Фармакогностичне вивчення листя деяких йорданських (палестинських) сортів винограду культурного

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНИЙ ФАРМАЦЕВТИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

Адель Ахмад Халіль Абуюсеф

УДК 582.783.2:577.151.02:577.152.32:542.3:613.24

ФАРМАКОГНОСТИЧНЕ ВИВЧЕННЯ ЛИСТЯ ДЕЯКИХ ЙОРДАНСЬКИХ (ПАЛЕСТИНСЬКИХ) СОРТІВ ВИНОГРАДУ КУЛЬТУРНОГО

15.00.02 - фармацевтична хімія та фармакогнозія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фармацевтичних наук

Харків - 2003

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі фармакогнозії Національного фармацевтичного університету (м. Харків), Міністерство охорони здоров'я України.

Науковий керівник: доктор фармацевтичних наук, професор КИСЛИЧЕНКО ВІКТОРІЯ СЕРГІЇВНА Національний фармацевтичний університет, професор кафедри фармакогнозії.

Офіційні опоненти: доктор фармацевтичних наук, професор СЕРБІН АНАТОЛІЙ ГАВРИЛОВИЧ Національний фармацевтичний університет, завідувач кафедри ботаніки;

кандидат фармацевтичних наук, старший науковий співробітник ДЕРКАЧ АНАТОЛІЙ ІВАНОВИЧ Державне підприємство “Державний науковий центр лікарських засобів”, завідувач сектором природних гетероциклічних сполук

Провідна установа: Київська медична академія післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика МОЗ України, кафедра фармацевтичної хімії та фармакогнозії

Захист відбудеться "21" березня 2003_ р. о 1000 годині на засіданні спеціалізованої Вченої ради Д 64.605.01 при Національному фармацевтичному університеті за адресою: 61002, м. Харків, вул. Пушкінська, 53.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного фармацевтичного університету (61168, м. Харків, вул. Блюхера, 4).

Автореферат розісланий "17" лютого 2003 року

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Л.М. Малоштан

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

ліпофільний виноград фармакологічний флавітин

Актуальність теми. В останній час все більшу популярність набувають лікарські рослини і препарати, які отримані на основі лікарської рослинної сировини. Низька токсичність, обмежений спектр побічної дії, висока біодоступність, можливість застосування при хронічних захворюваннях, в дитячій практиці та геронтології певним чином відрізняє фітопрепарати від синтетичних. Переважним є і те, що фармакологічний ефект препаратів рослинного походження зумовлений не однією речовиною, а комплексом природних сполук різного походження.

Необхідність комплексного використання рослин і наявність достатньої сировинної бази пояснює інтерес до вивчення плодово-ягідних культур. Завдяки наявності важливих груп біологічно активних речовин (БАР), ці рослини використовують з харчовими, дієтичними та лікувальними цілями. У зв'язку з цим, за об'єкт дослідження нами була обрана рослина - виноград культурний (Vitis vinifera L.) родини виноградні (Vitaceae). Тому комплексні фармакогностичні і фармакологічні дослідження деяких представників цієї родини та створення на їх основі нових лікарських засобів є актуальними.

З літературних даних відомо, що виноград містить різні БАР: вуглеводи, органічні кислоти, вітаміни, макро- та мікроелементи, фенольні та інші природні сполуки, які зумовлюють широкий спектр його фармакологічної дії. Найбільш вивченими є плоди винограду культурного, листя ж вивчені недостатньо. Тому об'єктом наших досліджень були обрані листя винограду культурного йорданських (палестинських) сортів Шамі, Дабугі та Бейруті.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана згідно плану науково-дослідних робіт Національного фармацевтичного університету з проблем МОЗ України (№ державної реєстрації 0198U007008) і проблемної комісії „Фармація” МОЗ України.

Мета та задачі дослідження. Мета даної роботи - вивчення БАР листя деяких найбільш поширених сортів винограду культурного флори Палестини, виділення з них комплексів БАР і створення на їх основі нових лікарських засобів, розробка аналітичної нормативної документації на лікарську рослинну сировину та отриманий з неї лікарський фітозасіб.

Для досягнення цієї мети були поставлені наступні задачі:

· провести попереднє фітохімічне дослідження листя йорданських (палестинських) сортів винограду культурного;

· виділити в індивідуальному стані речовини і встановити їх структуру;

· розробити технологію отримання фармакологічних засобів з листя сортів винограду культурного;

· провести кількісне визначення різних груп БАР в листі йорданських (палестинських) сортів винограду культурного та фармакологічних засобів, які отримані на їх основі;

· встановити основні анатомо-діагностичні ознаки рослинної сировини - листя винограду культурного та місця локалізації в них основних груп БАР;

· розробити аналітичну нормативну документацію (АНД) на сировину і фармакологічні засоби.

