Полімерні носії для іммобілізації біоактивних лігандів

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національний університет "Львівська політехніка"

УДК 541.64:678.4:678.7

05.17.06 - технологія полімерних та композиційних матеріалів

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата технічних наук

Полімерні носії для іммобілізації біоактивних лігандів

Петріна Романа Омелянівна

Львів-2001

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у Національному університеті "Львівська політехніка" Міністерства освіти і науки України.

Науковий керівник: доктор хімічних наук, професор Новіков Володимир Павлович, Національний університет "Львівська політехніка", завідувач кафедри технології біологічно активних сполук, фармації та біотехнології

Офіційні опоненти:

доктор хімічних наук, професор Суберляк Олег Володимирович, Національний університет "Львівська політехніка", завідувач кафедри хімічної технології переробки пластмас

кандидат технічних наук, професор Авраменко Вячеслав Леонідович, Національний технічний університет "Харківський політехнічний інститут", завідувач кафедри технології пластичних мас

Провідна установа Український державний хіміко-технологічний університет Міністерства освіти і науки України, кафедра хімічної технології високомолекулярних сполук, м. Дніпропетровськ

Захист відбудеться "04" лютого 2002 р. о 14.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 35.052.09 у Національному університеті "Львівська політехніка" за адресою: 79646, Львів-13, пл. Св. Юра, корпус IX, ауд.214.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Національного університету "Львівська політехніка" за адресою: 79013, Львів-13, вул. Професорська,1.

Автореферат розісланий "28" грудня 2001 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат технічних наук, доцент Вахула Я.І.

Анотації

Петріна Р.О. Полімерні носії для іммобілізації біоактивних лігандів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата технічних наук за спеціальністю 05.17.06 - технологія полімерних та композиційних матеріалів. Національний університет "Львівська політехніка", Львів, 2001 р.

Дисертація присвячена синтезу полімерних носіїв із діаметром 0,5-1,5 мкм та розробці технології отримання на їх основі композицій полімер-біополімер. Отримано частинки структури "ядро-оболонка" з карбоксильними та перестерними групами на поверхні та частинки "волосяної" структури із заданою довжиною спейсера, який містить гідрофільну групу. На основі таких систем створені полімерні носії з біологічно активними групами на поверхні для іммобілізації біоактивних лігандів. Вивчено основні закономірності процесу іммобілізації та визначено оптимальні умови його проведення.

Розроблено технологію отримання композиції полімер-біополімер на основі синтезованих полімерних носіїв, вивчено їх властивості. Досліджено адсорбцію біоспецифічного ліганду методом лазерного сканування дисперсних систем. іммобілізація полімерний карбоксильний

Розроблені технології отримання діагностикумів для експрес-індикації дифтерії та правцю на основі реакції аглютинації латекса. Описана технологічна схема отримання композиції і приведений лабораторний регламент синтезу.

Встановлено можливість використання композицій полімер-біополімер на основі полістирольних мікросфер з функціональними групами на поверхні як діагностикумів завдяки їх високій специфічності та чутливості.

Ключові слова: частинки структури "ядро-оболонка", олігомерні перестери, композиція полімер-біополімер, реакція аглютинації латекса, антиген, антитіло, іммобілізація.

Петрина Р.Е. Полимерные носители для иммобилизации биоактивных лигандов. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук по специальности 05.17.06 - технология полимерных и композиционных материалов. -Национальный университет "Львовская политехника", Львов, 2001 р.

Диссертация посвящена синтезу полимерных носителей с диаметром 0,5ё1,5 мкм и разработке технологии получения на их основе композиций полимер-биополимер. Изучено влияние количества мономера, инициатора, температуры, рН среды на диаметр концевых частиц и на коефициент полидисперсности. Описано пути модификации поверхности полистирольных микросфер. Показано, что с возрастанием концентрации мономера и инициатора возрастает возможность получения полимерных носителей с высоким коефициентом полидисперсности. При полимеризации мономерной смеси стирол:пермалеинат на полистирольных микросферах получено частицы структуры "ядро-оболочка" с узким распределением по размерам и с диаметром частиц 0,8ё1,5 мкм с карбоксильными и перэстерными группами на поверхности. Также изучено и проведено модификацию полистирольных частиц за счет адсорбции реакционноспособных ПАВ. Олигомерные перэстеры, которые были использованы для адсорбционного титрирования, были с разной длиной гидрофильного фрагмента. Исследовано распределение перэстерных фрагментов в латексах, их количество. Получено латексы "волосяной" структуры с заданой длиной спейсера, который имеет гидрофильную группу, способную иммобилизировать белок.

На основе таких систем получены полимерные носители с биологически активными группами на поверхности для иммобилизации биоактивных лигандов. Установлено, что такие полимерные носители удовлетворяют требования, которые необходимы для использования их в имунодиагностике. Изучено основные закономерности процесса иммобилизации и определено оптимальные условия его проведения. Изучено оптимальные условия сорбции дифтерийного и столбнячного антигенов на частицы латекса.

