Размещено на http://www.allbest.ru/

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «ПЕРМСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ имени академика Е.А. Вагнера федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Полимеразная цепная реакция

Методические рекомендации

С.В. Поспелова, М.В. Кузнецова

Пермь 2007

УДК 616-078.33

ББК 53.4

Авторы: С.В. Поспелова - канд. мед. наук, доцент кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии, М.В. Кузнецова - канд. биол. наук, сотрудник ИЭГМ УрО РАН

Поспелова, С.В.

Полимеразная цепная реакция: метод. рекомендации / С.В. Поспелова, М.В. Кузнецова; ГОУ ВПО ПГМА им. ак. Е.А. Вагнера Росздрава. - Пермь, 2007. - 35 с.

Предназначены для самостоятельной работы студентов всех факультетов: лечебного, педиатрического, медико-профилактического, стоматологического и факультета высшего сестринского образования (ФВСО) медицинской академии.

Рецензент:

зав. кафедрой биологии, экологии и медицинской генетики ПГМА, профессор А.Б. Виноградов

Печатается по решению центрального координационного методического совета ГОУ ВПО ПГМА им. ак. Е.А. Вагнера Росздрава

УДК 616-078.33

ББК 53.4

© Поспелова С.В., Кузнецова М.В., 2007

© ГОУ ВПО ПГМА им. ак. Е.А. Вагнера Росздрава, 2007

Полимеразная цепная реакция в клинической микробиологической диагностике

Современная медицина успешно использует достижения естественных наук, интенсивно применяет новые технологии для диагностики и лечения заболеваний. В последнее время к традиционным микробиологическим и иммунологическим методам лабораторной диагностики инфекционных заболеваний добавились новые, основанные на использовании молекулярно-генетических технологий. Применение этих методов не только в научных целях, но и в практической лабораторной диагностике стало возможным в немалой степени благодаря созданию в середине 80-х годов процесса искусственного многократного копирования ДНК и дальнейшему стремительному развитию этой технологии, в настоящее время известной как полимеразная цепная реакция (ПЦР). Менее чем за 15 лет своего существования ПЦР сделала рутинным анализ специфических ДНК-последовательностей многих патогенных микроорганизмов. Универсальность, высокая чувствительность и относительная простота исполнения сделали метод ПЦР незаменимым для решения различных задач клинической диагностики, таких как прямое обнаружение и идентификация возбудителей заболеваний, молекулярное типирование и исследование свойств патогенных микроорганизмов, анализ мутаций, связанных с генетическими заболеваниями у человека, идентификация личности человека.

Что такое ПЦР?

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - искусственный процесс многократного копирования (амплификации) специфической последовательности ДНК, осуществляемый in vitro (рис. 1). Копирование ДНК при ПЦР осуществляется специальным ферментом - ДНК-полимеразой, как и в клетках живых организмов. ДНК-полимераза, двигаясь по одиночной цепи ДНК (матрице), синтезирует комплементарную ей последовательность ДНК. Важно, что ДНК-полимераза не может начать синтез цепи ДНК «с нуля», ей необходима короткая «затравочная» цепь РНК или ДНК, к которой она может начать присоединять нуклеотиды. Основной принцип ПЦР состоит в том, что реакция полимеризации (синтеза полимерной цепи ДНК из мономерных нуклеотидных звеньев) инициируется специфическими праймерами (короткими фрагментами «затравочной» ДНК) в каждом из множества повторяющихся циклов. Специфичность ПЦР определяется способностью праймеров «узнавать» строго определенный участок ДНК и связываться с ним согласно принципу молекулярной комплементарности.

В обычной реакции ПЦР используется пара праймеров, которые «ограничивают» амплифицируемый участок с двух сторон, связываясь с противоположными цепями ДНК-матрицы. Для многократного увеличения количества копий исходной ДНК нужна цикличность реакции. Как правило, каждый из последовательно повторяющихся циклов ПЦР состоит из трех этапов:

1) денатурации, или «плавления» двуцепочечной ДНК: перед началом реакции ДНК-мишень является двуцепочечной, при температуре 94-95⁰ С комплиментарные цепи ДНК расходятся - переходят в одноцепочечное состояние;

2) связывания (отжига) праймеров: при температуре, оптимальной для выбранных праймеров, происходит их связывание с комплиментарным участком матричной ДНК;

3) элонгации, или удлинения цепи: ДНК-полимераза присоединяет нуклеотиды к праймерам, синтезируя новые цепи ДНК, которые становятся мишенью для праймеров в последующих циклах ПЦР.

Смена этапов каждого цикла осуществляется путем изменения температуры реакционной смеси (см. рис. 1).

Рис. 1 Основные этапы цикла ПЦР

Сначала праймеры могут связаться только с определенной последовательностью исходной ДНК, но в последующих циклах они связываются с копиями этой последовательности, синтезированными в предыдущих циклах. При этом количество основного продукта ПЦР (копии последовательности ДНК, ограниченной праймерами) теоретически удваивается в каждом цикле. Если на начальном цикле в исследуемом материале была только одна ДНК-мишень, после первого цикла будет уже две копии, после двух циклов - 4 копии, результатом третьего цикла будет 8 копий, а тридцать пятого - уже 68 биллионов копий (рис. 2).