Об'єктом дослідження були фенольні сполуки, які зумовлюють фармакологічну активність багатьох лікарських засобів природного походження, та лікарська рослинна сировина, яка накопичує їх, - листя деяких йорданських (палестинських) сортів винограду культурного (Шамі, Дабугі і Бейруті).

Предметом дослідження стало виявлення, виділення і встановлення структури флавоноїдів, оксикоричних кислот, кумаринів, фосфоліпідів і стероїдів в листі винограду культурного; вивчення фармакологічної активності сумарного поліфенольного і полісахаридного комплексів; вивчення морфолого-анатомічних ознак і гістохімічні дослідження листя і черешків винограду культурного сорту Дабугі, як найбільш перспективного.

Методи дослідження. Якісний склад і кількісний вміст БАР визначали фармакопейними методами, використовували тонкошарову (ТШХ) та паперову хроматографію. Для виділення суми БАР з сировини використовували колонкову хроматографію на силікагелі і поліаміді та препаративну хроматографію на папері. Хімічну будову виділених сполук встановлювали на основі даних УФ-, ІЧ- та ПМР-спектрів та їх хімічних перетворень. Фармакологічні дослідження проводили in vitro та in vivo. Анатомічне і гістохімічне вивчення та фотографування зрізів листя та черешків, а також препаратів з поверхні досліджуваних об'єктів проводили за допомогою мікроскопів МБР-1 і МБІ-6 та фотоапаратом „ФЕД-5В” на плівці „Мікрат-200”, „Мікрат-300” та кольоровій „Кодак-200”.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше проведено комплексне фітохімічне вивчення БАР листя деяких йорданських (палестинських) сортів винограду культурного. Встановлено наявність в них амінокислот, вуглеводів, фосфоліпідів, стероїдів, фенольних сполук (оксикоричних кислот, оксикумаринів, флавоноїдів, дубильних речовин), ліпофільних речовин (хлорофілів, жирних кислот, каротиноїдів). З листя винограду культурного в індивідуальному стані виділено і досліджено 20 речовин: 4 оксикоричні кислоти, 3 оксикумарини, 11 флавоноїдів, 1 фосфоліпід та 1 стероїд. Дані сполуки вперше виділені з листя винограду культурного сорту Дабугі.

Вперше розроблена технологія отримання фармакологічного засобу з листя винограду культурного сорту Дабугі. Вивчена фармакологічна активність сумарного поліфенольного комплексу з листя винограду під умовною назвою „Флавітин”, який має виражену противиразкову, антиоксидантну, діуретичну, протизапальну, анальгетичну та жарознижуючу активності. Подана заявка на видачу патенту України на винахід (приоритетна справка № 2002119121 від 15.11.02) „Спосіб одержання поліфенольного комплексу „Флавітин” з протизапальною, анальгетичною, противиразковою і антиоксидантною активністю”.

Вперше вивчена цитопротекторна активність полісахаридного і сумарного поліфенольного комплексу з листя винограду культурного сорту Дабугі.

Вперше визначено кількісний вміст полісахаридів, оксикоричних кислот, флавоноїдів, дубильних речовин, аскорбінової кислоти, хлорофілів, каротиноїдів, жирних кислот в листі винограду культурного йорданських (палестинських) сортів Дабугі, Шамі і Бейруті.

Вперше встановлено основні морфолого-анатомічні ознаки листя і черешків винограду культурного сорту Дабугі. Гістохімічними реакціями встановлено місце локалізації основних БАР в черешках і листі винограду культурного сорту Дабугі.

Показана можливість використання листя деяких сортів винограду культурного (Шамі, Дабугі та Бейруті) для отримання нових фітозасобів.

Практичне значення роботи. Розроблена технологія отримання нового фармакологічного засобу з листя винограду культурного сорту Дабугі противиразкової, протизапальної, анальгетичної і жарознижуючої дії (умовна назва „Флавітин”). Розроблені проекти аналітичної нормативної документації (АНД) на „Листя винограду культурного сорту Дабугі”, „Сухий екстракт „Флавітин”. Результати досліджень впроваджені в навчальний процес кафедр фармакогнозії та ботаніки Національного фармацевтичного університету та Тернопільського медичного університету ім.. І.Я. Горбачевського.

