Водорозчинні комплекси білків з похідними декстрану та поліакрилової кислоти

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІООРГАНІЧНОЇ ХІМІЇ ТА НАФТОХІМІЇ

УДК 577.27+577.15.02

ВОДОРОЗЧИННІ КОМПЛЕКСИ БІЛКІВ З ПОХІДНИМИ ДЕКСТРАНУ ТА ПОЛІАКРИЛОВОЇ КИСЛОТИ

02.00.10 - біоорганічна хімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата хімічних наук

Демченко Мирослава Олександрівна

Київ 2002

Робота виконана в науковому центрі радіаційної медицини АМН України і в Інституті генної інженерії і біотехнології Мармарського наукового центру, Туреччина

Наукові керівники: доктор хімічних наук, професор Мустафаєв Мамед Ісмайлович Мармарський науковий центр, Туреччина завідувач лабораторії хімічної імунології

доктор медичних наук, професор Порохняк-Гановська Людмила Андріївна Науковий центр радіаційної медицини АМН України завідувач лабораторії радіопротекторних засобів

Офіційні опоненти: доктор хімічних наук, старший науковий співробітник Маслюк Анатолій Федорович Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України, головний науковий співробітник

Доктор біологічних наук, професор Радавський Юрій Леонідович Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, завідувач відділу структури та функцій білків і пептидів

Провідна установа: Київський національний університет ім. Тараса Шевченка, кафедра органічної хімії

Захист відбудеться "27" вересня 2002 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.220.01 в Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України (02094, Київ-94, вул. Мурманська,1).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України (02094, Київ-94, вул. Мурманська,1).

Автореферат розісланий "27" серпня 2002 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д.М. Федоряк

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Внаслідок ослаблення імунної системи у людей та тварин спостерігається зростання різноманітних вірусних захворювань. Створення та застосування штучних і безпечних вакцин специфічної дії є важливим питанням нашого часу. Вирішення цього питання дасть змогу припинити зростання масовості вірусних хвороб. Результати даного експериментального дослідження є науковим обґрунтуванням можливості впровадження в практику нових імуногенних препаратів на основі полісахаридів, з певним антигеном.

В останні роки розробляються нові підходи для вирішення проблем створення штучних вакцин. Одним з компонентів цих вакцин має бути антиген (протеїн, полісахарид тощо). Однак подібні антигени мало імуногенні, і для підвищення їх імуногенності використовуються різні добавки - ад'юванти. Існує достатньо хімічних сполук з ад'ювантною активністю, але вони поки що не знайшли свого застосування, і кореляція між структурою препаратів та їх імуногенністю вивчена недостатньо. Це, в свою чергу, заважає створенню препаратів з бажаною імуногенною активністю. За ад'юванти пропонувались різного складу ліпосоми і міцели, солі полівалентних металів, а також полімерні системи.

З початку 1970-х років в Інституті імунології АМН Росії в Москві для цієї мети почали досліджувати синтетичні поліелектроліти - заряджені розчинні макромолекули. Було встановлено, що практично незалежно від будови мономерних одиниць, при досягненні певної довжини полімерного ланцюга вони дають високу імунну відповідь до зв'язаного з ними антигену. Такі гібридні молекули виявились не лише тімус-незалежними імуногенами, але вони виявили протекторну активність проти відповідної інфекції при введенні в живий організм. Одним з ключових моментів при створенні полімерних імуногенів і вакцин є встановлення механізму взаємодії полімерних молекул з молекулами антигенів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження проводились при виконанні Державної науково-технічної програми №0199U003866 за договором № 17/12а Н-99. Тема НДР: “Розробка способу запобігання мутагенним впливам шкідливих факторів довкілля” згідно галузевого плану МНС України. За підтримкою стипендії НАТО робота частково виконувалась у Інституті генної інженерії та біотехнології Мармарського наукового центру Туреччини.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було синтезувати нові макромолекулярні сполуки з властивостями штучних вакцин на основі полісахаридів і модельних антигенів - БСА (бичачого сироваткового альбуміну) та г-глобуліну при ковалентному зв'язуванні цих компонентів, а також при утворенні комплексів антигенів з декстрансульфатом і кополімерами поліакрилової кислоти через іон металу.

До задач роботи входило:

1) синтезувати водорозчинні ковалентні кон'югати БСА та г-глобуліну з полісахаридами;

2) дослідити умови утворення кон'югатів і природу зв'язку за допомогою фізико-хімічних і фізичних методів;

3) синтезувати водорозчинні потрійні комплекси БСА з похідними поліакрилової кислоти та декстрансульфату;

4) вивчити конформаційний стан білка в складі потрійних полікомплексів;

5) дослідити імуногенні властивості одержаних ковалентних кон'югатів та потрійних комплексів.

Об'єкт дослідження - комплексні сполуки і ковалентні кон'югати полісахаридів і синтетичних полімерів з білками.

Предмет дослідження - зв'язок між будовою, фізико-хімічними властивостями та імунологічною активністю новоутворених білково-полімерних комплексів.

Методи дослідження - хімічний синтез, високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ), віскозиметрія, поверхневий плазмонний резонанс (ППР), УФ-спектроскопія, флуоресцентна спектроскопія та твердофазний імуноферментний аналіз - ELIZA (Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay).