Рис. 2 Процесс многократного копирования ДНК-мишени в ходе последовательно сменяющихся циклов

Основным методом анализа продуктов реакции, который традиционно применяется во многих лабораториях для обнаружения амплифицированной ДНК и определения ее размера, является метод гель-электрофореза с последующим окрашиванием красителем, специфичным к ДНК, например бромистым этидием (рис. 3).

Контроль - различные фрагменты ДНК с известным количеством составляющих их нуклеотидов. Известно, что дистанция между различными фрагментами имеет логарифмическую зависимость от их размера, массы. Линия 1 - обнаружены ПЦР-фрагменты длиной приблизительно 1850 оснований. Линия 2 и 4 - фрагменты длиной около 800 оснований.

Рис. 3 Анализ продуктов реакции методом гель-электрофореза

Линия 3 - не выявлены искомые фрагменты, отрицательный результат реакции. Линия 5 - множественные линии сформировались потому, что праймеры оказались комплиментарны к нескольким фрагментам ДНК различной длины: около 550, 800 и 1500 оснований.

Усовершенствование технологии ПЦР

Первоначально для осуществления ПЦР использовали обычные ДНК-полимеразы, которые подвергались температурной инактивации в каждом цикле на этапе денатурации ДНК. Полимеразу приходилось многократно добавлять в реакционную смесь, что было довольно трудоемко и не позволяло автоматизировать процесс.

В реакции используются термостабильные ДНК-полимеразы, выдерживающие высокую температуру на всех этапах цикла ПЦР в течение нескольких десятков циклов. Количество коммерчески доступных термостабильных ДНК-полимераз, отличающихся некоторыми своими свойствами, достаточно велико. Наиболее часто используется Taq-полимераза, первоначально выделенная из термофильного микроорганизма Thermus aquaticus. Другие полимеразы чаще применяются для особых приложений ПЦР. Современные коммерческие препараты термостабильных полимераз обеспечивают, как правило, стабильную воспроизводимую активность, что позволяет использовать технологию ПЦР в стандартной лабораторной практике.

Техническое оформление смены температуры реакционной смеси также стремительно развивалось в последнее время. Сначала ПЦР осуществлялась при помощи трех водяных бань, настроенных на разную температуру: для денатурации ДНК, отжига праймеров и полимеризации. Пробирки переносились из одной водяной бани в другую «по кругу», благодаря чему происходила смена температуры на разных этапах цикла. Существовали и варианты приборов, где в водяную баню, в которой находились пробирки с реакционной смесью, поочередно подавалась вода разной температуры. Смена циклов в этих случаях занимала много времени, и процесс плохо поддавался автоматизации. Для осуществления ПЦР в основном используются приборы (термоциклеры), которые изменяют температуру автоматически на основе заданной программы. В термоциклерах пробирки с реакционной смесью помещаются в металлический блок, температура которого изменяется с большой скоростью, что сокращает продолжительность каждого цикла ПЦР.

Современные термоциклеры приспособлены для использования специальных тонкостенных пластиковых пробирок для реакционной смеси, что позволяет ускорить теплообмен между блоком прибора и реакционной смесью и в конечном итоге дополнительно сократить время проведения реакции.

Таким образом, стандартная ПЦР может быть осуществлена за 1-3 ч. Многие приборы позволяют программировать специальные усложненные температурные профили, необходимые для специфических модификаций процесса ПЦР.

Параллельно с усовершенствованием технологии ПЦР развивались и методы анализа продуктов реакции. Метод гель-электрофореза с последующим окрашиванием красителем, специфичным к ДНК, например бромистым этидием, традиционно применяется во многих лабораториях для обнаружения амплифицированной ДНК и определения ее размера. Использование гибридизации с внутренними ДНК-зондами позволяет в ряде случаев значительно повысить чувствительность и специфичность детектирования ПЦР-продуктов. Благодаря отсутствию необходимости в подготовке и проведении электрофоретического разделения, возможности автоматизации для анализа большого количества образцов и использования нерадиоактивного формата детектирования, этот метод становится все более распространенным. В некоторых случаях применение специальных флюоресцентных «маркеров» позволяет контролировать проведение амплификации или детектирование конечных продуктов ПЦР непосредственно в реакционной пробирке.

Использование ПЦР в медицинской микробиологии

Среди множества различных направлений клинической диагностики медицинская микробиология занимает, пожалуй, лидирующее место по количеству и разнообразию приложений, использующих технологию ПЦР. Внедрение в практику этого метода наряду с серологической диагностикой существенно расширило возможности современной клинической микробиологии, основу которой до сих пор составляют методы выделения и культивирования микроорганизмов на искусственных питательных средах или в культуре клеток.

Возможности и ограничения традиционных методов культивирования

Традиционный для микробиологических лабораторий культуральный метод диагностики, как правило, хорошо оправдывает себя для выявления и исследования таких свойств, как чувствительность к антибиотикам, вирулентность легкокультивируемых микроорганизмов. Однако некоторые микроорганизмы (пневмококки, гемофилы, нейссерии, микоплазмы, облигатные анаэробы и др.) могут быть чрезвычайно чувствительными к условиям забора клинического материала, транспортировки и культивирования, наличию специальных факторов роста или способны к размножению in vitro только в культуре клеток (вирусы, хламидии, риккетсии).

Медленный рост на искусственных средах таких микроорганизмов, как микобактерии и грибы, является еще одним естественным ограничением, связанным с использованием культурального метода для диагностики этих микроорганизмов. Кроме того, работа с живыми культурами выделенных возбудителей, причем не только особо опасных, но иногда и условно-патогенных, может представлять угрозу для здоровья персонала лаборатории.