Особистий внесок здобувача:

· проведено аналіз літературних даних про розповсюдження, хімічний склад і використання рослин роду виноград;

· визначені основні групи БАР: оксикоричні кислоти, оксикумарини, флавоноїди, фосфоліпід, стероїд, ці сполуки виділені в індивідуальному стані і встановлено їх будову;

· обгрунтована і розроблена технологія отримання з листя винограду культурного сорту Дабугі сухого екстракту "Флавітин", що являє собою сумарний поліфенольний комплекс;

· вивчено анатомічну будову листя винограду культурного сорту Дабугі;

· розроблені проекти АНД на „Листя винограду культурного сорту Дабугі”, „Сухий екстракт „Флавітин”.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи доповідались на науково-практичній конференції „Вчені України - вітчизняній фармації” (Харків, 2000); республіканській науковій конференції „Научные направления в создании лекарственных средств в фармацевтическом секторе Украины” (Харків, 2000); конференції, яка присвячена 100-річчу від дня народження Ю.Г. Борисюка „Сучасні напрямки розвитку фармакогнозії” (Харків, 2001); всеукраїнській науково-практичній конференції „Сучасні проблеми фармацевтичної науки і практики” (Харків, 2001); всеукраїнській науково-практичній конференції „Фармація ХХІ століття” (Харків, 2002).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 10 наукових робіт, з них 5 статей у журналах, 1 заявка на патент і 4 тези доповідей.

Обсяг і структура дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, шести розділів, загальних висновків, списку літературних джерел. Дисертація викладена на 197 сторінках машинописах, ілюстрована 4 схемами, 41 рисунком і 32 таблицями. Перелік використаних літературних джерел вміщує 216 найменувань, з них 58 іноземних.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

1. Рослини роду виноград та перспективи їх використання

Проведений аналіз літературних даних свідчить, що рослини роду виноград завдяки багатому вмісту біологічно активних речовин і широкому спектру використання в народній та науковій медицині є перспективними джерелами для отримання нових лікарських засобів. Найбільш вивченими є плоди винограду. В значно меншому обсязі проводилося вивчення вегетативних органів винограду культурного як в хімічному, так і в фармакологічному відношенні. Все це виправдовує доцільність поглибленого фітохімічного вивчення рослин роду Vitis.

2. Виділення і фітохімічне вивчення біологічно активних речовин з листя винограду культурного

Об'єктами наших досліджень були зразки листя винограду культурного, які заготовлені після збору врожаю плодів на території Палестини в 1999-2001 роках.

За результатами якісних реакцій і хроматографічного аналізу в листях винограду культурного сортів Дабугі, Шамі і Бейруті встановлено наявність вуглеводів, азотистих сполук, оксикоричних кислот, флавоноїдів, дубильних речовин, кумаринів, сапонінів, органічних кислот та макро- і мікроелементів.

Проведено визначення кількісного вмісту полісахаридів, амінокислот, оксикоричних кислот, флавоноїдів, дубильних речовин, аскорбінової кислоти, макро- і мікроелементів.

Для виділення БАР і розділення їх на індивідуальні компоненти використовували методи рідинно-рідинної екстракції, колонкової хроматографії на силікагелі та поліаміді, препаративної хроматографії на папері і в тонкому шарі сорбенту, дробної кристалізації.

У результаті з листя винограду культурного сорту Дабугі вперше виділено в індивідуальному стані 20 речовин: 4 оксикоричні кислоти, 3 оксикумарина, 11 флавоноїдів, 1 речовину фосфоліпідної і 1 стероїдної природи (таблиця 1).

Таблиця 1. Деякі фізичні властивості речовин, які виділені з листя винограду культурного сорту Дабугі

Примітка: А - н-бутанол-оцтова кислота-вода (4:1:2); Б - 15 % оцтова кислота; В - 3 % оцтова кислота; Г - хлороформ-25 % формамід

Хімічне вивчення виділених сполук

Структуру виділених речовин встановлено на підставі фізичних, хімічних, фізико-хімічних та біохімічних методів аналізу.

Оксикоричні кислоти. Речовини 2.17-2.20 за флуоресценцією плям на хроматограмах у фільтрованому УФ-світлі та якісними реакціями віднесені до гідроксикоричних кислот, що підтверджується даними УФ-спектрів.

В продуктах лужної деструкції речовини 2.17 (п-кумарова кислота) знайдено n-оксибензойну кислоту, речовини 2.19 (ферулова кислота) - ванілінову кислоту. Лужний гідроліз речовин 2.18 (кофейна кислота) та 2.20 (хлорогенова кислота) приводить до утворення еквімолекулярних кількостей кофейної та D-хінної кислот. Місце приєднання кофейної кислоти до D-хінної встановлено за результатами лактонізації цих сполук (таблиця 1).

