організму в цілому у вигляді формування гіпоксичного стану [Скулачев В.П., 2001, Бурлакова Е.Б., 1983]. Ключова роль у відтворенні гіпоксії належить сульфгідрильним сполукам, насамперед відновленому глутатіону та іншим низькомолекулярним тіолам. Тому актуально було простежити динаміку оксидативного стресу, за умов дії хлориду кобальту, на тлі попереднього введення відновленого глутатіону. Виходячи з цього були застосовані такі умови дослідження: за 15 хв до ін'єкції розчину хлориду кобальту вводили розчин відновленого глутатіону. Вплив власне GSH вивчали через 15 хв, 45 хв і 2 год 15 хв. після ін'єкції його розчину. Також був досліджений вплив тритіолового комплексу кобальту [3GS-Co3+], що синтезували in vitro безпосередньо перед введенням [Maines M.D., 1976].

Встановлено, що попереднє введення GSH або зв'язування кобальту у тритіоловий комплекс не запобігає первинному прооксидантному ефекту іонів кобальту (на 0,5 год), що маніфестує підвищенням вмісту ТБК-позитивних продуктів у печінці щурів (табл. 6). Проте, необхідно зазначити, що на тлі попереднього введення GSH вже через 2 год дії СоСl2 спостерігалося відновлення нормального рівня активності пероксидного окислення ліпідів на відміну від самостійного впливу хлориду кобальту у печінці (табл. 1). У нирках відновлений глутатіон посилював ПОЛ [Соколик В.В., 2001], що ймовірно пов'язано з активацією -глутамілтранспептидази [Stark A.A., 1993].

Цікавим і дещо непередбаченим виявився вплив екзогенного відновленого глутатіону на міжорганний обмін ліпідів. Було з'ясовано, що GSH викликає накопичення загальних ліпідів у печінці, зниження цього показника у нирках та ніяк не впливає на загальну концентрацію ліпідів сироватки крові у щурів (табл. 7).

Таблиця 6. Вплив відновленого глутатіону на вміст продуктів пероксидного окислення ліпідів у печінці щурів при оксидативному стресі (М+m, n = 6 - 7, a - мг/г тканини, b - мкмоль/мг білка, c - Е/г тканини)

Параметр, що

Контроль

[3GS-Сo3+]

GSH + CoCl2

час після введення CoCl2 1

Вимірювався

0,5 год

0,5 год

2 год

24 год

Вміст загальних ліпідів а

51,3

+5,1

32,4

+1,2*

78,0

+3,8*

65,5

+6,9

64,3

+3,8

ТБК-позитивні b

продукти

13,5

+0,7

17,2

+0,3*

26,0

+1,7*

15,2

+1,3

16,2

+2,0

сполуки з ізольованими подвійними зв'язками у НЛ с

13,0

+1,1

19,8

+1,4*

22,6

+2,7*

9,7

+1,4

14,1

+1,5

сполуки з ізольованими подвійними зв'язками у ФЛ с

31,2

+2,0

35,0

+1,7

51,5

+6,1*

26,3

+1,8

26,8

+3,4

Примітка: НЛ - нейтральні ліпіди, ФЛ - фосфоліпіди; 1 - розчин відновленого глутатіону вводили за 15 хв до ін'єкції розчину хлориду кобальту; * - р 0,05 відносно до контролю.

Таблиця 7. Вплив екзогенного відновленого глутатіону на вміст загальних ліпідів та активність глутатіонзалежних АО ферментів у печінці і нирках щурів (а - мг/г тканини, b - ммоль/л, с - нмоль NADPH /(хв мг білка), d - мкмоль 2,4ДНХБ /(хв мг білка), М+m, n = 6 - 7)