Среди возбудителей болезней человека известны также и некультивируемые виды бактерий, например Mycobacterium leprae, Treponema pallidum, и многие виды вирусов, включая вирусы папилломы человека и гепатита С, попытки выращивания которых в клеточной культуре пока остаются безуспешными. Наконец, даже при успешном культивировании существует необходимость последующей идентификации выделенных микроорганизмов.

Традиционные микробиологические методы идентификации основаны на использовании различных фенотипических тестов, таких как выявление специфической ферментативной активности, способности метаболизировать сахара или поддерживать рост на средах с селективными добавками. Сложность стандартизации условий подобных тестов, а также естественная фенотипическая вариабельность, присущая многим микроорганизмам, могут быть причиной неправильной идентификации.

Использование ПЦР для прямой диагностики и идентификации возбудителей инфекционных заболеваний

В тех случаях, когда использование культуральных методов является проблематичным или связано с недостаточной диагностической эффективностью, возможность замены биологической амплификации (то есть роста на искусственных средах) на ферментативное удвоение нуклеиновых кислот in vitro с помощью ПЦР представляется особенно привлекательной. Существуют различные подходы к использованию ПЦР для диагностики возбудителей инфекций. Наиболее распространенный вариант ПЦР (specific PCR) предусматривает использование праймеров, комплементарных специфической последовательности ДНК, характерной для строго определенного вида микроорганизма. Например, ПЦР-амплификация специфического участка гена, кодирующего главный белок наружной мембраны (МОМР) Chlamydia trachomatis, в сочетании с нерадиоактивной гибридизацией для детектирования продуктов реакции позволяет обнаружить единичные копии хламидийной ДНК в исследуемых образцах. При этом ПЦР значительно превосходит по диагностической эффективности культивирование и методы прямого обнаружения хламидийного антигена (микроиммунофлюоресценцию и иммуноферментный анализ), традиционно используемые для выявления С. trachomatis.

Имеется также возможность использования сразу нескольких пар видоспецифических праймеров в одной реакционной пробирке для одновременной амплификации ДНК различных возбудителей. Такая модификация получила название множественной ПЦР (multiplex PCR). Множественная ПЦР может быть использована для выявления этиологической роли различных микроорганизмов, вызывающих заболевания определенного типа. Так, например, описаны варианты применения множественной ПЦР для одновременного обнаружения двух (С. trachomatis и N. gonorrhoeae при заболеваниях урогенитального тракта) или даже четырех возбудителей (И. influenzae, S. pneumoniae, M. catarrhalis и A. otitidis при хроническом гнойном отите).

Альтернативный подход в ПЦР-диагностике связан с использованием универсальных праймеров, которые позволяют амплифицировать фрагменты генов, присутствующих у всех микроорганизмов определенной таксономической группы. Количество видов, которые могут быть выявлены с помощью этого метода, может ограничиваться как рамками небольших систематических групп (рода, семейства), так и крупных таксонов на уровне порядка, класса, типа. В последнем случае мишенью для ПЦР чаще всего являются рибосомные гены (16S и 23S рРНК), которые имеют сходную структуру у различных прокариотических микроорганизмов.

Использование праймеров, комплементарных консервативным участкам этих генов, позволяет амплифицировать ДНК большинства видов бактерий. Полученные в результате ПЦР фрагменты рибосомных генов могут быть затем проанализированы с помощью различных лабораторных методов с целью идентификации бактерий, которым они принадлежат. Наиболее точным методом «молекулярной» идентификации является определение полной нуклеотидной последовательности (секвенирование) амплифицированной ДНК и сравнение ее с соответствующими последовательностями известных видов.

Несмотря на наличие автоматизированных систем, использующих описанный принцип идентификации, на практике обычно используются менее трудоемкие и дорогостоящие методы, которые тем не менее позволяют достоверно выявлять определенные различия в последовательности ДНК-фрагментов. Наиболее распространенными являются методы, основанные на анализе расположения в ДНК участков расщепления ферментами-рестриктазами (метод ПДРФ (RFLP) - полиморфизм длины рестрикционных фрагментов), или на определении электрофоретической подвижности ДНК в одноцепочечной форме (метод SSCP-одноцепочечный конформационный полиморфизм).

ПЦР с использованием универсальных праймеров может применяться как для идентификации выделенных в чистой культуре микроорганизмов, так и для прямой диагностики широкого спектра возбудителей непосредственно в клинических образцах. Следует однако отметить, что чувствительность ПЦР «широкого спектра», как правило, ниже по сравнению с «видоспецифическими» тест-системами. Кроме того, ПЦР с универсальными праймерами обычно не используется для исследования образцов, в которых может находиться большое количество различных микроорганизмов, из-за трудности анализа продуктов реакции, полученных в результате амплификации ДНК разных видов.

Методы молекулярного типирования микроорганизмов на основе ПЦР

ПЦР широко используется не только для диагностики и идентификации, но и для субвидового типирования и анализа генетического родства (клональности) выделенных штаммов микроорганизмов, особенно при проведении эпидемиологических исследований. По сравнению с традиционными фенотипическими методами (био-, фаго- и серотипированием) генотипирование на основе ПЦР отличается универсальностью, более глубоким уровнем дифференциации, возможностью использования количественных методов для оценки идентичности штаммов и высокой воспроизводимостью. Описано много методов генотипирования, которые можно рассматривать как производные технологии ПЦР.

