Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна академія наук України

Інститут біоколоїдної хімії ім. Ф.Д. Овчаренка

УДК 544.77 : 579.266 : 628.516

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата хімічних наук

Колоїдно-хімічні процеси біотрансформації важких металів у грунті

Спеціальність 02.00.11 - колоїдна хімія

Керносенко Людмила Олександрівна

Київ 2003

Загальна характеристика роботи

грунт колоїд важкий метал

Актуальність теми. У багатьох країнах світу значні території грунтів, забруднених важкими металами, стали непридатними для сільськогосподарського використання та створюють екологічну небезпеку довкіллю. Отже, проблема очистки грунту від важких металів, тобто його ремедіаціїї, є актуальною та має велике суспільно-економічне значення.

Грунт - це складна багатокомпонентна природна колоїдна система. В основі його утворення, розвитку та самооочищення від різних забруднень, в тому числі від важких металів, лежать фундаментальні, але ще мало вивчені колоїдно-хімічні процеси сорбції-преципітації-солюбілізації сполук хімічних елементів, які каталізуються мікроорганізмами. Останні є рушійною силою сучасних технологій біоремедіації довкілля. Вивчення трансформації колоїдно-хімічного стану важких металів, зв'язаних з грунтовими колоїдами, під впливом мікроорганізмів є актуальним для розробки наукових основ управління поведінкою металів у грунті, його ремедіації, розширює наші уявлення щодо колоїдно-хімічних взаємодій в системі важкі метали-довкілля. Беручи до уваги складність грунту як об'єкту наукових досліджень, для успішного розвитку останніх потрібен комплексний підхід з позицій біоколоїдної хімії, який враховує внесок біоколоїдів (мікроорганізмів та метаболітів) у хід колоїдно-хімічних процесів.

Зв`язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в ІБКХ НАН України в рамках держбюджетних тем: “Розробка колоїдно-хімічних біотехнологій моніторингу та знешкоджування грунтів і вод, які містять важкі метали (талій, уран, стронцій, кобальт) та ціаніди (металокомплекси) на основі генетично модифікованих штамів бактерій” (1999-2001 р.р. № Держреєстрації 0100V0002370, шифр теми 2.16.4.5); “Вивчення механізмів гетерофазних реакцій в процесах селективної взаємодії клітин з металами” (2002-2004 р.р. № Держреєстрації 0102V007055, шифр теми 2.16.4.6; 2.28.9.10).

Мета та задачі роботи. Основною метою роботи є вивчення колоїдно-хімічних процесів мікробної трансформації металів у грунті та розробка на основі отриманих даних біотехнологічних принципів їх вилучення.

Для досягнення мети поставлено та вирішено наступні задачі:

вивчення колоїдно-хімічних закономірностей перетворення урану (VI), стронцію, міді, кобальту в природному грунті під впливом клітинних метаболітів;

дослідження селективної сорбційної активності грунту щодо вказаних металів при інтродукції до нього бактеріальних клітин, зміни співвідношення рухомих, (водорозчинних, іонообмінних) та нерухомих форм металів у грунті;

оцінка можливості біологічного розпаду водорозчинних цитратних і фульватних металокомплексів та екологічної безпеки продуктів деструкції;

дослідження процесів біовилужування важких металів із грунту у двох варіантах: стаціонарному (in situ) та суспензійному в біореакторі (ex situ); розробка біотехнологічного процесу, який базується на інтродукції металорезистентної культури в грунт та подальшій його обробці, встановлення оптимальних умов та режимів реалізації біотехнологічного процесу.

Об`єкт дослідження - штучно контамінований водорозчинними солями урану (VI), міді, кобальту, стронцію опідзолений грунт у вигляді суспензії або грунтової колонки, збагачений металорезистентними бактеріями та поживними речовинами для їх розвитку.

Предмет дослідження - колоїдно-хімічні закономірності солюбілізації/ біовилужування важких металів з грунту під впливом металорезистентних бактерій.