На підставі проведених досліджень і результатів порівняння з вірогідними зразками речовини 2.17-2.20 відповідно ідентифіковані з 4-гідроксикоричною (п-кумаровую), 3,4-дігідроксикоричною (кофейною), 3-гідрокси-4-метоксикоричною (Федуловою) та 5-О-кофеїл-D-хінною (хлорогеновою) кислотами, які вперше знайдені в листях винограду культурного сорту Дабугі.

Кумарини. Здатність розщеплюватися під дією йодистоводороної кислоти у середовищі рідкого фенолу та оцтового ангідриду до кумарину дозволило віднести речовини 2.03-2.05 до похідних кумарину.

В ІЧ-спектрах досліджуваних речовин є смуги поглинання гідроксильних груп в області 3350-3225 см-1, а також метоксигруп - в області 2985-2843 см-1 для речовини 2.03. За даними фізико-хімічних властивостей, молекулярної маси, елементного складу, УФ- та ІЧ-спектрів, а також властивостей продуктів ацетилування, метилування та дезметилювання речовина 2.03 ідентифікована з 6-метокси-7-оксикумарином (скополетином), речовина 2.04 - з 7-оксикумарином (умбеліфероном), речовина 2.05 - з 6,7-діоксикумарином (ескулетином) (таблиця 1).

Флавоноїди. Флавоноїдна природа речовин 2.06-2.16 підтверджується результатами якісних реакцій та даними спектрального аналізу. В ІЧ-спектрах цих сполук присутні смуги поглинання, характерні для флавоноїдів: в області 3400-2900 см-1 (фенольні гідроксили), 1665-1615 см-1 (карбонільна група ?-пірону), 1640-1450 см-1 (валентні коливання ароматичних кілець).

Результати якісних реакцій та УФ-спектроскопії свідчили про належність досліджуваних речовин до похідних флавонову.

За рухомістю на хроматограмах в різних системах розчинників, а також за результатами ціанідинової реакції за Бріантом речовини 2.06, 2.07, 2.09, 2.10 віднесені до агліконів, а речовини 2.08, 2.11-2.14 та 2.16 - до глікозидів.

Схема хімічних перетворень на прикладі речовини 2.14 представлена на рисунку 1.

Речовина 2.14 являє собою кристали жовто-зеленого кольору з температурою топлення 236-2400С (етанол). Темне забарвлення плями на хроматограмі в УФ-світлі дозволяє припустити, що ця сполука є флавон або флавоном, у якого заміщена оксигрупа при С-3.

Кислотний гідроліз речовини 2.14 відбувався у відносно м'яких умовах (3 % сірчана кислота, 1000С, 2 години), що вказувало на можливість приєднання вуглеводного компоненту при С-3 флавоноїдного ядра. Речовина 2.14 не гідролізувалася 0,5 % розчином лугу, що також підтверджувало вище наведене припущення. В гідролізаті знайдено D-галактозу та аглікон, який за фізико-хімічними властивостями ідентичний кверцетину. Отримані при кислотному гідролізі еквімолекулярні кількості аглікону і цукрового компоненту характеризували досліджуєму речовину як монозид.

Для підтвердження будови речовини 2.14 нами було проведено ацетилювання. Ацетилування проводили оцтовим ангідридом в присутності кислих і основних каталізаторів (концентрованої сірчаної кислоти, піридину або ацетату натрію). При ацетилуванні флавоноли не змінюються і в процесі реакції всі вільні ОН-групи заміщуються ацетильними радікалами. Це було використано нами для хімічних перетворень при встановленні структури виділених речовин (речовина 2.14 - гіперозид).

Місце приєднання вуглеводного залишку встановлювали порівнянням УФ-спектрів глікозиду та аглікону. Відсутність у спектрі глікозиду батохромного зсуву максимуму першої смуги поглинання в присутності цирконілу нітрату та лимонної кислоти і наявність його в агліконі в аналогічних умовах підтверджує, що D-галактоза зв'язана з агліконом через оксигрупу при С-3.

Відщеплення D-галактози при ферментативному гідролізі глікозиду рамнодіастазою, негативний показник питомих обертань самого глікозиду ([?]20D - 58,90, етанол), а також наявність в ІЧ-спектрі трьох смуг поглинання в області 1100-1010 см-1 і смуг при 890 см-1 дозволило припустити наявність ?-глікозидного зв'язку та піранозного циклу в D-галактозі.

Рис. 1. Схема хімічних перетворень флавонолів на прикладі гіперозиду (2.14)