Несмотря на разнообразие методов ПЦР-типирования, общим для большинства из них является использование гель-электрофореза для разделения фрагментов ДНК разной длины, полученных от каждого отдельного штамма. При этом сравнительный анализ индивидуальных электрофоретических профилей, проводимый визуально или с помощью компьютера, позволяет оценить степень генетического родства исследуемых штаммов.

Использование ПЦР для выявления лекарственной устойчивости у микроорганизмов

В последнее время ПЦР все чаще используется для исследования различных свойств патогенных микроорганизмов, в частности для выявления устойчивости отдельных видов возбудителей к определенным лекарственным препаратам. Как правило, использование ПЦР для определения чувствительности микроорганизмов является целесообразным лишь в тех случаях, когда традиционные фенотипические методы неприменимы или недостаточно эффективны. Например, определение чувствительности Mycobacterium tuberculosis к противотуберкулезным препаратам с помощью культуральных методов занимает обычно от 4 до 8 нед. Кроме того, результаты фенотипических тестов в подобных случаях могут быть искажены в связи со снижением активности антимикробных препаратов в процессе длительного культивирования микроорганизмов. Исследование молекулярных механизмов лекарственной устойчивости М. tuberculosis и некоторых других возбудителей позволило разработать методы на основе ПЦР для быстрого выявления генетических маркеров резистентности.

Для подобного анализа обычно используется ДНК или РНК возбудителя, выделенного в чистой культуре. Однако в некоторых случаях имеется возможность прямого ПЦР-анапиза на антибиотикорезистентность без предварительного культивирования возбудителя. Исследуемый образец клинического материала при этом используется как источник ДНК-мишени для ПЦР, а откопированный ПЦР-продукт подвергается анализу с целью выявления мутаций, связанных с антибиотикорезистентностью. Разработан, например, метод, позволяющий с помощью ПЦР обнаружить у пациентов, страдающих туберкулезным менингитом, устойчивость возбудителя к рифампицину.

Существуют, однако, естественные ограничения для использования генетических методов оценки лекарственной устойчивости микроорганизмов:

* данные о конкретных генетических механизмах резистентности могут отсутствовать;

* резистентность к определенным препаратам часто бывает связана с различными механизмами и мутациями в различных генах, которые независимо влияют на фенотип.

Например, резистентность грамотрицательных бактерий к аминогликозидным антибиотикам может быть вызвана продукцией различных аминогликозидмодифицирующих ферментов или изменением проницаемости клеточной стенки. В этом случае результаты ПЦР-анализа, который всегда характеризует строго определенный специфический участок ДНК, не могут служить основанием для оценки чувствительности микроорганизма в целом.

Кроме того, отсутствие международных стандартов и рекомендаций по использованию ПЦР для определения чувствительности к антимикробным препаратам является дополнительным фактором, ограничивающим возможность широкого применения этого подхода в практической диагностике.

Преимущества и недостатки метода ПЦР (как метода диагностики инфекционных заболеваний)

1. Прямое определение наличия возбудителей.

Многие традиционные методы диагностики, например иммуноферментный анализ, выявляют белки-маркеры, являющиеся продуктами жизнедеятельности инфекционных агентов, что дает лишь опосредованное свидетельство наличия инфекции. Выявление специфического участка ДНК возбудителя методом ПЦР дает прямое указание на присутствие возбудителя инфекции.

2. Высокая специфичность.

Высокая специфичность метода ПЦР обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного возбудителя фрагмент ДНК. Специфичность задается нуклеотидной последовательностью праймеров, что исключает возможность получения ложных результатов, в отличие от метода иммуноферментного анализа, где нередки ошибки в связи с перекрестно-реагирующими антигенами.

3. Высокая чувствительность.

Метод ПЦР позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или вирусов. Теоретически для осуществления реакции достаточно всего одной копии искомой ДНК (РНК) -последовательности в исследуемом материале, что позволяет использовать ее даже в тех случаях, когда серологические и бактериологические исследования не дают положительного результата вследствие крайне низкого микробного титра (например при контроле инфекционной безопасности донорской крови и органов, диагностике хронических и латентных инфекций).

4. Универсальность процедуры выявления различных возбудителей.

Материалом для исследования методом ПЦР служит ДНК возбудителя. Метод основан на выявлении фрагмента ДНК или РНК, являющегося специфичным для конкретного организма. Сходство химического состава всех нуклеиновых кислот позволяет применять унифицированные методы проведения лабораторных исследований. Это дает возможность диагностировать несколько возбудителей из одной биопробы. В качестве исследуемого материала могут использоваться различные биологические выделения (слизь, моча, мокрота), соскобы эпителиальных клеток, кровь, сыворотка.

5. Высокая скорость получения результата анализа.

Для проведения ПЦР-анализа не требуется выделение и выращивание культуры возбудителя, что занимает большое количество времени. Это особенно заметно при исследовании медленнорастущих микроорганизмов. Однако даже в случае быстрорастущих культур оперативность ПЦР может быть полезной. Например, выделение, идентификация и определение лекарственной устойчивости у штаммов метициллинрезистентного золотистого стафилококка (MRSA) с помощью традиционных микробиологических методов требуют не менее 3-5 дней, в то время как ПЦР-анализ позволяет выявить MRSA менее чем за сутки.

6. Возможность диагностики не только острых, но и вялотекущих, скрытых инфекций.

Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики труднокультивируемых, некультивируемых и персистирующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях. Применение ПЦР-диагностики также очень эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов. Методом ПЦР возможно выявление возбудителей не только в клиническом материале, полученном от больного, но и в материале, получаемом из объектов внешней среды (вода, почва и т.д.).

Однако следует отметить, что метод ПЦР лишь дополняет спектр традиционных методов, используемых в микробиологической диагностике. Наиболее рационально и эффективно применение ПЦР для обнаружения микроорганизмов, трудно-выявляемых в лабораторных условиях, атипичных форм бактерий. К ним также относятся внутриклеточные паразиты и микроорганизмы, способные длительно существовать в организме хозяина.

Наиболее эффективно и обоснованно использование метода в урогинекологической практике - для выявления хламидиоза, уреаплазмоза, гонореи, герпеса, гарднереллеза, микоплазменной инфекции, ВПЧ-вируса папилломы человека; в пульмонологии - для дифференциальной диагностики вирусных и бактериальных пневмоний, туберкулеза; в гастроэнтерологии - для выявления геликобактериоза; в клинике инфекционных заболеваний - в качестве экспресс-метода диагностики сальмонеллеза, дифтерии, вирусных гепатитов В, С и G; в гематологии - для выявления цитомегаловирусной инфекции, онковирусов. Высокоспецифичная, чувствительная и быстрая диагностика многих тяжелых заболеваний способствует не только их эффективному лечению, но и предотвращению распространения.

В то же время экстремальная чувствительность ПЦР требует новых подходов к клинической интерпретации результатов, получаемых в лаборатории. В частности, выявление в клинических образцах сапрофитных и условно-патогенных микроорганизмов может не означать наличия патологического процесса и поэтому не может быть автоматически интерпретировано как диагноз, особенно на фоне благополучной клинической картины у пациента. По этой же причине следует с осторожностью использовать ПЦР для анализа образцов с характерным полимикробным сообществом (кал и материал, полученный из верхних дыхательных путей и гениталий).

Экстремальная чувствительность реакции ферментативной амплификации ДНК является одновременно ахиллесовой пятой технологии ПЦР. Этот парадокс известен также как проблема чувствительности ПЦР к загрязнению (контаминированию) посторонними молекулами ДНК, которые могут служить мишенью для используемого набора праймеров. Даже единичные молекулы загрязняющей ДНК могут быть многократно копированы в процессе ПЦР, приводя к образованию целевого ДНК-продукта, а следовательно, к ложноположительному результату.

Существуют разные источники ПЦР-загрязнения. Наиболее частым является контаминирование реакционной смеси ДНК-продуктами предыдущих реакций. В результате ПЦР в каждой реакционной пробирке может образовываться более миллиарда копий исходной последовательности ДНК, каждая из которых, в свою очередь, является потенциальной мишенью для последующей амплификации. В процессе анализа синтезированные фрагменты ДНК могут легко распространяться в лаборатории в виде аэрозоля (при открывании реакционных пробирок), через руки исследователей и лабораторные принадлежности, загрязняя реактивы и материалы, используемые в ПЦР, и приводя к ложноположительному результату анализа образцов, в которых исходно отсутствовала ДНК искомого возбудителя. В случае высокой концентрации микробной ДНК в исследуемом клиническом материале ПЦР-загрязнение может происходить при переносе даже небольшого количества ДНК из одного образца в другой, например, через поверхность перчаток при открывании пробирок с образцами или через приспособления, используемые для механической гомогенизации тканей.

При использовании ПЦР с универсальными праймерами (см. выше) источником загрязняющей ДНК могут служить коммерческие препараты ДНК-полимераз и других реактивов, применяемых в ПЦР. В связи с опасностью получения ложноположительных результатов в лабораториях, постоянно использующих ПЦР в диагностических целях, необходимы соблюдение строгих требований и специальные подходы, направленные на снижение риска ПЦР-загрязнения.

Одним из наиболее существенных требований, предъявляемых к диагностическим ПЦР-лабораториям, является необходимость разделения лаборатории на «пред-ПЦР-помещения», где осуществляются обработка образцов и приготовление реакционных смесей, и «после-ПЦР-помещения», где анализируются продукты реакции. Обязательными являются также раздельное хранение реактивов и материалов, используемых на разных этапах ПЦР, максимальное использование одноразовых пластиковых материалов на этапе, предшествующем амплификации, и регулярная обработка помещений ультрафиолетовым (УФ) излучением, повреждающим загрязняющие последовательности ДНК.

Дополнительные меры, обеспечивающие защиту ПЦР от загрязнения, могут включать использование ламинарных боксов для работы с образцами и приготовления ПЦР-смесей, специальные биохимические (урацилгликозилаза) и физико-химические (УФ излучение + изопсорален) методы инактивации ПЦР-продуктов. Особенно важно для оценки достоверности данных ПЦР-анализа и отсутствия ложноположительных результатов регулярное исследование отрицательных контролей (не содержащих ДНК-мишень) параллельно с клиническими образцами.

Помимо опасности получения ложноположительных результатов существует и обратная проблема, связанная со снижением чувствительности ПЦР, следствием которого являются ложноотрицательные результаты. На практике вопрос о соотношении теоретической (то есть максимально возможной) и реальной чувствительности ПЦР не всегда решается однозначно. Чувствительность ПЦР может быть снижена вследствие многих причин, наиболее важной из которых является ингибирование реакции компонентами биологических образцов.