ферменти

орган

контроль

час після введення GSH

15 хв

45 хв

2 год 15 хв

загальні

печінка а

51,3+5,1

55,3+4,1

84,6+5,7*

103,0+5,6*

ліпіди

нирки a

76,7+2,1

82,1+7,4

68,2+1,8*

79,2+3,5

сироваткab

13,9+1,1

-

12,6+2,7

14,1+1,5

ГП c

печінка

115,8+7,2

125,9+13,9

147,2+8,8*

106,8+15,6

нирки

67,6+6,1

89,9+6,9*

30,7+1,3*

51,2+3,5

ГР c

печінка

43,7+2,8

53,0+4,1

94,4+9,8*

41,9+4,1

нирки

97,3+9,4

173,0+11,9*

163,0+5,5*

68,0+7,1*

ГТ d

печінка

65,8+6,2

114,0+7,3*

153,0+12,6*

82,8+3,9

нирки

43,2+3,0

52,9+7,7

44,5+2,5

48,3+2,6

Примітка: ГП - глутатіонпероксидазна активність, ГР - глутатіонредуктазна активність, ГТ - глутатіонтрансферазна активність;

* - р 0,05 відносно до контролю.

Звертають на себе увагу і якісні зміни ліпідів під впливом глутатіону, а саме: збільшення вмісту сполук з ізольованими подвійними зв'язками у їх складі на ранішніх етапах оксидативного стресу - 0,5 год дії хлориду кобальту (табл. 6). Ці данні, а також підвищений рівень (174% від контролю) лецитин-холестерин ацилтрансферазної активності сироватки крові через 0,5 год після введення GSH, свідчать про ліпід-мобілізуючий ефект відновленого глутатіону у спосіб індукції ліполізу у периферійних тканинах та посилення зворотного транспорту холестерину до печінки у складі ліпопротеїнів сироватки крові.

В нашому дослідженні було зазначено вірогідне збільшення (у середньому на 130-220% порівняно до контрольних величин) вмісту білкових і небілкових тіолів під впливом екзогенного відновленого глутатіону у печінці і нирках щурів у всі терміни, що вивчалися (рис. 5). Привертає увагу, що збільшення рівня одного з субстратів реакції, а саме відновленого глутатіону у складі небілкових тіолів, обумовлює активацію глутатіонзалежної АО системи досліджуваних органів (табл. 7).

Відомо, що кобальт здатний викликати гіпоксичний стан в організмі шляхом зниження спорідненості гемопротеїнів крові до оксигену за умов їх стабілізації у дезоксиконформації [Hochachka P.W., 1996]. Виходячи з цього, кобальт-залежна гіпоксія обумовлена зниженням доступу оксигену до тканин організму. З іншого боку, розвиток гіпоксії на початкових етапах оксида-тивного стресу є універсальною відповіддю організму на чисельні прооксиданти різноманітної природи, а не тільки хлориду кобільту. Біологічна сутність гіпоксичного стану полягає у тому, що утворені у ланцюгових реакціях радикали без оксигену рекомбінують і відтворюють початковий стабільний стан. За присутності оксигену гасіння вільних радикалів відбувається з утворенням нестабільних пероксидних сполук і це пошкодження закріплюється. Ще один різновид антиоксидантної, протекторної дії відновленого глутатіону саме і полягає в утворенні гіпоксичного стану у клітинах шляхом взаємодії з оксигеном [Константинова М.М., 1981].

Таким чином, введення GSH захищає ліпіди від уражуючої дії наслідків оксидативного стресу шляхом активації глутатіонзалежної ланки ферментів АОС, збільшення ємкості системи внутрішньоклітинних тіолів, а також, завдяки протекторній ролі GSH у реалізації гіпоксичного стану і мобілізації ліпідів організму як окиснювальних субстратів (рис. 6).

Висновки

У дисертаційному дослідженні виявлено, що сублетальні дози кобальту або меркурію викликають на тлі активації ПОЛ різноспрямовані зміни у системі внутрішньоклітинних тіолів та орган-специфічну активацію глутатіонзалежних АО ферментів. Деякі специфічні механізми реалізації прооксидантного впливу пропранололу та протекторної дії відновленого глутатіону були з'ясовані у цьому дослідженні.

1. Встановлено, що сублетальні дози хлориду кобальту і хлориду меркурію викликають активацію різних ланок глутатіонзалежної АОС: хлорид кобальту - глутатіонпероксидаза-глутатіонредуктаза редокс-циклу, хлорид меркурію - глутатіонтрансферазу.