Разработано технологию получения композиции полимер-биополимер на основе синтезированных полимерных носителей, изучено их свойства. Исследовано адсорбцию биоспецифического лиганда методом лазерного сканирования дисперсных систем. Разработаны технологии получения диагностикумов для експрес-индикации дифтерии и столбняка на основе реакции аглютинации латекса. Описана технологическая схема получения композиции и приведены лабораторные регламенты синтеза. Впервые установлена и экспериментально подтверждена в клинических условиях диагностическая ценность и эффективность разработанной тест-системы для выявления дифтерии и ее диагностики. Использование новой тест-системы позволяет в максимально короткий срок с высокой чувствительностью (95%) и специфичностью (92%) диагностировать дифтерию, независимо от возраста и пола больного. Установлена возможность использования композиции полимер-биополимер на основе полистирольных микросфер с функциональными группами на поверхности как диагностикумов в связи с их высокой специфичностью и чувствительностью.

Ключевие слова: частицы структуры "ядро-оболочка", олигомерные перэстэры, композиция полимер-биополимер, реакция аглютинации латекса, антиген, антитело, иммобилизация.

Petrina R.O. Polymeric carriers for an immobilization of bioactive ligands. - Manuscript.

Thesis for a scientific degree of Technical Sciences in speciality 05.17.06 - Technology of polymeric and compositive materials. - Lviv Polytechnic National University, Lviv, 2001.

The dissertation deals with the synthesis of polymeric carriers about a dia 0,5-1,5 microns and elaborating of technology of obtaining on their basis of compositions a polymer - biopolymer. An influence of different factors (quantity of a monomer, initiator, temperature, рН of medium) on diameter of particles and on the factor of a polydispersity was defined. Modification of the surface of polysterene microspheres was studied. As a result of particles "core - shell" structure with carboxyl and perether groups on a surface and particles "hair" structure with by given in length of spacer, which one contains hydrophilic group were obtained. On the basis of such systems the polymeric carriers with biologically active groups on a surface for an immobilization of bioactive ligands are obtained. The basic regularities of the process of an immobilization were investigated and the optimal conditions of its conducting were defined.

The technology of obtaining of polymer - biopolymer composition on the basis of the synthesized polymeric carriers was elaborated and their properties were studied. An adsorption of a biospecific ligand by a method of laser scanning of disperse systems was investigated. The technologies of obtaining of diagnosticums for express-indication diphtheritic and tetanus were designed on the basis of reacting of agglutination of latex. The possibility of using of composition a polymer - biopolymer on the basis of polystyrene microspheres with functional groups on a surface as diagnosticums due to their high specificity and sensitivity was proved.

Keywords: particles "core-shell" structure, oligomer perether, composition polymer-biopolymer, reaction of latex agglutination, antigen, antibody, immobilization.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Полімерні мікросфери з функціональними групами на поверхні широко використовуються в біотехнології, мікробіології, біохімії, фармакології та інших галузях. Однак вимоги, які ставить сучасний розвиток техніки до матеріалів на основі полімерних мікросфер, викликають необхідність створення на їх основі композицій полімер-біополімер. Причому, найкращі показники проявляють композиції, в яких біополімери ковалентно зв'язані з полімерними носіями.

Із всіх полімерних носіїв особливого інтересу заслуговують полімерні мікросфери з вузьким розподілом частинок за розмірами, з функціональними групами на поверхні і високою стійкістю в часі, так як вони використовуються для імунодіагностики, сепарації білків, як носії для імуноферментного аналізу, спрямованого транспорту ліків, як матриці при проведенні гетерофазних процесів, в якості калібрувальних еталонів і т.п. Однак, на сьогодні відсутні вітчизняні доступні і прості методи синтезу функціональних полімерних мікросфер, які б використовувались як носії при створенні композиції полімер-біополімер при виготовленні діагностичних тест-систем на деякі інфекційні захворювання. Крім того, деякі діагностикуми є нестабільні в часі і втрачають свою активність. Виробництва полімерних суспензій подібного типу в Україні немає, і в даний час реакцію латекс-аглютинації проводять з використанням закордонних діагностикумів.

Отже, потреба в створенні вітчизняних діагностичних тест-систем на основі композицій полімер-біополімер є надзвичайно актуальна, тому що полімерні мікросфери з функціональною поверхнею дозволяють ковалентно іммобілізувати біоспецифічні ліганди.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана у відповідності з державними науково-технічними програмами "Створення, вивчення та впровадження в практику охорони здоров'я України гостро необхідних лікарських засобів" (проект №1.02), "Нові хімічні речовини і матеріали малотоннажного виробництва для заміни імпортованих" (проект №2.11), "Нові екологічно безпечні лікувальні засоби" (проект №03.06.01/001-95, 03.07/02441).