Ингибиторы ПЦР могут присутствовать в образцах крови (гемоглобин), мокроты, мочи, биопсийном материале. Различные вещества, например часто используемые антикоагулянты (особенно гепарин) или компоненты кровяных питательных сред, могут также подавлять реакцию амплификации ДНК. Ингибирование ПЦР обычно можно выявить путем искусственного добавления ДНК-мишени к исследуемому образцу и ее последующей амплификации. Отрицательный результат, полученный с заведомо положительным контролем, может говорить о наличии ингибиторов, для устранения которых необходимо использовать разведение образца или специальные методы подготовки проб.

Серьезную проблему представляет также выбор конкретных методов подготовки клинических образцов к исследованию с помощью ПЦР. В настоящее время не существует универсальных подходов к выделению ДНК разных видов микроорганизмов из различных источников. Быстрые методы подготовки проб, предусматривающие возможность автоматизации, иногда не позволяют достичь требуемого уровня чувствительности. С другой стороны, многоэтапные методики, позволяющие очистить и сконцентрировать микробную ДНК для ПЦР-анализа, оказываются трудоемкими и могут увеличивать риск контаминирования образцов.

Наконец, ПЦР является дорогостоящей. Для ее реализации необходимо комплексное оснащение лаборатории, включая не только термоциклер и устройство для ДНК-электрофореза, но и отдельные центрифуги, холодильники, дозаторы и другое оборудование. Затраты на ПЦР включают высокую стоимость реактивов и расходуемых материалов. Поэтому только в случае выявления и исследования труднокультивируемых возбудителей ПЦР может быть сопоставима по стоимости с традиционными микробиологическими методами.

Заключение

Уже сейчас ПЦР является незаменимым инструментом в диагностике и исследовании многих возбудителей инфекционных болезней, а количество микробиологических приложений ПЦР продолжает стремительно расти. Дальнейшее развитие и внедрение этого метода в практику клинических диагностических лабораторий может быть связано с совершенствованием и стандартизацией самой технологии, особенно этапов подготовки образцов и анализа продуктов реакции.

Кроме того, возможность использования ПЦР для решения многих практических задач в области микробиологической диагностики зависит от ответов на следующие принципиальные вопросы.

1. Как быстро микробная ДНК элиминируется из различных тканей после гибели возбудителя в результате проводимого лечения и в каких случаях ПЦР может быть использована для контроля эффективности антимикробной терапии?

2. Можно ли при помощи ПЦР дифференцировать состояния колонизации, латентной или активной инфекции и реинфекции?

3. Может ли обнаружение микробной ДНК в «стерильных» в норме биологических жидкостях (кровь, спинномозговая жидкость) служить показателем патологического процесса?

Несомненно, накопление опыта использования ПЦР и сравнение результатов ПЦР-анализа с данными других диагностических методов позволит найти ответы на эти вопросы.

Рекомендуемая литература

полимеразный цепная реакция молекулярный

1. Воробьев, А.А. Основы медицинской биотехнологии / А.А. Воробьев. М., 1990.

2. Медицинская микробиология / под ред. В.И. Покровского. М., 1998.

3. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология / под ред. Л.Б. Борисова. М., 2001.

4. Микробиология и иммунология / под ред. А.А. Воробьева. М., 1999.

5. Микробиология и иммунология для студентов ВСО / под ред. А.А. Воробьева. М., 2000.

6. Микробиология с вирусологией и иммунологией / под ред. Л.Б. Борисова, А.М. Смирновой. М., 1994.

Тестовый контроль по теме «Генетика микроорганизмов и ПЦР»

1. Генетическая информация у микроорганизмов заключена в следующих структурах клетки, за исключением:

1) нуклеоида;

2) плазмид;

3) ядрышек;

4) транспозонов;

5) - последовательностей.

2. Плазмида бактерий - это:

1) клеточный элемент, несущий генетическую информацию, функционирующий и размножающийся независимо от хромосомы хозяина;

2) участок ДНК, способный самостоятельно мигрировать из одной плазмиды в другую внутри бактерии, а также в хромосому или бактериофаг; самостоятельно не реплицируется;

3) участок ДНК, способный перемещаться в различные участки хромосомы бактерии, самостоятельно не реплицируется.

3. - последовательность бактерий - это:

1) клеточный элемент, несущий генетическую информацию, функционирующий и размножающийся независимо от хромосомы хозяина;

2) участок ДНК, способный самостоятельно мигрировать из одной плазмиды в другую внутри бактерии, а также в хромосому или бактериофаг; самостоятельно не реплицируется;

3) участок ДНК, способный перемещаться в различные участки хромосомы бактерии, самостоятельно не реплицируется.

4. Транспозон бактерий - это:

1) клеточный элемент, несущий генетическую информацию, функционирующий и размножающийся независимо от хромосомы хозяина;

2) участок ДНК, способный самостоятельно мигрировать из одной плазмиды в другую внутри бактерии, а также в хромосому или бактериофаг; самостоятельно не реплицируется;

3) участок ДНК, способный перемещаться в различные участки хромосомы бактерии, самостоятельно не реплицируется.

5. Перечислите функции плазмид:

а) репарационная (восстановление повреждённого клеточного генома);

б) регуляторная (компенсация метаболических дефектов);

в) кодирующая (внесение в бактерию информации о новых признаках);

г) перенос генетической информации из прокариотической в эукариотическую клетку.