Наукова новизна одержаних результатів. В результаті виконаної роботи отримані нові стабільні водорозчинні препарати - молекулярні комплекси полісахаридів з білками. Вперше досліджено конформаційний стан БСА в комплексі з похідними поліакрилової кислоти методом флуоресцентної спектроскопії. Встановлено, що включення до складу полімерного ланцюга гідрофобних ізопропіламідних груп призводить до обгортання глобули білка полімером та витіснення гідратаційної води з його поверхні. Вперше такі комплекси декстрансульфату з білками одержані шляхом утворення координаційного зв'язку за участю йонів міді. Досліджено механізм реакції кон'югації і зміна структури білка в складі полікомплексів. Створені нові матриці на основі альдегідних похідних полісахаридів. Методом поверхневого плазмонного резонансу досліджена кількість молекул білка, імобілізованих на цих матрицях. Показана можливість посилення імуногенності білкових антигенів шляхом включення їх в полісахаридні комплекси. Синтезовані нами імуногенні препарати і отримані результати їх досліджень дозволяють сформулювати і обґрунтувати новий принцип у створенні штучних вакцин. білок кон'югат полісахарид полімер

Практичне значення одержаних результатів. В сукупності отримані результати даного дисертаційного дослідження свідчать про перспективність нового наукового напрямку зі створення надмолекулярних структур, що набувають нових властивостей, не притаманних їх складовим компонентам. Завдяки цьому, створені структури відкривають перспективу цілеспрямованого їх використання як штучних вакцин.

Особистий внесок здобувача. Розробка програми наукового дослідження та проведення експериментів, підбір методик вирішення поставлених завдань, проведення експериментальних досліджень, аналіз первинного матеріалу, обробка даних та їх узагальнення здійснювались за безпосередньої участі здобувача. Концепція роботи запропонована керівником д.х.н., професором Мустафаєвим М.І. Під його керівництвом результати дослідів були оформлені у вигляді наукових публікацій. Планування етапів дослідження проведено разом з науковим керівником д.м.н., професором Порохняк-Гановською Л.А. Дослідження проводились спільно в лабораторії радіопротекторних засобів Інституту експериментальної радіології НЦРМ АМН України і лабораторії хімічної імунології Інституту генетичної інженерії і біотехнології Мармармарського наукового центру, Туреччина. Кополімери N-ізопропілакриламіду з акриловою кислотою надані проф. Осадою (Університет Саппоро, Японія).

Синтез кон'югатів проводився під керівництвом к.х.н. Мустафаєвої З.К. в лабораторії хімічної імунології Інституту генної інженерії і біотехнології Мармармарського наукового центру, Туреччина. Дослідження ППР проводилось в Інституті напівпровідників НАН України в співробітництві з к.ф.-м.н. Чегелем В.І. Флуоресцентний аналіз проводився за участю к.б.н. Філенко А.М. в Інституті біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України.

Апробація результатів дисертації. Результати доповідалися на 10 міжнародних наукових конференціях: XIV International School-Seminar “Спектроскопія молекул і кристалів” (Одеса, Україна 1999); World Polymer Congress 38th Macromolecular IUPAC Symposium, (Warsaw, Poland, 2000); International Mini-Symposium "Polymers in Medicine" (Prague, Chech Republic, 2000); 3rd International Conference "Електронні процеси в органічних матеріалах" (Харків, Україна, 2000); 8th International Meeting on Chemical Sensors (Basel, Switzerland, 2000); International Conference “Era of Biotechnology”, (Jerusalem, Israel, 2000); First Russian-Ukranian-Polish Conference on Molecular Interactions School of Physical Organic Chemistry (Gdansk, Polish, 2001); XV International School-Seminar “Спектроскопія молекул і кристалів” (Чернігів, Україна 2001); Europolymer Congress (Eindhoven, Netherlands, 2001); 8th Biomedical Symposium, Ankara, Turkey.

Публікації. Основні результати роботи викладено в 6 статтях (3 - в українських фахових журналах і 3 - в міжнародних) та 10 тезах доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, 3-х розділів, висновків та списку літератури. Робота викладена на 105 сторінках, містить 1 таблицю і 32 рисунки. Список літератури нараховує 155 джерел.

Основний зміст

Ковалентне зв'язування полісахаридів з протеїнами та дослідження структури отриманих сполук. Модифікація та зв'язування білків та інших молекул з синтетичними та природними полімерами дає широкі можливості їх застосування in vivo i in vitro. Одержані таким чином кон'югати мають широке застосування в медицині та біотехнології. Полімери з реакційноздатними групами можуть бути використані для зв'язування низькомолекулярних речовин з метою створення фармакологічно-активних агентів, що існують довгий час в біологічних системах. Деякі такі комплекси володіють імуногенними властивостями, що існують як кон'югати гаптен-полімер при виробництві антитіла у відповідь на гаптен.

Полісахариди, завдяки їх можливості легко модифікуватись і зв'язуватись, представляють зручний об'єкт як носії антигенів. Для ковалентного зв'язування полісахариду з білком необхідна його хімічна модифікація. З цією метою нами був обраний метод окиснення полісахариду періодатом натрію. Полісахариди: декстрансульфат (ДС), декстран, етилцелюлоза і гідроксиетилцелюлоза були піддані перйодатному окисленню. Під дією оксиданта відбувалось часткове руйнування полісахаридних кілець, як видно зі схеми на Рис.1. Після реакції зразки були піддані діалізу. Очищені від мінеральних солей альдегідні похідні полісахаридів виморожували і висушували на ліофілізаторі.

де R = Н або SO3

Рис. 1 Схема реакції окиснення полісахариду перйодатом натрію.

Альдегідні похідні полісахаридів аналізувались аналітичним методом на вміст сахаридів з використанням УФ спектроскопії. Фенол в присутності концентрованої сірчаної кислоти утворює комплекси з полісахаридами рожевого кольору, максимум поглинання якого 488 нм. Під дією оксиданта відбувалось часткове руйнування полісахаридних кілець з утворенням альдегідних похідних, про що свідчило зменшення інтенсивності поглинання продукту з фенолом.

Другим етапом був синтез ковалентних кон'югатів. В якості моделі для вивчення реакції взаємодії альдегідних похідних полісахаридів з білками вибрано бичачий сироватковий альбумін. При цьому альдегідні групи полісахариду, з'єднуючись з аміногрупами БСА, утворювали основи Шифа, які після відновлення перетворювались у міцні кон'югати (Рис.2).