Методи дослідження. Взаємодію важких металів з грунтом та мікроорганізмами вивчали методом сорбції із розчинів. Форми існування важких металів у грунті визначали методом послідовних екстракцій. Водорозчинні форми металів визначали у водних витяжках із грунту, обмінні форми - у витяжках ацетатним буфером, валовий/повний вміст металів - в кислотних екстрактах. Концентрацію міді, стронцію, кобальту контролювали методом атомно-абсорбційної спектрофотометрії в полум`ї повітря-ацетилен, концентрацію урану (VI) - спектрофотометричним методом з Арсеназо III. Розвиток мікроорганізмів у грунтових та водних системах вивчали за зміною кислотності середовища (методом потенціометрії), за збільшенням оптичної густини суспензій та кількості клітин (методом посіву на поживні середовища). Продукти метаболізму мікроорганізмів (екзополісахариди, органічні кислоти) аналізували біохімічними методами.

Наукова новизна роботи. На основі систематичних досліджень взаємодій мікроорганізмів з металами: ураном (VI), міддю, кобальтом та стронцієм у грунті вперше встановлено можливість та механізм їх колоїдно-хімічних перетворень під впливом клітинних метаболітів. Встановлено шляхи направленого регулювання процесів взаємної трансформації водорозчинних (рухомих) і колоїдних форм металів. В залежності від спрямованості метаболізму, основними продуктами біотрансформації металів у грунті є водорозчинні цитратні комплекси (мідь, кобальт, стронцій, ураніл) або гідроксидно-карбонатні колоїдні осади міді, кобальту, стронцію та водорозчинні карбонатні комплекси (ураніл). Досліджено колоїдно-хімічні процеси біологічного руйнування у грунті органокомплексів важких металів. При цьому винайдено умови утворення кінцевих продуктів екологічно безпечних сполук (карбонатів та гідроксидів) у колоїдній формі.

Вивчено сорбційні та седиментаційні властивості природного грунту, який містить метали та інтродуковані до нього спеціальні штами металорезистентних культур. Встановлено селективність сорбції важких металів та характер їх зв`язку в грунті.

Практична значимість роботи. В результаті проведених досліджень розроблено основи біотехнологічного процесу вилучення важких металів із грунту, що базуються на використанні колоїдно-хімічних процесів трансформації важких металів (ВМ) із зв`язаної у водорозчинну форми у вигляді нетоксичних цитратних комплексів. Подальше вилучення останніх із грунту відбувається шляхом його промивання, а залишкові кількості металокомплексів підлягають біологічному руйнуванню з утворенням нетоксичних карбонатів та гідроксидів у колоїдній формі. Біотехнологічний процес досліджено у двох варіантах: стаціонарному (in situ) та з видаленням грунту і наступною його обробкою у біореакторі (ex situ). Ефективність очищення складає 99% U(VI), 95% Cu, 94% Co, 90% Sr. За матеріалами цієї розробки отримано Патент України № 5857 від 15.08.03.

Особистий внесок здобувача. Особистий внесок автора полягав в обробці літературних джерел за дослідженою тематикою, безпосередній участі у плануванні, проведенні експериментів та обговоренні отриманих результатів. Мікробіологічна й біохімічна частина роботи, а також інтерпретація одержаних даних виконано під керівництвом с.н.с., к.б.н. Г.М. Ніковської. Науковий співробітник, к.ф.-м.н. О.Г. Максимчук приймав участь в аналізі концентрації важких металів методом атомно-абсорбційної спектрофотометрії, с.н.с, к.х.н. Л.Г. Надєл - в аналізі осадів важких металів методом рентгенофазного аналізу, н.с., к.х.н. Н.П. Стрижак приймала участь у дослідженнях щодо біодеструкції органокомплексів важких металів. Електромікроскопічні дослідження проводились за участю головного спеціаліста А.Г. Савкіна. Обговорення та узагальнення одержаних результатів роботи виконано за участю наукового керівника докт.хім.наук., проф. З.Р. Ульберг.