1) если верно а, в;

2) если верно б, в;

3) если верно все.

6. Транспозоны обладают всеми перечисленными функциями, кроме:

1) регуляторной;

2) кодирующей;

3) мутагенной;

4) несут генетическую информацию о транспозиции (о собственном перемещении) с одного репликона на другой;

5) несут генетическую информацию о транспозиции (о собственном перемещении) в различные участки ДНК.

7. Инсертационные последовательности способны выполнять следующие функции, за исключением:

1) перемещаться с одного репликона на другой;

2) перемещаться в различные участки ДНК;

3) кодировать взаимодействие транспозонов, плазмид, фагов между собой и с хромосомой хозяина;

4) «выключать» ген, в который встроилась -последовательность, или служить промотором;

5) индуцировать мутации.

8. Какие типы бактериальных плазмид существуют?

а) ;

б) ;

в) Со;

г) Н;

д) ;

е) биодеградации.

1) если верно а, б, в;

2) если верно а, г, е;

3) если верно все.

9. Какой признак контролируют -плазмиды?

1) синтез бактериоцинов;

2) синтез половых ворсинок;

3) устойчивость к лекарственным препаратам;

4) синтез гемолизинов;

5) синтез протоксинов;

6) утилизацию некоторых органических соединений.

10. Какой признак контролируют -плазмиды?

1) синтез бактериоцинов;

2) синтез половых ворсинок;

3) устойчивость к лекарственным препаратам;

4) синтез гемолизинов;

5) синтез протоксинов;

6) утилизацию некоторых органических соединений.

11. Какой признак контролируют Со-плазмиды?

1) синтез бактериоцинов;

2) синтез половых ворсинок;

3) устойчивость к лекарственным препаратам;

4) синтез гемолизинов;

5) синтез протоксинов;

6) утилизацию некоторых органических соединений.

12. Какой признак контролируют Н-плазмиды?

1) синтез бактериоцинов;

2) синтез половых ворсинок;

3) устойчивость к лекарственным препаратам;

4) синтез гемолизинов;

5) синтез протоксинов;

6) утилизацию некоторых органических соединений.

13. Какой признак контролируют -плазмиды?

1) синтез бактериоцинов;

2) синтез половых ворсинок;

3) устойчивость к лекарственным препаратам;

4) синтез гемолизинов;

5) синтез протоксинов;

6) утилизацию некоторых органических соединений.

14. Какой признак контролируют плазмиды биодеградаций?

1) синтез бактериоцинов;

2) синтез половых ворсинок;

3) устойчивость к лекарственным препаратам;

4) синтез гемолизинов;

5) синтез протоксинов;

6) утилизацию некоторых органических соединений.

15. Бактериоцины - это:

1) синтетические препараты, используемые при химиотерапии инфекционных заболеваний;

2) антибактериальные вещества, синтезируемые бактериями, способные вызывать гибель бактерий того же вида или близких видов;

3) вирусы, способные лизировать бактерии.

16. К синтезу бактериоцинов способны:

а) энтеробактерии;

б) возбудитель чумы;

в) холерный вибрион;

г) стафилококки;

д) коринебактерии.

1) если верно а, в;

2) если верно а, б, г;

3) если верно все.

17. Мутации классифицируют по следующим признакам, кроме:

1) происхождения;

2) числа мутировавших генов;

3) фенотипических последствий;

4) фенотипических проявлений;

5) типа нуклеиновой кислоты, в которой произошла мутация.

18. По происхождению различают мутации:

а) прямые;

б) обратные;

в) спонтанные;

г) индуцированные;

д) генные;

е) хромосомные.

1) если верно а, б;

2) если верно в, г;

3) если верно д, е.

19. По числу мутировавших генов различают мутации:

а) прямые;

б) обратные;

в) спонтанные;

г) индуцированные;

д) генные;

е) хромосомные.

1) если верно а, б;

2) если верно в, г;

3) если верно д, е.

20. По фенотипическим проявлениям (потеря или восстановление признака) различают мутации:

а) прямые;

б) обратные;

в) спонтанные;

г) индуцированные;

д) генные;

е) хромосомные.

1) если верно а, б;

2) если верно в, г;

3) если верно д, е.

21. Каково биологическое значение изменчивости для микроорганизмов?

1) приспособление к условиям существования в окружающей среде и макроорганизме;

2) восстановление повреждённого генотипа;

3) способ передачи генетического материала.

22. Фенотипическими признаками, сообщаемыми плазмидами бактериальной клетке, могут быть:

а) устойчивость к АБ;

б) выработка факторов бактериоциногенности;

в) расщепление сложных органических веществ;

г) продукция факторов вирулентности.

1) если верно а, б;

2) если верно в, г;

3) если верно все.

23. Изменчивость у микроорганизмов может возникать в результате:

1) модификаций;

2) мутаций;

3) рекомбинаций;

4) всего перечисленного.

24. Рекомбинации - это:

1) включение участка хромосомы или эписомальных элементов одного микробного штамма в хромосому другого или обмен участками хромосом между ними;

2) изменения в первичной структуре ДНК микроорганизма, выражающиеся в наследственно закреплённой утрате или изменении какого-либо признака;

3) перенос генетической информации от бактерии-донора к реципиенту посредством «голых» фрагментов ДНК.