Мета і завдання дослідження. Метою дисертаційної роботи є одержання монодисперсних полістирольних мікросфер із діаметром 0,5-1,5 мкм, шляхи модифікації поверхні і розробка технології отримання композицій полімер-біополімер для експрес-діагностики ряду захворювань людини за допомогою реакції аглютинації латекса (РАЛ).

Для досягнення поставленої мети необхідно було:

синтезувати полістирольні мікросфери з діаметром 0,5-1,2 мкм та вузьким розподілом за розмірами;

провести модифікацію поверхні методом полімеризації на зародках, а саме полімеризацію мономерної суміші стирол:пермалеїнат на зародках полістиролу, з отриманням композитних частинок структури "ядро-оболонка";

провести модифікацію поверхні за рахунок адсорбції олігомерного перестеру з отриманням композитних мікросфер "волосяної" структури, що містять реакційно здатні групи для іммобілізації біоспецифічного ліганду;

створити композиції полімер-біополімер з заданою відстанню біоспецифічного ліганду від полімерної матриці;

розробити тест-систему для експрес-діагностики дифтерії та правцю на основі реакції аглютинації латекса;

дослідити адсорбцію біоспецифічного ліганду методом лазерного сканування дисперсних систем;

розробити експериментальні серії нових діагностичних тест-систем;

розробити лабораторні регламенти на нові діагностичні тест-системи;

розробити методики для визначення кінетики проходження реакції антиген-антитіло.

Об'єкт дослідження - композиції полімер-біополімер, які придатні для використання їх як діагностикумів.

Предмет дослідження - ковалентна іммобілізація дифтерійного та правцевого анатоксинів на синтезованих монодисперсних полістирольних носіях з функціональними групами на поверхні.

Методи дослідження - синтез полімерних носіїв проводили шляхом беземульгаторної емульсійної полімеризації, діаметр частинок визначали за допомогою методів електронної мікроскопії, молекулярні маси визначали методом гель-проникаючої хроматографії, очистку проводили методом неперервної ультрафільтрації на ядерних фільтрах, заряд визначали за допомогою лазерних лічильників, масову долю білка визначали за методом Лоурі, проходження РАЛ вивчали за допомогою нефелометричного прилада.

Наукова новизна одержаних результатів. Розроблено наукові основи формування модифікованої поверхні методом полімеризації на зародках та встановлені оптимальні технологічні умови проведення полімеризації мономерної суміші стирол:пермалеїнат на зародку полістиролу з отриманням латексних частинок структури "ядро-оболонка" з високим вмістом карбоксильних та перестерних груп на поверхні.

Вперше розроблений метод модифікації поверхні за рахунок адсорбції олігомерного перестеру та отримано латекси з частинками "волосяної" структури з регульованою довжиною ланцюга. Такі частинки містять реакційноздатні групи, здатні іммобілізувати біоспецифічні ліганди. Вперше встановлено, що утворені на їх основі композиції полімер-біополімер отримуються із заданою відстанню біоспецифічного ліганду від полімерної матриці.

Вперше розроблені технології отримання діагностикумів для експерес-індикації дифтерії та правцю на основі реакції аглютинації латекса, в результаті чого отримано специфічні і чутливі тест-системи. Вивчено основні закономірності процесу іммобілізації цих систем та розроблена оптимізація технології отримання композиції полімер-біополімер.

Досліджено РАЛ дифтерії методом лазерного сканування дисперсних систем. Показано, що даним методом можна вивчати кінетику проходження РАЛ та кінетику адсорбції біоспецифічного ліганду на полімерних носіях.

Практичне значення отриманих результатів. На основі виконаних експериментальних досліджень розроблені модифіковані полістирольні композиції та нові технології процесу формування монодисперсних латексів.

Розроблені і одержані експериментальні серії нових діагностичних тест-систем з використанням РАЛ, які мають високу чутливість та специфічність. Метод з використанням латексних діагностикумів значно простіший в постановці, не потребує спеціальної апаратури, може використовуватись в лабораторіях при масових обстеженнях напруженості імунітету населення, що дає значний економічній ефект в порівнянні з іншими методами.

Розроблені лабораторні регламенти на нові діагностичні тест-системи для їх серійного виробництва.

Розроблено методики оцінки швидкості РАЛ і при заданій концентрації біоліганду на поверхні визначено їх відносні реакційні здатності по відношенню до використаного антигену.

Особистий внесок здобувача полягає в тому, що вона приймала участь в постановці проблеми, в розробці та опрацюванні методик експериментальних досліджень, у виконанні всіх експериментальних досліджень, в обробці отриманих даних та в теоретичному обґрунтуванні отриманих результатів.