де R - сульфатна група,

Prot - білок з вільними аміногрупами.

Рис. 2 Схема реакції приєднання альдегідного похідного полісахариду до молекули, що містить аміногрупу

Присутність у полісахаридному ланцюзі функціональних гідроксильних та сульфатних груп може призводити до взаємодій різного характеру. Утворення численних нековалентних зв'язків між полісахаридом та білком має приводити до зміни структури і властивостей складових компонентів. Властивості та структурні зміни водорозчинних кон'югатів досліджувались методами віскозиметрії, високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) та флуоресцентної спектроскопії.

Наведена в'язкість служила простою, але інформативною характеристикою кон'югації досліджених полісахаридів. Альдегідні похідні полісахаридів демонструють деяке зниження наведеної в'язкості в порівнянні з немодифікованими полісахаридами, особливо для етил- та гідроксиетилцелюлози. Додавання БСА до немодифікованих полісахаридів не змінювало наведену в'язкість, проте при додаванні БСА до їх альдегідних похідних в'язкість зростала, що свідчило про взаємодію двох компонентів з утворенням нових ковалентних сполук. В той же час наведена в'язкість альдегідних похідних етилцелюлози (АЕЦ), а також гідроксиетилцелюлози (АГЦ) суттєво менша в'язкості вихідних полісахаридів.

Ці результати були підтверджені методом ВЕРХ. Як видно з Рис.3, на хроматограмі суміші альдегідного похідного декстрансульфату (АДС) з БСА з'являються нові компоненти, час виходу яких відрізняється від часу виходу вихідних компонентів. Хроматографічні дані свідчать, що в цій системі композиційно неоднорідний кон'югат співіснує з вільними компонентами. Аналогічно взаємодіє альдегідне похідне декстрану (АД).

Отже, хроматографічні і віскозиметричні дослідження свідчать про утворення нових сполук, де макромолекули вихідних речовин з'єднані ковалентним зв'язком.

Першим кроком у більш детальному дослідженні новоутворених сполук було кількісне визначення поверхневих аміногруп з використанням флуоресцентного реагенту - флуорескаміну. В результаті цих досліджень було визначено кількість аміногруп БСА, які вступили в реакцію з альдегідними похідними полісахаридів. Найменша кількість вільних аміногруп була в кон'югаті БСА-АГЦ, найбільша - в суміші БСА з ДС.

Для вивчення процесу утворення кон'югатів важливо було визначити хід реакції, а також кількості компонентів, що вступили в реакцію. Взаємодія між макромолекулами досліджувалась методом поверхневого плазмонного резонансу (ППР), який застосовується для вивчення специфічних міжмолекулярних взаємодій. Необхідною умовою застосування методу є імобілізація одного з компонентів біоспецифічної взаємодії на металевій (золотій) платівці. Альдегідні похідні полісахаридів імобілізувалися на золотій поверхні, а розчин БСА наносився поверх утвореної матриці. Зміна кута заломлення лазерного променя відтворювала взаємодію двох компонентів на золотій платівці.

Взаємодія БСА з матрицями приводила до зміни сигналу ППР, що реєструвався як функція часу (Рис.4).

Збільшення рівня відповіді ППР свідчило про більшу кількість молекул БСА, що прикріпилися до матричної поверхні, постійний рівень відповіді ППР протягом часу свідчив про закінчення реакції. Наприкінці проводилось промивання HCl для видалення нековалентно зв'язаних з матрицею молекул БСА. Відповідь ППР зменшувалась, що свідчило про часткове змивання адсорбованих молекул БСА з поверхні матриці. У випадку з декстрансульфатом та іншими немодифікованими полісахаридами відбувалось повне вимивання молекул БСА.

Порівнюючи з іншими матрицями, найбільш швидко і інтенсивно відбувалась адсорбція і взаємодія БСА з АДС. При цьому, як свідчать сенсограми, кількість молекул БСА, імобілізованих на поверхні АДС, була значно більша ніж на інших матрицях. Цьому може сприяти електростатична взаємодія позитивно заряджених молекул БСА з негативно зарядженими сульфатними групами полісахариду. Отже, середовище АДС-матриці сприяє проходженню в ньому хімічних реакцій. Після промивання HCl кількість адсорбованого БСА практично не зменшувалась, що свідчить про утворення міцних ковалентних зв'язків.

Важливу інформацію про структуру білка в кон'югатах з полімерами дає аналіз спектрів флуоресценції білка. Як видно з Таблиці 2, спектри флуоресценції, одержані при кон'югації з різними альдегідними полісахаридами, істотно відрізняються. Враховуючи, що найбільш інформативним параметром флуоресценції є положення максимуму спектра емісії лmax, то порівняння за цим параметром може свідчити про відмінності в структурі утворених кон'югатів. Зсув максимуму флуоресценції в короткохвильову область, показує, що ковалентно зв'язавшись, полісахарид обкручує білкову глобулу, в результаті чого триптофанові хромофори втрачають контакт з водним розчином. У випадку комплексу БСА - АД лmax практично співпадає з лmax вільного білка, в даному випадку полісахарид контактує з білком лише в окремих точках. При цьому білкові молекули зберігають свої індивідуальні властивості. Кон'югат БСА - АДС характеризується істотним зсувом спектру в область коротких довжин хвиль. Цьому, як вже було сказано, сприяють сульфатні групи в полісахаридному ланцюзі.