25. У бактерий возможны следующие генетические рекомбинации, кроме:

1) конъюгации;

2) модификации;

3) трансдукции;

4) трансформации.

26. Модификация - это:

1) ненаследственные изменения какого-либо признака микроорганизма, приобретаемые им в результате собственной деятельности или воздействия окружающей среды;

2) изменения в первичной структуре ДНК микроорганизма, выражающиеся в наследственно закреплённой утрате или изменении какого-либо признака;

3) перенос генетической информации от бактерии-донора к реципиенту посредством «голых» фрагментов ДНК;

4) перенос генетического материала от бактерии-донора к реципиенту посредством бактериофагов;

5) перенос генетического материала от бактерии-донора к реципиенту при их скрещивании.

27. Мутация - это:

1) ненаследственные изменения какого-либо признака микроорганизма, приобретаемые им в результате собственной деятельности или воздействия окружающей среды;

2) изменения в первичной структуре ДНК микроорганизма, выражающиеся в наследственно закреплённой утрате или изменении какого-либо признака;

3) перенос генетической информации от бактерии-донора к реципиенту посредством «голых» фрагментов ДНК;

4) перенос генетического материала от бактерии-донора к реципиенту посредством бактериофагов;

5) перенос генетического материала от бактерии-донора к реципиенту при их скрещивании.

28. Трансформация - это:

1) ненаследственные изменения какого-либо признака микроорганизма, приобретаемые им в результате собственной деятельности или воздействия окружающей среды;

2) изменения в первичной структуре ДНК микроорганизма, выражающиеся в наследственно закреплённой утрате или изменении какого-либо признака;

3) перенос генетической информации от бактерии-донора к реципиенту посредством «голых» фрагментов ДНК;

4) перенос генетического материала от бактерии-донора к реципиенту посредством бактериофагов;

5) перенос генетического материала от бактерии-донора к реципиенту при их скрещивании.

29. Трансдукция - это:

1) ненаследственные изменения какого-либо признака микроорганизма, приобретаемые им в результате собственной деятельности или воздействия окружающей среды;

2) изменения в первичной структуре ДНК микроорганизма, выражающиеся в наследственно закреплённой утрате или изменении какого-либо признака;

3) перенос генетической информации от бактерии-донора к реципиенту посредством «голых» фрагментов ДНК;

4) перенос генетического материала от бактерии-донора к реципиенту посредством бактериофагов;

5) перенос генетического материала от бактерии-донора к реципиенту при их скрещивании.

30. Конъюгация - это:

1) ненаследственные изменения какого-либо признака микроорганизма, приобретаемые им в результате собственной деятельности или воздействия окружающей среды;

2) изменения в первичной структуре ДНК микроорганизма, выражающиеся в наследственно закреплённой утрате или изменении какого-либо признака;

3) перенос генетической информации от бактерии-донора к реципиенту посредством «голых» фрагментов ДНК;

4) перенос генетического материала от бактерии-донора к реципиенту посредством бактериофагов;

5) перенос генетического материала от бактерии-донора к реципиенту при их скрещивании.

31. Постановку ПЦР производят со следующей целью:

1) обнаружение антигенов возбудителя в материале от больного;

2) обнаружение продуктов жизнедеятельности микроорганизмов в материале от больного;

3) обнаружение соответствующих антител в сыворотке больного;

4) обнаружение специфичных фрагментов ДНК или РНК возбудителя в материале от больного или в чистой культуре микроорганизма.

32. К преимуществам ПЦР не относится:

1) прямое обнаружение возбудителя;

2) высокая чувствительность реакции (выявляет 1-10 возбудителей в пробе материала);

3) возможность определения роли условно-патогенных микроорганизмов (анализ на дисбактериоз);

4) быстрое получение результата, возможность экспресс-диагностики.

33. ПЦР нецелесообразно использовать для определения:

1) трудно культивируемых микроорганизмов (хламидии, микоплазмы и др.);

2) длительно культивируемых микроорганизмов (бруцеллы, микобактерии и др.);

3) вирусов;

4) количества условно-патогенных микроорганизмов в материале.

34. Ложноположительные результаты ПЦР чаще всего обусловлены:

1) контаминированием пробы материала посторонними молекулами ДНК;

2) внесением в пробу материала праймеров;

3) использованием ламинарных боксов для работы с образцами;

4) ингибированием реакции компонентами биологических образцов.

35. К мерам, обеспечивающим защиту ПЦР от загрязнения продуктами предыдущих реакций, можно отнести все, кроме:

1) использования ламинарных боксов для работы с образцами и приготовления ПЦР-смесей;

2) специальных биохимических (урацилгликозилаза) методов инактивации ПЦР-продуктов;

3) специальных физико-химических (УФ излучение + изопсорален) методов инактивации ПЦР-продуктов;

4) исследования отрицательных контролей (не содержащих ДНК-мишень) параллельно с клиническими образцами;

5) осуществления подготовки образцов и их исследования в одном помещении.

Ответы

№ вопр.	ответ	№ вопр.	ответ	№ вопр.	ответ	№ вопр.	ответ	№ вопр.	ответ
1	3	8	3	15	2	22	3	29	4
2	1	9	2	16	3	23	4	30	5
3	3	10	1	17	5	24	1	31	4
4	2	11	1	18	2	25	2	32	3
5	2	12	4	19	3	26	1	33	4
6	5	13	5	20	1	27	2	34	1
7	1	14	6	21	1	28	3	35	5

Размещено на Allbest.ru