2. Показано, що введення неселективного блокатору -адренорецепторів пропранололу за умов оксидативного стресу викликає порушення катехоламін-обумовленог механізму активації глутатіонпероксидази і глутатіонтрансферази печінки щурів. Прооксидантний ефект пропранололу у печінці та нирках щурів не дозволяє його використовувати у якості адаптогену за умов оксидативного стресу.

3. З'ясована протилежно спрямована дія хлориду кобальту і хлориду меркурію на систему тіолів у печінці і нирках щурів, а саме: хлорид кобальту викликав збільшення вмісту небілкових тіолів у печінці, тоді як хлорид меркурію обумовлював зниження білкових і небілкових тіолів.

4. Виявлено, що накопичення ТБК-позитивних продуктів під впливом хлориду меркурію є вторинним результатом зсуву рівноваги ПОЛАОС у напрямку інтенсифікації вільнорадикальних реакцій за умов меркурій-залежного виснаження пулу внутрішньоклітинних тіолів. Навпаки, за дію кобальту підвищення вмісту продуктів ПОЛ у динаміці оксидативного стресу носить первинний, кобальт-індукований характер.

5. Виявлено протекторну антиоксидантну дію відновленого глутатіону у печінці тварин, тоді як у нирках екзогенний глутатіон викликав посилення процесів пероксидного окислення ліпідів. Введення відновленого глутатіону супроводжується збільшенням ємкості тіолової системи та активності глутатіон-залежних антиоксидантних ферментів.

6. Зазначено ліпід-мобілізуючий ефект екзогенного GSH в результаті підвищення лецитин-холестерин ацилтрансферазної активності у сироватці крові та прискорення транспорту ліпідів ліпопротеїнами сироватки крові.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Соколік В.В. Вплив хлориду ртуті на ланцюгове переокислення ліпідів і антиокислювальну систему глутатіонового захисту в печінці та нирках щурів // Медична хімія. - 1999. - Т.1, №1. - С. 33-37.

2. Соколик В.В., Калиман П.А. Протекторний эффект восстановленного глутатиона в условиях оксидативного стресса // Вісник проблем біології і медицини - 2001. - №4. - С. 26-29.

3. Соколик В.В., Баранник Т.В. Активность глутатион-зависимых ферментов антиоксидантной защиты и НАДФН-генерирующих дегидрогеназ в условиях окислительного стресса, вызванного хлоридом кобальта // Биологический вестник. - 1997. - Т. 1, №1. - С. 51-56.

Дисертантом одержані, обмірковані та обговорені дані, що наведені у статті, а саме: вміст молекулярних продуктів ПОЛ (сполук з ізольованими подвійними зв'язками, дієнових кон'югатів, кетодієнів і сполучених трієнів у фракціях фосфоліпідів та нейтральних ліпідів печінки та нирок щурів, а також концентрація малонового діальдегіду), активність глутатіонзалежних антиоксидантних ферментів (глутатіонпероксидазна, глутатіонредуктазна і глутатіонтрансферазна активності печінки щурів). Стаття підготовлена до друку.

4. Каліман П.А., Соколік В.В. Поглиблення уражуючого впливу оксидативного стресу за умов блокади -адренорецепторів пропранололом // Вісник Прикарпатського університету (сер. Біологія) - 2002. - вип. 2. - С. 139-145.

5. Калиман П.А., Загайко А.Л., Шаламов Р.В., Ганусова Г.В., Баранник Т.В., Скрипник Э.В., Соколик В.В., Шаби Б.К. Содержание и состав липопротеинов крови и печени крыс и некоторые показатели окислительного стресса при введении хлорида кобальта // Укр. биохим. журн. - 1997. - Т. 69, №5-6. - С. 138-148.

Дисертанту належать наступні дані, що наведені у статті, а саме: вміст молекулярних продуктів ПОЛ (сполук з ізольованими подвійними зв'язками, дієнових кон'югатів, кетодієнів і сполучених трієнів у фракціях фосфоліпідів та нейтральних ліпідів печінки та нирок щурів, а також концентрація малонового діальдегіду), активність глутатіонзалежних антиоксидантних ферментів (глутатіонпероксидазна, глутатіонредуктазна і глутатіонтрансферазна активності печінки щурів). Стаття підготовлена до друку.