Апробація роботи. Основні положення дисертаційної роботи доповідалися на Міжнародних конференціях: “Екологія та геохімічна діяльність мікроорганізмів (Україна, Одеса, вересень, 2001), друга міжнародна конференція “Interfaces Against Pollution” (Hungary, Miskolc-Lillafured, May, 2002), четверта міжнародна конференція “Сereco 2003” (Hungary, Miskolc-Tapolka, April, 2003); а також на третій всеукраїнській науково-практичній конференції молодих вчених “Екологія. Людина. Суспільство” (Україна, Київ, НТУУ “КПІ” травень, 2000).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 8 наукових праць у провідних наукових журналах, у тому числі 4 тези доповідей, отримано Патент України на винахід.

Структура та об'єм роботи. Дисертація складається із списку умовних скорочень, вступу, п`ятьох розділів, висновків, списку використаних літературних джерел (113 найменувань). Робота викладена на 121 сторінці машинописного тексту, ілюстрована 18 таблицями та 13 рисунками.

Зміст роботи

У вступі обґрунтовано актуальність теми дослідження, сформульовано цілі та задачі роботи, показано її актуальність і наукову новизну, теоретичне значення, практичну цінність одержаних результатів та особистий внесок здобувача.

Перший розділ містить літературний огляд, в якому розглянуто сучасний стан проблеми забруднення грунтів важкими металами та їх детоксикації. Представлено літературні дані щодо форм знаходження важких металів у грунті, їх дії на мікроорганізми, ролі останніх у зміні колоїдно-хімічного стану важких металів (ВМ), а також сучасні підходи до ремедіації грунтів. Аналіз наукової інформації свідчить про перспективність мікробіологічних методів ремедіації грунтів, які вивчені недостатньо.

На основі проведеного аналізу літературних джерел визначено наукові задачі, вирішення яких дозволяє досягти головної мети роботи.

У другому розділі наведено характеристики об`єктів дослідження та методи проведення експериментів. Дослідження проводили на темно-сірому опідзоленому грунті, який є характерним для лісостепової зони України. Для мікробіологічної обробки грунту обрано наступні металорезистентні культури, які виділені з грунтів, забруднених важкими металами: Bacillus cereus BKM 4368 (музей мікробних культур Інституту біоколоїдної хімії НАН Украіни) та Alcaligenes eutrophus CH 34 (центр “VITO”, Бельгія). Для забезпечення розвитку металорезистентних культур бактерій в присутності важких металів використано рідке тріс-мінімальне середовище. До сольового середовища додавали ацетат натрію (джерело вуглецю), який здатен активно асимілюватись обома тест-культурами та глюкозу або сахарозу у варіантах із бацилами. Для визначення концентрації мікроорганізмів використовували агаризовані тверді поживні середовища - м`ясо-пептонний та крахмало-аміачний агари. В дослідах використовували розчини важких металів міді, кобальту, стронцію, уранілу у вигляді відповідних солей та синтезовані нами цитратні й фульватні органокомплекси важких металів Ca, Mg, Sr, Fe(III), Zn, Cu, Ni, Co, U(VI).

Вилужування важких металів із грунту проводили в суспензійному та стаціонарному варіантах досліду у тріс-мінімальному синтетичному середовищі, що містило джерела вуглецю та мікроорганізми. В першому випадку біовилужування ВМ із грунту проводили в колбах Ерленмейера (аеробні умови); у другому - в грунтових колонках із запірним краном.

В роботі було використано: фізико-хімічні методи дослідження взаємодій у системах грунт-ВМ-мікроорганізми (метод сорбції із розчинів, метод послідовних екстракцій, атомно-абсорбційна спектрофотометрія, рентгенофазний аналіз, колориметричний, потенціометричний, електронно-мікроскопічний методи тощо); біохімічні методи аналізу мікробних метаболітів; мікробіологічні методи вивчення розвитку мікроорганізмів у присутності важких металів.

Третій розділ присвячено аналізу результатів досліджень колоїдно-хімічних закономірностей взаємодії мікроорганізмів з металами в грунті.