Апробація результатів дисертації. Результати роботи доповідались і обговорювались на XVIII Українській конференції з органічної хімії (Дніпропетровськ, 1998); Міжнародній конференції "Полімери в дисперсійному середовищі" (Ліон, Франція, 1999); IV міжнародній конференції по кореляційній техніці (Чернівці, 1999); 2-ій науково-технічній конференції "Поступ в нафтогазопереробній і нафтохімічній промисловості" (Львів, 1999), Міжнародній медичній конференції (Львів, 1999).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 5 статей, 6 тез доповідей, одержано 2 патенти на винахід.

Структура та об'єм дисертації. Дисертація викладена на 134 сторінках і складається з вступу, огляду літератури, експериментальної частини, 4 розділів власних досліджень, висновків, списку літератури, який містить 188 джерел і додатків. Матеріали дисертації ілюстровано 26 таблицями і 24 рисунками.

Основний зміст роботи

В першому розділі дисертаційної роботи проведено аналіз літературних джерел з питань синтезу монодисперсних полімерних носіїв методом суспензійної та емульсійної полімеризації. Розглянуто адсорбцію білків на полімерних мікросферах з різними функціональними групами на поверхні та вплив заряду поверхні, гідрофобності білка і сорбенту, морфології поверхні сорбенту на адсорбцію білків на полімерні носії. Описано закономірності одержання полімерних носіїв на основі похідних стиролу, пермалеїнату, полівінілового спирту тощо. Показана перспективність одержання біологічно активних полімерних мікросфер для використання їх як носіїв для іммобілізації біоактивних лігандів.

Обгрунтовані шляхи використання іммобілізованих систем в біотехнології, медицині, імунодіагностиці та інших промисловостях.

У другому розділі наведено характеристики вихідних речовин і методики проведення експериментів. Як об'єкти досліджень використано свіжоперегнаний мономер стирол із вмістом основної речовини не нижче 99,98%, персульфат калію (ПК) як ініціатор, пермалеїнат (ПМ), олігомерні перефіри з М=708 та кисл.числом - 158 мгКОН/г, бичачий сироватковий альбумін (БСА), дифтерійний та правцевий анатоксини і антидифтерійну та антиправцеву сироватки.

Синтез полістирольних мікросфер проводили за стандартними методиками проведення емульсійної полімеризації при 80^оС, перемішуванні з частотою обертання мішалки 300 об/хв протягом 8-10 годин. Визначення розміру частинок проводили методом електронної мікроскопії за допомогою мікроскопа S-570 "Hitachi" (Японія), молекулярні маси визначали методом гель-проникаючої хроматографії, вимірювання розподілу частинок за розмірами (РЧР) знято на приладі "Malvern Autosizer". У роботі також використовувалось ультрацентрифугуваня та потенціометричні методи дослідження.

Наведені методики іммобілізації білків на поверхні полістирольних мікросфер, описи методик визначення масової долі білка за Лоурі, вибір умов зберігання діагностикумів та методика проведення реакції аглютинації латекса (РАЛ). Наведений нефелометричний метод визначення швидкості РАЛ.

У третьому розділі наведені результати досліджень з розроблення методів формування монодисперсних полімерних мікросфер на основі полістиролу методом емульсійної беземульгаторної полімеризації.

Формування монодисперсних мікросфер відбувалось за механізмом гомогенної нуклеації при 80^оС і перемішуванні з частотою обертання мішалки 200ч500 ± 5 об/хв. Концентрація ПК змінювалась в межах (20,0-25,5)10^-3 моль/л. Мономер вводили одноразово і порційно. Концентрацію мономеру змінювали в межах 0,545-1,200 моль/л. Синтез латексів проводили протягом 10 годин.

Вивчено вплив кількості стиролу та ПК на кінцевий діаметр частинок та коефіцієнт полідисперсності. Встановлено, що збільшення в певних межах концентрації мономеру і ініціатора приводило до збільшення розміру частинок.

Показано залежність монодисперсності і середнього діаметру частинок (D_п) латексів від початкової концентрації стиролу у водній фазі. Визначення монодисперсності беземульгаторних латексів показує, що коефіцієнт полідисперсності (K_п) кінцевих дисперсій залежить від вихідної концентрації мономеру (C_M).

Отримані результати свідчать, що при певних концентраціях мономера з ініціатором (1,089 моль/л: 24,810^-6моль/л) отримано частинки в інтервалі значень 0,51,2 мкм, K_П=0,880,99, різними зарядами на поверхні та певною кількістю сульфогруп. Ці концентрації мономера та ініціатора є оптимальними, тому що введення більшої кількості стиролу приводить до утворення в процесі синтезу коагулюму на стінках реактора і на мішалці, крім того не вдається досягнути монодисперсності. Збільшення концентрації ПК від 24,8 кмоль/л приводить до зменшення швидкості полімеризації.