Порівняння спектрів флуоресценції водного розчину білка та його кон'югатів з полімерами свідчить, що при кон'югації відбуваються конформаційні зміни в структурі білка, які можуть бути суттєвими у визначенні імуногенних властивостей комплексу. Утворення ковалентних зв'язків між альдегідними похідними полісахаридів і білками приводить до зміни структури компонентів. Полісахарид, ковалентно зв'язуючись, специфічно взаємодіє з білком і адсорбується на поверхні білкової глобули. При цьому в спектрі спостерігається зменшення інтенсивності флуоресценції і зсув спектру в короткохвильову область. Це свідчить про зменшення в'язкості оточення триптофану в БСА та ізоляцію його від водного оточення полісахаридними ланцюгами. Ковалентно зв'язуючись, модифікований полісахарид розкручує білкову глобулу і частково проникає в її середину, в результаті чого оточення триптофанового залишку стає менш в'язким.

Сильний вплив на конформацію БСА показали АЕЦ і АГЦ. Їх лінійна будова та рухливість молекул сприяє взаємодії з білком. Для цих полісахаридів спостерігалось значне гасіння флуоресценції і зміщення максимуму в короткохвильову область (Табл.2). Це свідчить про найбільші зміни конформації білка у цих випадках.

Таблиця 2

Назва препарату Інтенсивність флуоресценції лmax нм

(у відносних одиницях)

АД + БСА 1.75 339.3

АДС + БСА 1.7 337

АЕЦ + БСА 1.4 337

АГЦ + БСА 1.38 335

Потрійні комплекси декстрансульфату з БСА.

В попередніх експериментах виявлено, що при кон'югації альдегідних похідних полісахаридів з БСА спостерігається утворення ансамблю сполук з широкою композиційною неоднорідністю. Така неоднорідність ускладнює аналіз і практичне застосування, оскільки вимагає додаткового фракціонування. Проте, як відомо, зв'язування протеїнів з поліелектролітами можна здійснити також і за допомогою іонів перехідних металів. Варіюючи кількість іонів метала і співвідношення компонентів, можна синтезувати потрійні полікомплекси, коли усі компоненти включаються в створені кон'югати. Додатковою перевагою цього підходу може бути простота реакції, яка відбувається у водних розчинах за нейтральних рН шляхом простого змішування реагентів. Можлива структура комплексу представлена на Рис.5.

Рис. 5 Структура комплексу ДС-Cu2+-протеїн

Комплексоутворення з декстрансульфатом відбувається за участю сульфатної групи. Крім того, наявність вільних гідроксильних груп може також впливати на комплексоутворення і створювати додаткові нековалентні зв'язки між полісахаридом і білком у потрійному комплексі.

На першому етапі цих досліджень було вивчене комплексоутворення між молекулами декстрансульфату за відсутності протеїну. Найбільш простим і адекватним методом, що дозволяє фіксувати утворення комплексів, є метод УФ спектроскопії. Оскільки декстрансульфат не містить власних хромофорів, оптичне поглинання розчину зростає в залежності від кількості та розміру утворених асоціатів і визначається їх здатністю розсіювати світло. В цих експериментах оптична густина вимірювалась на довжині хвилі 400 нм. Проводилось турбодиметричне титрування розчинами солей ряду металів: Fe2+, Fe3+, Ni2+, Co2+, Mn2+, Zn2+, Cd2+. В усіх випадках оптична густина підвищувалась, що свідчило про утворення комплексів. Подальше додавання металів призводило до утворення осаду. Найбільшу здатність до утворення комплексів з декстрансульфатом було виявлено у Fe2+ і Fe3+, також значний ефект виявили кадмій і мідь. Інші метали утворювали осад з ДС лише при більш високих концентраціях.

На наступному етапі з метою вивчення потрійних комплексів проводилось таке ж титрування катіонами металів суміші ДС і БСА. Характерною особливістю є те, що в залежності від природи і концентрації металу в системі відбувається ріст асоціатів, аж до фазового розділення в системі, що фіксується ростом адсорбції (А280) за рахунок світлорозсіяння. Таке фазове розділення при найменших концентраціях спостерігається для Fe2+, Fe3+ та Cu2+. У випадку Ni2+, Co2+, Mn2+, Zn2+- система залишається однорідною в широкому інтервалі концентрацій катіонів металів.

Рис.6. Оптична густина суміші БСА з ДС в залежності від співвідношення іонів металів до молекул БСА.

Поряд з координаційним зв'язком через іон металу білок і полімер можуть взаємодіяти шляхом утворення численних нековалентних зв'язків. При цьому може модифікуватись третинна структура білка, змінюватись його гідратація. Такі зміни можуть бути зафіксовані методом флуоресцентної спектроскопії. При комплексоутворенні полісахарид ДС з БСА в присутності іонів металів може змінювати природу оточення залишків триптофану в глобулі білка.

Зміна положення максимуму флуоресценції вказує на конформаційні зміни в молекулі альбуміну. Найкраще це спостерігалося у випадку Fe2+, Fe3+ і Cu2+. При цьому спостерігалось сильне гасіння флуоресценції і зсув максимуму флуоресценції в довгохвильову область. Обидва факти вказують на те, що відбувається розгортання білкової молекули, завдяки чому залишки триптофану стають більш доступними до молекул води. У випадку з міддю також відбувалось поступове гасіння флуоресценції і зсув максимуму флуоресценції в довгохвильову область. В усіх випадках з іншими металами ці ефекти були менш вираженими. Додавання іонів кадмію приводило до гасіння, інтенсивність флуоресценції помітно падала, але положення максимуму майже не змінювалось.

Для реакції формування комплексів обрали Cu2+ який добре себе зарекомендовав у попередніх дослідах. Дослідження комплексоутворення БСА з кополімерами поліакрилової кислоти проводились за вказаною вище схемою.

Потрійні комплекси кополімерів N-ізопропілакриламіду і акрилової кислоти з БСА в присутності іонів міді.