Вивчено сорбцію урану (VI), міді, кобальту та стронцію природним опідзоленим грунтом. Встановлено, що сорбція металів із індивідуальних розчинів зменшується в ряду: U (VI) Cu Co Sr. Слід зазначити, що така послідовність металів зберігається під час сорбції їх грунтом із індивідуальних розчинів та із розчинів, що містять суміш цих металів в еквімолярних співвідношеннях. Якщо сорбція урану (VI), міді та кобальту із багатокомпонентного розчину знижується відповідно на 20, 26 та 21 %, то стронцію - на 36 % (табл. 1).

Одержані дані відображають повну сорбцію металів грунтовими мінеральними та органічними сполуками. Послідовність, яка спостерігається, співпадає з рядом констант стійкості відповідних гуматних та фульватних комплексів. В результаті процесу сорбції можно визначити кількісний та якісний склад форм, в яких метали сорбуються грунтом.

Методом послідовних екстракцій встановлено, що 90 % уранілу, 85 % міді та лише 36% стронцію міститься у грунті в нерухомій формі. Серед рухомих (біодоступних) форм стронцію та уранілу переважає обмінна, міді - водорозчинна; для кобальту характерна рівновага обох вищевказаних рухомих форм.

Таблиця 1. Сорбція важких металів природним грунтом із водних розчинів солей

Примітка. Чисельник дробу - сорбція із індивідуального розчину, знаменник - із змішаного розчину, який містить всі метали в концентрації 3 мM.

Четвертий розділ описує дослідження біологічної деструкції цитратних та фульватних металокомплексів, які утворюються під час мікробіологічної ремедіації грунту.

Важкі метали знаходяться у природних об`єктах, як правило, у вигляді комплексів з цитратами, оксалатами, фульватами, гуматами - основними продуктами біологічного кругообігу органічної речовини у воді та грунті. Цитринова кислота (центральний інтермедіат природного циклу вуглеводів) є біологічно лабільною сполукою, яка метаболізується багатьма мікроорганізмами до вуглекислоти. У зв`язку з недостатньою вивченістю процесу мікробіологічної деструкції органокомплексів важких металів, було досліджено деякі колоїдно-хімічні аспекти біодеградації природних цитратних та фульватних комплексів важких металів під впливом грунтових мікроорганізмів.

За тест об`єкти обрано синтезовані нами цитратні та фульватні комплекси Ca, Mg, Zn, Sr, Ni, Cu, Co, U (VI); для біодеградації цитратних комплексів було використано металорезистентну культуру B. сereus ВКМ 4368, фульватних - накопичувальну грунтову культуру.

Встановлено, що в процесі біодеструкції металоцитратів відбувається зміна величини рН до 8,5, а металофульватів - до 4,0. Ці зміни супроводжуються підвищенням кількості мікроорганізмів та оптичної густини бактеріальних дисперсій. Хід кривих росту мікроорганізмів на різних формах цитрату та фульвату подібний, але відрізняється тривалістю лаг-фази. Це свідчить, що органокомплекси та продукти їх біодеструкції є нетоксичними та екологічно безпечними сполуками.

Як показали дослідження параметри біодеструкції металоцитратів близькі для двох груп комплексів: 1) Ca-, Mg-, Sr-, Fe-цитрати; 2) Co-, Zn-, Cu-, Cd-, Ni-цитрати. Але показники їх хімічної стійкості суттєво відрізняються навіть у межах однієї групи: Fe-CitCa-CitMg-CitSr-Cit. Найбільш біорезистентним виявився цитратний комплекс уранілу, який з хімічної точки зору менш стійкий у порівнянні з цитратом заліза. Біодеградабельність вивчених металокомплексів спадає в ряду: Ca - Cit Sr - Cit Mg - Сit Fe - Cit Co - Cit Zn - Cit Cu - Cit Ni - Cit Cd - Cit UО₂ - Cit. Наведена послідовність відповідає відносній токсичності важких металів. Отже, біодеградабельність металорганічних комплексів безпосередньо не позв`язана з їх стійкістю, але спостерігається зв`язок між токсичністю координуючого металу та біологічною стійкістю відповідного металокомплексу.