Отримані полістирольні суспензії надалі було використано для модифікації поверхні. Модифікація проводилася двома методами. Перший - це модифікація за рахунок полімеризації на зародках і утворення частинок структури "ядро-оболонка". Другий - це модифікація за рахунок адсорбції реакційноздатних ПАР, в якості яких було використано олігомерний перефір, і утворення частинок "волосяної" структури.

З метою синтезу біологічно активних полімерних носіїв з карбоксильними та перестерними групами на поверхні вивчено полімеризацію на зародках, яку проводили у дві стадії. Як зародкові використано частинки, отримані на першому етапі роботи, на які полімеризовано мономерну суміш стирол-пермалеїнат.

Полімерні суспензії готували при 80⁰С протягом 10 год. з перемішуванням з частотою обертання мішалки від 200 до 500 об/хв, рН - 77,5. Як ініціатор використано ПК з концентрацією 1% (мас.) у водній фазі. Об'ємне співвідношення мономерної та водної фази бралося 1:10.

Вибір об'ємного співвідношення мономерної та водної фази визначався умовами одержання стабільних в процесі синтезу суспензій. Розмір частинок також змінювався від рН середовища, що очевидно пов'язано як із розмірами первинноутвореної частинки, так і з процесом агрегації, який відбувається в ході реакції.

Використано три різні латекси, що містять мікрочастинки різних розмірів, поверхня яких має різний заряд. Мономерну суміш вводили одноразово і порційно.

Вивчено вплив температури, рН, концентрації мономеру та ПМ на кінцеву морфологію частинок, їх діаметр та коефіцієнт полідисперсності отриманих суспензій. Встановлено, що коефіцієнт полідисперсності зростає в залежності від збільшення концентрації ПМ в мономерній суміші до 50%. Багаторазова подача мономерної суміші відчутно впливає на зростання коефіцієнту полідисперсності з 0,7 до 0,9. Це свідчить про те, що для утворення правильної структури "ядро-оболонка" потрібно, щоб відбувалось поступове нарощування шару функціонального полімеру, тобто потрібно порційно подавати мономерну суміш.

Отримані результати свідчать, що цей метод відкриває можливості синтезу полімерних мікросфер заданого діаметру в широкому інтервалі діаметрів з вузьким РЧР; регулюванням концентрації карбоксильних та перефірних груп на поверхні частинок будь-якого діаметру, а також гідрофільних та гідрофобних властивостей поверхні частинок полімерної суспензії при збереженні їх розмірів; отримання надійних і відтворюваних результатів за властивостями синтезованих полімерних суспензій.

При полімеризації мономерної суміші стирол:пермалеїнат на зародках полістиролу отримано частинки з вузьким розподілом за розмірами та з діаметром частинок 0,81,5 мкм з карбоксильним та перефірними групами на поверхні, які здатні адсорбувати біоактивні ліганди. Вони задовільняють вимоги, що необхідні для використання їх в імунодіагностиці.

Для одержання монодисперсних полімерних носіїв "волосяної" структури було вивчено та проведено адсорбцію реакційно здатних ПАР, які здатні з однієї сторони забезпечувати ковалентну взаємодію біоспецифічного ліганду, а з другої сторони забезпечувати прищеплення до різних типів поверхні за рахунок адсорбції і генерації радикалів в зоні контакту, що забезпечує ковалентне зв'язування з полімерною матрицею.

Структура поверхнево-активних модифікаторів

де 1 - фрагмент, що забезпечує адсорбцію і генерацію радикалів; 2 - реакційноздатний фрагмент для іммобілізації біоспецифічного ліганду; 3 - фрагмент, що забезпечує потрібну відстань від поверхні; n=3,9,12.

Під час першої стадії відбувається адсорбція ПАР з неперервної водної фази на поверхню частинок, а також адсорбція ПАР у поверхневі шари частинки та в об'єм ПЧ.

Для визначення загальної кількості перестерних фрагментів всередині, на поверхні латексних частинок, а також вмісту гідропероксиду в водній фазі користувалися комбінацією йодометричного і цериметричного методів.

Показано, що у водній фазі вільний гідропероксид і перефірні фрагменти відсутні; олігоефір розміщений на міжфазній границі таким чином, що всередині частинки міститься 30-40% пероксидних груп, а решту повернені у водну фазу.

Під час другої стадії модифікації відбувається прищеплення вільних радикалів, яке ініціюється у поверхні за рахунок гомолітичного терморозпаду перефірів.

Зручним методом, який дає змогу оцінити зміни, що відбуваються на поверхні частинок при функціоналізації або з часом, є вимірювання динамічної вязкості дисперсії при малих швидкостях зсуву. Динамічну в'язкість дисперсій вимірювали на ротаційному віскозиметрі "RHEOTEST 2.1".

Функціоналізація поверхні латексних частинок при формуванні дисперсій за участю ПАР характеризує появу чітко визначених екстремумів на кривих залежності в'язкість-напруга зсуву, а також зміщує напругу зсуву в бік менших їх значень.