ДС і інші похідні декстрану належать до полімерів, що мають розгалужену структуру і досить жорстку конформацію ланцюга. На відміну від них більшість синтетичних полімерів мають більш просту і гнучку структуру. Серед цих полімерів є і такі, що знаходять значний інтерес і важливе практичне застосування як носії антигенів. Зокрема, це кополімери поліізопропілакриламіду з акриловою кислотою, яким властивий негативний температурний ефект гелеутворення. Важливою перевагою цього класу полімерів у дослідженнях комплексоутворення з білками є можливість варіації співвідношення полярних і неполярних груп. Утворення розчинних потрійних комплексів цих кополімерів з Cu2+ та БСА було досліджене раніше і встановлено їх композиційний склад методом ВЕРХ. Вони виявили високу імуногенну активність. В нашій роботі вперше структура цих комплексів була вивчена методом флуоресценції. Показано, що в залежності від співвідношення полярних груп і гідрофобних ланок в полімері, по-різному відбувається утворення комплексів. Концентрація іонів міді також впливає на комплексоутворення. Положення максимуму вказує на характер взаємодії в залежності від вмісту полярних груп у полімері. При однаковому співвідношенні поліелектролітів з білком і різній концентрації іонів міді положення максимуму флуоресценції залежить від вмісту полярних груп у полімері.

Контакти між білками і поліелектролітами, як було доведено раніше, досягались шляхом формування хелатів, в котрих іони металів були локалізовані в центрі. В таких системах іони металів давали два ефекти: 1) зв'язування поліелектролітів з протеїновими молекулами, 2) інтермолекулярну агрегацію полікомплексних частинок. Розчинність, склад і стабільність цих полікомплексів залежала від рН, а також від молекулярного співвідношення компонентів.

Флуоресцентні дослідження показали, що в присутності іонів міді кополімери з різним вмістом полярних груп по-різному впливають на триптофанове оточення (Рис.7). При відсутності іонів міді в сумішах білка з усіма кополімерами зміни положення максимуму флуоресценції у порівнянні з чистим білком не відбувалось. Додавання іонів міді до БСА приводило до розгортання білкової глобули, про що свідчив зсув максимуму флуоресценції в довгохвильову область. Але в присутності кополімера, де вміст акрилової кислоти становить 25%, картина істотно змінювалась і відбувався зсув спектру в короткохвильову область. Коли вміст полярних груп акрилової кислоти становив 50%, цей ефект максимально збільшувався. При найбільшій кількості іонів міді зсув максимуму в короткохвильову область становив 10 нм. На основі цих спостережень можна допустити, що полімерні ланцюги, зв'язуючись з молекулами білка через Cu2+- іони, формують навколо них щільний шар, молекули БСА обкручуються такими сегментами, зв'язуючись з кополімером через мідь координаційними зв'язками.

При високому вмісті полярних груп положення максимуму флуоресценції дає невеликий зсув в довгохвильову область, незалежно від концентрації іонів міді. У випадку з поліакриловою кислотою, при відсутності гідрофобних ланок N-ізопропілакриламіду, положення максимуму майже не змінюється. Це свідчить, що в останньому випадку молекули БСА, незначно змінюючи структуру, взаємодіють з полімерними ланцюгами за допомогою координаційних зв'язків.

Одержані результати дозволяють порівняти властивості ДС і досліджених синтетичних полімерів при утворенні комплексів з БСА. Вміст полярних груп і гідрофобних ланок по-різному впливають на структуру новоутворених комплексів. Природний полісахарид декстран, що складається з мономерних ланок D-глюкози, з'єднаних глікозидними зв'язками, має розгалужену будову, в 4-му положенні присутній замісник - сульфатна група. При зв'язуванні декстрансульфату з білком через метал утворюються численні міжмолекулярні водневі зв'язки з гідроксильними групами, що приводить до розгортання білкової глобули. Лінійна будова синтетичних кополімерів приводить до взаємодії іншого характеру. При незначній кількості полярних груп полімер обгортає білкову глобулу, але при їх високому вмісті контактує з глобулою лише в окремих точках.

Потрійні комплекси з г-глобуліном.

В плані розвитку наших досліджень з врахуванням можливого практичного застосування результатів є важливим порівняти препарати білків з різною антигенністю. Оскільки БСА є слабким антигеном, в наступній частині роботи було досліджено г-глобулін - білок з сильними антигенними властивостями. Дослідження структурних змін білка в складі потрійного комплексу ДС з міддю ускладнювались через невстановлену кількість залишків триптофану, що знаходяться в білковій глобулі.

Флуоресценцію г-глобуліну в присутності іонів міді характеризують такі особливості. При збільшенні концентрації іонів міді інтенсивність флуоресценції рівномірно знижується, доки не досягає певного рівня. Це вказує на формування комплексів з іонами міді. Зсув максимуму флуоресценції на три нанометри в довгохвильову область свідчить про часткове розгортання білкової глобули під час комплексоутворення. Білок, розгортаючись, відкриває залишки триптофану для більшого контакту з водним розчином. При певній концентрації іонів міді система втрачала гомогенність. При цьому зміна інтенсивності флуоресценції або зміна положення максимуму в спектрі флуоресценції не спостерігалась.

Такі вперше створені і досліджені нами комплекси можуть бути моделями для створення інших полімер-білкових кон'югатів з метою отримання нових імуногенних препаратів. Використані методи дають змогу отримати інформацію про структуру комплексів, підібрати необхідні умови і концентрації компонентів, необхідних для одержання сполук з заданими властивостями з оптимальним виходом.

Імуногенність БСА і г-глобуліну в їх полікомплексах з полісахаридами.

Одержані і викладені вище результати дозволили перейти до наступного етапу - вивчення імуногенності БСА і г-глобуліну в складі комплексів з полісахаридами. За полімерні компоненти тут служили декстран і ДС.

Дослідження, що проводились на мишах, були виконані в одних і тих же умовах при однаковій концентрації антигена в досліджуваних компонентах. Після внутрівенної ін'єкції мишам через певні проміжки часу ми відбирали проби крові, і з її сироватки методом ELIZA визначали кількість антитіл, специфічних до даного білка у складі полікомплексів. Вивчалась динаміка утворення антитіл для ковалентних кон'югатів і мідних комплексів ДС як з БСА, так і з г-глобуліном.