6. Соколік В.В. Вплив кобальту на перекисне окислення ліпідів і систему антиоксидантного захисту у печінці та нирках щурів // Матеріали VII українського біохімічного з'їзду (Київ, 1997) - Тези доповідей (ч. 1). - С. 113-114.

7. Калиман П.А., Соколик В.В., Шаби Б.К. Перекисное окисление липидов и система глутатионовой защиты в печени и почках крыс при введении хлорида кобальта // Фундаментальные и прикладные аспекты современной биохимии. - Труды научной конференции, С.-Петербург. - 1998. - Т.1. - С. 294-299.

Размещено на Allbest.ru


Подобные документы

  • Цинк як життєвоважливий мікроелемент для всіх вищих організмів. Характеристика марганцю, його значення. Йод – елемент, що міститься у всіх тканинах людини. Біологічна роль кобальту. Бром – постійна складова частина різних тканин організму людини і тварин.

    реферат [20,3 K], добавлен 01.12.2010

  • Основні методи очищення газів від органічної сірки. Каталізатори на основі заліза, кобальту, нікелю, молібдену, міді, цинку для процесу гідрування сіркоорганічних сполук. Матеріальний баланс процесу гідрування. Конверсія природного газу та окису вуглецю.

    контрольная работа [181,3 K], добавлен 02.04.2011

  • Основи електролізу водних розчинів хлориду натрію діафрагмовим методом. Фізико-хімічні основи технологічного процесу виробництва каустичної соди. Електроліз водних розчинів хлориду натрію мембранним методом з твердим катодом. Проблемні стадії виробництва.

    курсовая работа [2,1 M], добавлен 17.02.2015

  • Зовнішні ознаки реакцій комплексоутворення в розчині. Термодинамічно-контрольовані (рівноважні), кінетично-контрольовані методи синтезу координаційних сполук. Взаємний вплив лігандів. Пояснення явища транс-впливу на прикладі взаємодії хлориду з амоніаком.

    контрольная работа [719,5 K], добавлен 05.12.2014

  • Молекулярна організація ланцюга біологічного окислення. Вільнорадикальне окислення в біологічних мембранах. Фізіологічна антиоксидантна система. Система аскорбінової кислоти. Вільні радикали і пероксиди як продукти взаємодії радіації з речовиною.

    курсовая работа [938,5 K], добавлен 01.01.2011

  • Хімічний склад і поглинаюча здатність ґрунтів. Методика визначення активності іонів і термодинамічних потенціалів в ґрунтах. Вплив калійних добрив на активність іонів амонію в чорноземі типовому. Поглиблене вивчення хімії як форма диференціації навчання.

    дипломная работа [823,0 K], добавлен 28.03.2012

  • Стаціонарні та нестаціонарні джерела надходження кадмію в атмосферу. Вплив розчинної солі кадмію на ріст і розвиток озимої пшениці. Вплив металу на дихальну систему та структуру кісткової тканини людини. Гепатотоксичність найтоксичнішого важкого металу.

    курсовая работа [5,7 M], добавлен 31.03.2013

  • Емульсія фосфоліпідів яєчного жовтка - модель пероксидного окиснення ліпідів. Механізм залізоініційованого окиснення вуглеводів. Антиоксидантний захист біологічних об’єктів. Регуляторні системи пероксидного окиснення ліпідів. Дія природних антиоксидантів.

    магистерская работа [2,0 M], добавлен 05.09.2010

  • Обмін ліпідів– багатоступеневий процес який складається з процесів травлення в харчовому тракті. Окислення гліцерину та вищих жирних кислот. Обмін кетонових тіл. Синтез мевалонової кислоти. Біосинтез стероїдних гормонів, вищих жирних кислот та гліцерину.

    контрольная работа [43,4 K], добавлен 19.02.2009

  • Процес розщеплення електролітів на іони у водних розчинах і розплавах. Дисоціація - оборотний процес. Електролітична дисоціація речовин з іонним і полярним ковалентним зв'язком. Дисоціація хлориду натрію у водному розчині.

    реферат [435,5 K], добавлен 12.11.2006

Работы в архивах красиво оформлены согласно требованиям ВУЗов и содержат рисунки, диаграммы, формулы и т.д.
PPT, PPTX и PDF-файлы представлены только в архивах.
Рекомендуем скачать работу.