Отримано латекси "волосяної" структури з заданою довжиною спейсера, який містить на кінці гідрофільну групу, здатну іммобілізувати білок.

Таким чином, вперше синтезовані монодисперсні латексні частинки з різними функціональними групами на поверхні (сульфогрупи, карбоксильні та перестерні групи, гідроксильні групи), які задовольняють вимоги, що необхідні для використання їх в імунодіагностиці з подальшим використанням для іммобілізації біоактивних лігандів.

У четвертому розділі подані результати досліджень формування композицій полімер-біополімер. Як полімерні носії використано синтезовані монодисперсні полістирольні мікросфери трьох типів:

ПС - стирольні частинки з сульфатними групами на поверхні, ПС-ПМ - стирольні частинки з карбоксильними та перестерними групами на поверхні, ПС-ОП - стирольні частинки з ПАР на поверхні частинок; як біополімер - дифтерійний та правцевий анатоксини.

Деякі критерії полімерних латексних частинок представлені в табл.2.

Таблиця 2 Характеристика латексних частинок

	Середній діаметр частинок Dп, мкм	Коефіцієнт полідисперсності, КП	Функціональні групи на поверхні	рН	Заряд поверхні, мВ
ПС-1	0,96	0,8	-OSO3	6,5-7,0	-30,1
ПС-2	0,88	0,92	-OSO3	6,5-7,0	-49,8
ПС-3	0,75	0,99	-OSO3	6,5-7,0	-80,2
ПС-ПМ	1,2	0,99	-COOH -COOC2H5	7,0-7,5	-
ПС-ОП 3	0,75	0,99	-OH	5,0-7,0	-
ПС-ОП 9	0,75	0,99	-OH	5,0-7,0	-
ПС-ОП 12	0,75	0,99	-OH	5,0-7,0	-

Процес іммобілізації білка на поверхню полімерних носії проводили при різній концентрації білка і постійному перемішуванні реакційної маси протягом 2 год при 37⁰С. З метою визначення оптимальних умов посадки антигенних детермінант були проведені дослідження в різних буферних системах. Встановлено, що найкращі результати отримані в гліциновому буферному розчині при рН 8,2.

В результаті проведених досліджень будо встановлено, що існує залежність чутливості отриманих латекс-тестів від кількості білка, адсорбованого на полімерних мікросферах, яка, в свою чергу, визначається умовами проведення адсорбції. Найбільшу чутливість РАЛ вдається отримати при величинах адсорбції, які не досягнули свого граничного значення і складають 0,3-0,5 від Г_max. Це відповідає концентрації білка в розчині менше 1 мг/мл.

Виходячи з одержаних результатів, була розроблена технологія одержання на основі синтезованих біологічно активних полімерних носіїв - композицій полімер-біополімер, які можуть бути використані як діагностичні тест-системи в імунодіагностиці.

Наступним етапом було проведення оптимізації технології синтезу створених діагностичних препаратів. Так як активність діагностичних латексних препаратів падала, з метою вдосконалення технології синтезу та підвищення стабільності зв'язку білкового компонентну діагностикуму з латексною частинкою, мікросфери обробляли 1% розчином тетраборату натрію (інкубація протягом 1 год. з наступним відмиванням в робочому буфері).

Як стабілізатор використано БСА. Діапазон досліджуваних концентрацій БСА складав 0,002%, 0,1% та 1,0%. В РАЛ з препаратами, що містили 0,002% БСА спостерігали спонтанну аглютинацію. При перевірці композицій з 1,0% БСА РАЛ була негативною, очевидно, за рахунок надмірного блокування рецепторів латексу. Як видно, БСА у досліджуваних концентраціях не знижував активність діагностикумів. Однак, при зберіганні протягом 1 місяця максимальною активність була при концентрації БСА 0,1%. Для прикладу, активність дифтерійних латексних препаратів, створених на основі ПС-ПМ та оброблених 0,7% БСА при зберіганні протягом місяця зменшилась від 0,0015 МО/мл до 0,0125 МО/мл, а активність латексних перпаратів з 0,1% БСА за цей самий термін - від 0,0015 МО/мл до 0,006 МО/мл. Використання БСА в концентрації 0,1% збільшує термін зберігання препаратів, але активність їх в часі все-таки падає. І як було показано 0,1% БСА знижує кількість неспецифічних реакцій та знімає проблему спонтанної реакції в контролях.