Для дослідження було обрано 3 системи:

а) Ковалентні похідні АД-БСА, АДС-БСА, АДС-г-глобулін; б) потрійні комплекси ДС-Cu2+-БСА, ДС-Cu2+-г-глобулін; в) суміші ДС і ДС з БСА та г-глобуліном. Результати типових експериментів представлені на Рис.8.

Одержані результати свідчать, що зв'язування з дослідженими полімерами як малоімуногенного білка (БСА), так і сильно імуногенного г-глобуліну приводить до істотного збільшення кількості білок-специфічних антитіл в організмі тварин. Аналіз динаміки показує, що максимум імунної відповіді спостерігається в інтервалі 10-20 діб. Вивчення тривалості цього ефекту продовжується.

У випадку з контрольним дослідом з БСА динаміка продукції антитіл зовсім не відрізняється від кількості антитіл контрольної групи неімунізованих щурів. Механічна суміш ДС з БСА імунологічну відповідь підвищує, але триває недовго. Ковалентний кон'югат дає більшу імунну відповідь ніж просто суміш і формування антитіл триває довгий час. Але найкраща імунна відповідь була у випадку імунізації потрійним комплексом. Кількісно утворення антитіл перевищувало в 3 рази контрольний дослід з БСА.

У випадку з г-глобуліном чистий білок у порівнянні з контролем дає імунну відповідь. Але в усіх випадках у присутності полісахариду імунна відповідь збільшувалась як мінімум вдвічі. Порівнюючи з г-глобуліном формування антитіл трималось на рівні довше, ніж просто в механічній суміші. Для потрійного комплексу ефект імунної відповіді спостерігався пізніше, але він не сильно відрізнявся від кон'югату з АДС і механічної суміші г-глобуліну з ДС.

Отже, у випадку г-глобуліну методи зв'язування білка з полімером не впливали істотно на активність кон'югату. Ковалентне зв'язування, комплексоутворення через іон металу та електростатичні взаємодії давали однаково високу імунну відповідь на введені препарати. Водночас для систем, що утворені за участю БСА, методи зв'язування давали істотно відмінні результати. Ця відмінність може бути пов'язана з різною молекулярною масою білків (70.000 для БСА і 150.000 для г-глобуліну), або різною основністю цих білків (рІ 4.9 і 7 відповідно).

Таким чином, ми показали, що створені нами полімер-білкові композити мають високі імуногенні характеристики. Одержані результати дозволяють стверджувати, що імуногенні препарати, виготовлені на основі природних полісахаридів і імуногенних білків можуть бути запропоновані і впроваджені в практику як імуностимулюючі агенти. Застосування полісахаридів як носіїв антигенів певних хвороб є важливим етапом при створенні штучних вакцин.

Висновки

1. У дисертації зроблено теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової задачі, що полягає в створенні нових імуногенних препаратів на основі ковалентних кон'югатів полісахаридів та їх потрійних комплексів.

2. Оптимізовані умови реакції модифікації полісахариду та його кон'югації з білками для досягнення максимального виходу кон'югату.

3. В результаті дослідження утворення кон'югатів з бичачим сироватковим альбуміном (БСА) та г-глобуліном показано, що при модифікації різко падає кількість реакційноздатних зовнішніх аміногруп білка, що свідчить про утворення численних ковалентних зв'язків між компонентами. Показана неоднорідність продуктів цієї реакції за їх складом.

4. Розроблені нові сенсорні матриці на основі модифікованих полісахаридів, за допомогою яких вивчена реакція утворення білок-полімерних кон'югатів методом поверхневого плазмонного резонансу. Показана залежність швидкості реакції кон'югації і кількості імобілізованого білка від хімічної структури матриці.

5. Порівняльне дослідження потрійних комплексів на основі декстрансульфату і БСА в присутності ряду іонів перехідних металів, показали, що іони металів Cu2+, Fe2+ і Fe3+ є найкращими агентами, здатними утворювати найбільш стабільні потрійні комплекси в дослідженій системі. Визначено умови, за яких ці комплекси є найменш гетерогенними.

6. Проведено порівняльний аналіз конформаційного стану білка (БСА) в потрійних комплексах за участю іонів міді з похідними поліакрилової кислоти та декстрансульфату, а також ковалентних кон'югатів - альдегідних похідних полісахаридів з БСА методом флуоресценції. Встановлено, що в цих системах конформаційний стан білка змінюється в залежності від гідрофобності полімерної матриці. У випадках поліакрилової кислоти, декстрансульфату та альдегідних похідних декстрану білкова глобула в значній мірі гідратована. Але якщо в складі полімеру з'являються гідрофобні ланки N-ізопропілакриламіду, то картина істотно змінюється - білок сильно екранується від водного оточення.

7. В результаті дослідження імуногенних властивостей синтезованих водорозчинних потрійних комплексів та ковалентних кон'югатів на основі декстрану і декстрансульфату з БСА та г-глобуліном, встановлено 2-3.5 кратне зростання імуногенності білкових антигенів після їх включення до складу полімерних систем.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. V. Chegel, Yu. Shirshov, S. Avilov, S. Verevka, M. Demchenko, M. Mustafaev. Oxidized polysaccharides as matrix structures for surface plasmon resonance biosensors // Функціональні матеріали. 2000. Т.7, N 4(1). С. 703-710.

2. V. Chegel, Yu. Shirshov, M. Demchenko, Z. Mustafaeva, S. Avilov. Polymeric gel structures for chromatography. Characterization by surface plasmon resonance // Функціональні матеріали. 2000. Т.7, N 4(1). С. 717-721.