Як відомо, цитрат-аніон легко мінералізується до вуглекислоти багатьма мікроорганізмами за допомогою внутрішньоклітинних ферментів. Як показали наші дослідження, при наявності у дисперсійному середовищі вуглекислоти (рН 8,5) відбувається утворення карбонатів та гідроксидів досліджуваних металів, оскільки інші іони (фосфати, сульфати, амоній, хлориди) використовувались у складі синтетичних поживних середовищ у мінімальних, необхідних для життєдіяльності мікроорганізмів концентраціях, та практично повністю споживались культурою бактерій в процесі росту. Співставлення показників розчинності карбонатних та гідроксидних осадів металів (табл.2) показало, якщо координуючим метал-іоном цитратного комплексу є кальцій або стронцій, то у складі продуктів метаболізму цих металів утворюються карбонати; для магнію, кобальту, міді характерно утворення менш розчинних, порівняно з карбонатами, гідроксидів. Під час деструкції уранілцитратного комплексу може утворюватись досить стійкий водорозчинний карбонатний комплекс. Результати проведених досліджень свідчать, що в результаті біологічного процесу цитратні металокомплекси можуть трансформуватись до екологічно безпечних карбонатів і гідроксидів та переходити з водорозчинної у дисперсну форму, за виключенням урану (VI), фазово-дисперсний стан якого не змінюється.

Таким чином показано можливість мікробної деградації цитратних та фульватних комплексів важких металів, які відрізняються за своїми фізико-хімічними і токсичними властивостями, з утворенням екологічно безпечних продуктів. Металоцитратні комплекси практично повністю метаболізуються з утворенням вуглекислоти металофільною бактеріальною культурою B.cereus BKM 4368, а фульватні - грунтовою накопичувальною культурою (при домінуванні актиноміцетів) з утворенням простих органічних кислот.

Таблиця 2. Швидкість біомінералізації цитратів (V), що відрізняються за типом координуючого метало-комплексу

Примітка. Контрольна система з цитрат-іоном; метаболізм цитрату при С₀3ммоль/дм³ в усіх випадках досягав 90%.

У п`ятому розділі дисертаційної роботи розглянуто закономірності колоїдно-хімічної трансформації важких металів в процесі життєдіяльності мікроорганізмів та сформульовано основні принципи біоколоїдної технології ремедіації грунту, забрудненого важкими металами.

Біотехнологічний процес було змодельовано для двох варіантів: стаціонарного (in situ) та в біореакторі (ex situ).

Проведені дослідження закономірностей трансформації металів, що відбуваються під впливом мікроорганізмів показали, що найбільш ефективно вказані процеси протікають у мінеральних дисперсіях. При цьому досягнуто практично повне (99%) вилучення із грунту урану та значне (>90%) вилучення інших досліджених металів у бактеріальному процесі метаболізму глюкози.

Дослідження проводили з використанням металорезистентних культур B.cereus ВКМ 4368 або A.eutrophus СН 34 в розчині з біогенними сполуками для їх розвитку. Як джерела вуглецю було використано глюкозу та ацетат натрію. В результаті внесення вказаних культур у грунтові суспензії та їх розвитку в цих умовах виявлено зміну кислотності грунтової дисперсії від рН 6,8 до 4,0 - при метаболізмі глюкози та до рН 9,2 - при утилізації ацетату, що обумовлено утворенням відповідних метаболітів.

Отримані дані свідчать (табл.3) про те, що всі досліджувані метали більш ефективно вилужувались у процесі розвитку B.cereus на глюкозі, ніж вивчені МРК на ацетаті.

Таблиця 3. Вилужування важких металів із грунту під час розвитку мікроорганізмів

Примітки: *Вихідна величина рН грунтово-мінеральної дисперсії 6,8; тривалість процесу 18 год; концентрація металу (мг) в 10 г грунту: U (VI) - 140, Cu - 32, Co - 20, Sr - 11.