Як речовина, що позитивно впливає на стабільність активності сконструйованих латексних препаратів в часі - обрано глутаровий альдегід (ГА). Діапазон досліджуваних концентрацій ГА складав 0,005 - 0,1%. Експериментально доведено, що ГА в такому діапазоні концентрацій не знижує активність латексного препарату, але при зберіганні на протязі 1 місяця максимальною є активність латексного перпарату з концентрацією ГА 0,1%. При порівнянні стабілізуючої здатності БСА та ГА виявлено, що, наприклад, після обробки 0,1% БСА активність дифтерійного латексного перпарату, створеного на основі латексу ПС-1 (табл.2) при зберіганні зменшилась від 0,003 МО/мл до 0,0125 МО/мл, правцевого латексного препарату - від 0,006 МО/мл до 0,0125 МО/мл. При обробці 0,1% БСА та 0,1% ГА падіння активності було менш значним: для дифтерійного латексного перпарату - від 0,003 МО/мл до 0,006 МО/мл, для правцевого латексного препарату від 0,006 МО/мл до 0,0125 МО/мл.

Опрацьовано оптимальні умови постановки РАЛ з отриманими діагностичними препаратами. Показано, що найкращі результати спостерігаються при використанні 0,1 М гліцинового буферу (рН 8,2) при відношенні реагентів: 90 мкл сироватки і 20 мкл латексного діагностикума. Час, необхідний для проведення РАЛ складає 30-40 хв, а початок аглютинації спостерігається вже через 10 хв.

Досліджено адсорбцію біоспецифічного ліганду методом лазерного сканування дисперсних систем, розроблено методики оцінки швидкості РАЛ і при заданій концентрації біоліганду на поверхні визначено їх відносні реакційні здатності по відношенню до використаного антигену.

У п'ятому розділі наведені результати практичного використання латексних діагностикумів.

Визначена діагностична цінність РАЛ із створеними латексними дифтерійним та правцевим діагностикумами у порівнянні з реакцією пасивної гемаглютинації (РПГА).

Для оцінки ефективності імунізації проти дифтерії та правцю було вивчено напруженість та тривалість імунітету в РПГА і РАЛ. Досліджено 530 сироваток з метою вивчення ефективності двох серологічних методів.

Визначена чутливість та специфічність РАЛ із створеним латексним дифтерійним діагностикумом у порівнянні з клініко-рентгенологічним обстеженням (табл. 3,4).

Таблиця 3 Порівняння чутливості та специфічності РАЛ з клінічними методами діагностики дифтерії

Реакція аглютинації латексу	Клінічне обстеження	Всього
	Позитивні	Негативні
Позитивні результати	167	9	176
Негативні результати	8	112	120
Всього	175	121	296

Співпадіння результатів (167+112)/296х 100% = 94%

Чутливість реакції 167/175х 100% = 95%

Специфічність 112/121х 100% = 92%

Таблиця 4 Порівняння чутливості та специфічності РПГА з клінічними методами діагностики дифтерії

Реакція пасивної (непрямої) гемаглютинації	Клінічне обстеження	Всього
	Позитивні	Негативні
Позитивні результати	122	69	191
Негативні результати	53	52	105
Всього	175	121	296

Співпадіння результатів (122+52)/296х 100% = 58%

Чутливість реакції 122/175х 100% = 70%

Специфічність 52/121х 100% = 43%

Результати показали, що діагностична система є високочутливою та специфічною для виявлення дифтерії. Проводився додатковий аналіз: залежність результатів від віку та статі обстежених, який показав, що РАЛ є важливим критерієм у різних вікових групах хворих на дифтерію.

Результати апробації в лабораторних умовах і при сероепідеміологічних дослідженнях населення підтвердило високу специфічність та чутливість розроблених препаратів у поєднанні з простотою виконання, експресністю, швидким візуальним обліком результатів, значним економічним ефектом за рахунок здешевлення сировини (носія антигену), що дає можливість ставити питання про організацію промислового виробництва їх для забезпечення лабораторної служби країни.

У шостому розділі проведена оптимізація результатів експериментальних досліджень щодо складу мономерної суміші і умов формування полімерних мікросфер структури "ядро-оболонка". Для цього були сформовані відповідної форми таблиці зі статистичною інформацією, отриманою експериментально для кожного досліджуваного технологічного процесу зокрема і побудовані відповідні моделі у вигляді рівнянь регресії.

Висновки

Розроблено основи технології формування полімерних композитних частинок з вузьким розподілом за розмірами (К_n=0,88-0,99) в інтервалі значень від 0,5 до 1,0 мкм на основі полістиролу з регульованою концентрацією сульфогруп на поверхні частинок.

Розроблений метод формування композитних частинок структури "ядро-оболонка" в інтервалі значень 0,8-1,5 мкм з регульованою концентрацією карбоксильних та перефірних груп (одна група на 50-55 Е²) на поверхні частинок на основі полістиролу і його співполімеру з перефіром, функціональні групи яких здатні адсорбувати біоактивні ліганди. Встановлено, що на розміри частинок і формування композитної структури "ядро-оболонка" з досягненням певного вмісту функціональних груп на поверхні впливає заряд зародкової частинки, об'ємне співвідношення мономерної та водної фази, періодичність подання мономерної суміші.