3. A. Filenko, M. Demchenko, Z. Mustafaeva, M. Mustafaev. Behavior of ternary complexes: bovine serum albumin -Cu2+ - copolymers of acrylic acid with N-isopropylacrylamide (fluorescent approach) // Фізика живого. 2000.Т. 8, N 2. С. 72-81.

4. A. Filenko, M. Demchenko, Z. Mustafaeva, Y. Osada and M. Mustafaev. Fluorescence Study of Cu2+-induced Interaction between Albumin and Anionic Polyelectrolytes // Biomacromolecules. 2001. V.2, N1. P. 270-277.

5. A. Salman-Dilgimen, Z. Mustafaeva, M. Demchenko, T. Kaneko, Y. Osada, M. Mustafaev. Water-soluble covalent conjugates of bovine serum albumin with anionic poly(N-isopropyl-acrylamide) and their immunogenicity // Biomaterials.- 2001. V. 22. P. 2383-2392.

6. V. Chegel, Yu. Shirshov, S. Avilov, M. Demchenko, M. Mustafaev. The Novel Aldehyde-Sulfonate (ADS) Matrix for Affinity Biosensors // J.Biochem and Biophys. Methods. 2002. V. 50. P. 201-216.

7. M. Demchenko, Z. Mustafaeva, E. Ergen, M. Mustafaev. Spectroscopic investigations of covalent conjugates of polysaccharides with proteins // Proceedings of XIV International School-Seminar “Spectroscopy of molecules and crystals”. Одеса (Україна). 1999.

8. Z. Mustafaeva, M. Demchenko, E. Ergen, A. Salman-Dilgimen and M. Mustafaev. Water soluble covalent conjugates of Bovine Serum Albumin with anionic poly(N-isopropyl-acrylamide) and their immunogenecity // Proceedings of the Wold Polymer Congress 38th Macromolecular IUPAC Symposium. Warsaw (Poland). 2000.

9. Z. Mustafaeva, M. Demchenko, E. Ergen, A. Salman-Dilgimen and M. Mustafaev. Immunogenecity of amphifilic water soluble conjugates of serum proteins with temperature-sensitive poly(N-isopropylacrylamide) // Proceeding of the Internation Mini-Symposium "Polymers in Medicine". Prague (Chech Republic). 2000.

10. V. Chegel, Yu. Shirshov, M. Demchenko, M. Mustafaev, S. Avilov. Interfacial matrix based on aldehyde dextran for biomolecules interaction analysis // Proceeding of 3rd International Conference Electronic Processes in Organic Materials. Харків (Україна). 2000.

11. V. Chegel, Yu. Shirshov, M. Demchenko, M. Mustafaev, S. Verevka, S. Avilov. Aldehyde dextran sulfate layer as matrix for surface plasmon resonance biosensors // Proceeding of 8th International Meeting on Chemical Sensors.- Basel (Switzerland). 2000.

12. V. Chegel, Yu. Shirshov, S. Avilov, S. Verevka, M. Demchenko, M. Mustafaev. The Novel Aldehyde Dextran Sulfate matrix for affinity Biosensors // Proceeding of the International Conference “Era of Biotechnology”. Jerusalem (Israel). 2000.

13. A. Filenko, M. Demchenko, Z. Mustafaeva and M. Mustafaev. Ternary complexes Serum Albumin - Cu2+ - polymers // Proceeding of First Russian-Ukranian-Polish Conference on Molecular Interactions School of Physical Organic Chemistry. Gdansk (Polish). 2001.

14. M. Karahan, P. Vural, M. Demchenko, Z. Mustafaeva, M. Mustafaev. Interactions of ternary Me-Polycomplexes between dextran sulfate and serum albumin // Proceeding of the XV International School-Seminar “Spectroscopy of molecules and crystals”. Чернігів (Україна). 2001.

15. M. Karahan, M. Demchenko, Z. Mustafaeva, M. Mustafaev. Spectroscopic Study of Interaction between anionic polyelectrolytes and serum albumin // Proceeding of the Europolymer Congress. Eindhoven (Netherlands). 2001.

16. M. Karahan, M. Demchenko, Z. Mustafaeva, M. Mustafaev. Spectroscopic Study of Interaction between anionic polyelectrolytes and serum albumin // Proceeding of 8th Biomedical Symposium. Ankara (Turkey). 2001.

Анотація

Демченко М.О. Водорозчинні комплекси білків з похідними декстрану та поліакрилової кислоти. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата хімічних наук за спеціальністю 02.00.10 - біоорганічна хімія. Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, Київ, 2002.

Дисертація присвячена дослідженню кон'югації білків з модифікованими полісахаридами, їх комплексоутворенню з поліаніонами за участю перехідних металів, вивченню їх фізико-хімічних властивостей та імуногенності.

На основі розроблених нових сенсорних матриць вивчена кінетика утворення полімер-білкових кон'югатів методом поверхневого плазмонного резонансу. Показана залежність цієї реакції від хімічної структури матриці.

Проведено порівняльний аналіз конформаційного стану білка (БСА) в потрійних комплексах за участю іонів Cu2+ з похідними поліакрилової кислоти і декстрансульфату, а також ковалентних кон'югатів - похідних декстрану з БСА методом флуоресценції. Показано, що в залежності від співвідношення гідрофільних і гідрофобних груп в полімері утворюється два типа комплексів - з відкритою поверхнею білкової глобули і з поверхнею, покритою полімерним ланцюгом.

Вивчені імуногенні властивості отриманих комплексів і ковалентних кон'югатів з БСА і г-глобуліном в дослідах на мишах і встановлено зростання імуногенності білкових антигенів після їх включення до складу полімерних систем. Ці результати можуть бути використані як в області фундаментальної біоорганічної хімії, так і в області створення полімерних вакцин.

Ключові слова: полімер-білок кон'югати, поліелектролітні комплекси, флуоресцентна спектроскопія, імуногенність.