Слід відмітити незначну ефективність вилужування важких металів у контрольних грунтових суспензіях, які не були оброблені МРК, так як автохтонна мікрофлора в них інгібована. Виключення складає малотоксичний стронцій. За ефективністю біовилужування вивчених важких металів повторився ряд, який відповідає їх сорбційній активності: U (VI) Cu Co Sr. Отримані еспериментальні дані показали, що металорезистентна культура B.cereus BKM 4368 в процесі рідкофазного культивування утворює мажорні метаболіти - цитринову кислоту (ріст на глюкозі) та вуглекислоту (ріст на ацетаті), а також мінорні метаболіти - екзополісахариди. Наведені метаболіти здатні утворювати комплекси та преципітати з важкими металами. Встановлено, що вилужування металів із грунту в залежності від типу мікробних метаболітів відбувалось, головним чином, у вигляді цитратів або гідроксокарбонатів, при цьому всі випробувані метали більш ефективно вилужувались у вигляді водорозчинних цитратних комплексів, ніж нерозчинних карбонатних комплексів міді, кобальту, стронцію та водорозчинних - уранілу. Продукція екстрацелюлярних метаболітів (цитринової кислоти та екзополісахаридів) інтенсифікується підвищенням концентрації важких металів у рідкій фазі.

Проведено порівняння ефективності біологічного та хімічного вилужування для забрудненого уранілом грунту. Встановлено, що при однакових значеннях рН грунтової суспензії ефективність біовилужування уранілу суттєво (на 30-50%) перевищувала ефективність хімічного. Хімічне вилужування є ефективним лише при рН3 та рН 9. В першому випадку відбувається перехід урану (VI) із грунту до розчину у вигляді катіону уранілу UO₂²⁺ в результаті обміну на Н⁺-іони дисперсійного середовища, в другому - у вигляді уранатів UO₄^2-, що обумовлено амфотерним характером гідроксиду уранілу.

В результаті реалізації бактеріального процесу ступінь вилужування урану (VI) у кислій області рН досягала 99%, у лужній - не перевищувала 85%. Аналогічна ситуація з хімічною мобілізацією урану (VI) - в кислій області рН вилужування металу відбувалось більш ефективно. Процес бактеріального вилужування достатньо ефективний також при наявності в грунті декількох металів. Встановлено, що уран, кобальт та мідь міцніше зв`язані з грунтом, ніж стронцій, який частково (на 20%) переходив у рідку фазу під впливом розчину поживних солей. В результаті обробки грунту, забрудненого металами, відбувалось не тільки вилучення металів із грунту, але й зміна деяких властивостей грунтової суспензії.

В процесі вилужування, пов`язаного з метаболізмом глюкози, швидкість седиментації очищеного грунту була вищою у два рази, ніж в процесі метаболізму ацетату, та в три рази вище, ніж грунту, який не підлягав обробці мікроорганізмами (табл.4). Обидві металорезистентні культури, які росли на ацетаті, виявляли седиментаційні властивості в грунтових суспензіях. При цьому грунт осідав у три рази швидше, ніж в контрольних зразках (рН суспензії 6,2 та 7,2). Слід зазначити, що інтродукція вивчених бактеріальних культур у грунтові суспензії веде до значних змін їх дисперсного стану.

Таблиця 4. Седиментація грунту після мікробіологічної обробки та відстоювання

Примітки: * Вихідна величина рН суміші грунту з мінеральним середовищем - 6,8; тривалість обробки 18 год; грунт забруднений сумішшю важких металів.

В реальному грунті, на відміну від грунтової суспензії, масообмінні процеси, які контролюються густиною, в`язкістю, мікроагрегатністю, більш ускладнені. В зв`язку з цим вивчено ефективність біоекстракції ВМ із грунту в стаціонарних умовах (in situ), які прийнято моделювати за допомогою грунтових колонок. Встановлено, що в процесі розвитку мікроорганізмів на ацетаті відбувалось підвищення величини рН на глюкозі - підкислення грунту.