Аннотация

Демченко М.А. Водорастворимые комплексы белков с производными декстрана и полиакриловой кислоты. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук по специальности 02.00.10 - биоорганическая химия. Институт биоорганической химии и нефтехимии НАН Украины, Киев, 2002.

Диссертация посвящена исследованию конъюгации белков c модифицированными полисахаридами, их комплексообразованию с полианионами с участием переходных металлов, изучению их физико-химических свойств и иммуногенности.

На основе разработанных новых сенсорных матриц изучена кинетика образования белок-полимерных конъюгатов методом поверхностного плазмонного резонанса. Показана зависимость скорости этой реакции от химической структуры матрицы.

Проведен сравнительный анализ конформационного состояния белка (БСА) в тройных комплексах с участием ионов Cu2+ с производными полиакриловой кислоты и декстрансульфата, а также ковалентных конъюгатов производных декстрана и БСА методом флуоресценции. Показано, что в зависимости от соотношения гидрофильных и гидрофобных групп в полимере образуются два типа комплексов - с открытой поверхностью белковой глобулы и с поверхностью, покрытой полимерной цепью.

Изучены иммуногенные свойства полученных комплексов и ковалентных конъюгатов с БСА и г-глобулином в опытах на мышах, и установлено возрастание иммуногенности белковых антигенов после их включения в состав полимерных систем. Эти результаты могут быть использованы как в области фундаментальной биоорганической химии, так и в области создания полимерных вакцин.

Ключевые слова: полимер-белок конъюгаты, полиэлектролитные комплексы, флуоресцентная спектроскопия, иммуногенность.

Annotation

Demchenko M.O. Water-soluble complexes of proteins with the derivatives of dextran and polyacrylic acid. - Manuscript.

Thesis for a scientific degree of Candidate of Chemical Sciences (Ph.D. in Chemistry) in the specialty 02.00.10 - Bioorganic Chemistry. Institute of bioorganic chemistry and petrochemistry of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2002.

Dissertation is concerned in the studies of conjugation of proteins with modified polysaccharides, their complex formation with polyanions with the participation of transition metal ions, the studies of their physico-chemical properties and immunogeneity. An approach was developed for conjugation of proteins with modified polysaccharides with the formation of covalent bonds based on preliminary modification of these polysaccharides (dextran, dextran sulfate et. al.) by sodium periodate. The properties of these water-soluble conjugates with bovine serum albumin (BSA) and г-globulin were studied. The composition heterogeneity of the products of this reaction was shown.

On the basis of new sensor matrices developed by the author the kinetics of formation of protein-polymer conjugates was studied by the method of surface plasmon resonance and the dependence of this reaction on chemical structure of the matrix was found. Comparative studies of oligosaccharides such as unmodified dextran, aldehyde dextran, aldehyde dextran sulphate and ethyl cellulose, being materials to form matrix structures have been performed. Aldehyde dextran sulphate, a modified oligosaccharide polymer has been shown to be the optimum material to create a new matrix structure for affinity biosensors. The main distinction of the matrix from analogous structures developed previously consists in the presence of two active functional groups in the matrix, namely, aldehyde and sulphate. These groups offer a possibility to differentiate between themselves the functions of electrostatic attraction and covalent binding of biomolecules. Protein adsorption kinetics were compared qualitatively for all matrix.

The alternative method of formation of stable complexes polymer-protein with the participation of transition metal ions was applied for negatively charged polyelectrolytes. The comparative analysis of conformational state of protein (BSA) in ternary complexes with the participation of Cu2+ ions was provided by fluorescence method.

The derivatives of polyacrylic acid and dextran sulfate with BSA, were the subject of this research. It was shown that dependent on relative content of hydrophylic and hydrophobic groups in the polymer two types of complexes are formed - with exposed surface of protein globule and with the surface covered by the polymer coil. The structure of ternary PE-Cu2+-BSA complexes in PBS at pH 7.0 depends on the monomer composition of copolymers. At low amounts of hydrophobic monomer the forming polycomplex particles have friable structures with protein molecules practically exposed to the solution. Upon increase of hydrophobic monomer in the composition of copolymer, protein molecules in the ternary structure become densely covered as a shell by polymer chains and practically "fenced off" from the water environment. At low polymer concentrations, an intrapolymer complex is formed. This intrapolymer complex aggregates to interpolymer species upon increase in the polymer concentration. Cu2+ ions quencher fluorescence in the PE-Cu2+-BSA complex by a static mechanism, suggesting that polymer-metal complexes interact preferentially with BSA tryptophan site.

Fluorescence studies of interactions between polymer and protein were performed in ternary complexes: polymer + Cu2+ + BSA. Copolymers of acrylic acid with N-isopropylacrylamide with different content of polar groups showed different character of interactions with BSA. Copolymers with up to 50% of polar side groups exist in solution in the form of coil. Such coil binds to the protein molecule through Cu2+ ions forming a shell around it. At higher content of polar groups the polymer exists mainly in the form of threads, and BSA molecules are anchored on such threads through coordination bonds. The models of these complexes ternary organization are proposed.

The sulphate group of dextran sulphate can interact with albumin in the presence of metal ions. Different metals (Me) were used for formation of complexes. The character of interactions depends on the composition of [Me]/[DS] and [Me]/[BSA] ratio, the nature of metals and pH of medium. These studies revealed that in presence of different metal ions DS can form ternary polymer-metal-protein complexes with BSA.

The immunogenic properties of obtained complexes with BSA and г-globulin were studied in experiments on mice and the increase of immunogenecity of protein antigens after their inclusion into polymeric systems was observed. These results can be applied both in the field of fundamental bioorganic chemistry and also in the field of design of polymeric vaccines.

Key words: Protein-polymer conjugates; protein-polyelectrolyte complexes; chromatography, surface plasmon resonance; fluorescence spectroscopy; immunogenecity.

Размещено на Allbest.ru