Вивчено модифікацію полімерних дисперсій реакційноздатними олігомерними перефірами з різною довжиною гідрофільного фрагмента. Отримано нові композитні мікросфери, що містять на поверхні реакційноздатні ОН-групи для іммобілізації біоспецифічного ліганду.

Визначено умови формування композиції полімер-біополімер за рахунок сорбції дифтерійного та правцевого анатоксинів на частинки латексів (Т=37^оС, рН=8,2 в гліциновому буфері, час - 2-3 год.), підібрані оптимальні режими сенсибілізації полістирольних носіїв з використанням гліцинового буферу та встановлено оптимальну сенсибілізуючу дозу для всіх антигенних детермінант (500 мкг/мл), що використовуються для приготування діагностичних препаратів.

Отримано композиції полімер-біополімер на основі полістирольних мікрофер, мікросфер структури "ядро-оболонка" з карбоксильними та перефірними групами на поверхні, мікросфер "волосяної" структури з гідрофільним спейсером та досліджено вплив довжини гідрофільного фрагмента олігомерного перефіру та оптимальних умов адсорбційного титрування ПАР на іммобілізацію дифтерійного та правцевого антигену.

Встановлено, що обробка розчином тетраборату натрію створених тест-систем підвищує стабільність зв'язку між білком і латексними частинками, а обробка стабілізаторами БСА та ГА позитивно впливає на збереження активності латексних діагностикумів. Запропоновано обробляти отримані тест-системи 1%-им розчином тетраборату натрію, 0,1-% розчинами ГА та БСА та консервувати 0,1-% азидом натрію.

Розроблено методики для дослідження адсорбції біоспецифічного ліганду та оцінки швидкості РАЛ методом лазерного сканування дисперсних систем і для визначення при заданій концентрації біоліганду на поверхні їх відносної реакційної здатності по відношенню до використаного антигену.

За допомогою математичної оптимізації експериментів складені рівняння регресії для складу мономерної суміші і встановлені оптимальні параметри проведення процесу формування полімерних мікросфер структури "ядро-оболонка".

Проведені клінічні випробування підтвердили високу специфічність та чутливість розроблених діагностичних препаратів та можливість використання їх для діагностичних тестів для виявлення дифтерії та правцю у сироватці крові.

Основний зміст дисертації викладено у роботах

1. Р.О. Петріна, Є.М. Кісельов, О.З. Зарічна, В.П. Новіков. Полімерні мікросфери для ковалентного зв'язування біоспецифічних лігандів // Вісник ДУ "ЛП". -1999. -№374. -С.70-73.

3. Р.О. Петріна, Є.М. Кісельов, Л.І. Лонич. Полімерні носії для імунодіагностики // Вісник НУ "ЛП". -2000. - №414. - С.162-164.

3. Краюткіна О.М., Петріна Р.О., Кісельов Є.М., Чуйко Л.С. Синтез полімерних носіїв на основі стиромалю // Вісник ДУ "ЛП". -1999. - №361. - С.86-89.

4. Р. Петріна, Є. Кісельов, В. Новіков, Х. Гаргай. Створення монодисперсних полімерних мікросфер, сучасні можливості макромолекулярного дизайну на їх основі // Наукові записки Тернопільського ДПУ. Хімія. - Вип.4. -1999. -С.45-49.

5. Заявка. 2000105773 Україна, МПК 7CO8L7/00, C12N1/00. Спосіб виготовлення тест-системи для експрес-індикації дифтерійного антитоксину в крові людини / І.Н. Безкопильний, А.В. Вербінець, Л.І. Лонич, Н.В. Сенюк, Р.О. Петріна, Є.М. Кісельов О.З. Зарічна (Україна); Заявл. 12.10.2000;

6. Заявка 2000105774 Україна, МПК 7CO8L7/00, C12N1/00. Спосіб виготовлення тест-системи для експрес-індикації правцевого антитоксину в крові людини / І.Н. Безкопильний, А.В. Вербінець, Л.І. Лонич, Р.О. Петріна, Є.М. Кісельов, О.З. Зарічна, А.В. Сибірний, Н.В. Сенюк (Україна); Заявл. 12.10.2000;

7. Кісельов Є.М., Петріна Р.0., Стадник С.В., Лонич Л.І., Зарічна 0.3. Створення полімерних мікросфер з функціональними групами на поверхні // тези доп. XVIII Укр. конф. з орг. хімії., Дніпропетровськ. -1998.-ч.2, с. 403.

8. Kiselyov E., Petrina R., Krayutkina O. Modification particle with utilizing surface activity peroxyde for immobilization bio specific ligand // Int. Symposium on "Polymer in dispersed media", Lyon (France). -1999. -P.305.

9. Kiselyov E., Petrina R., Chervetsova V. Modification surface of particles with utilizing hydroperoxide groups // Int. Symposium on "Polymer in dispersed media", Lyon (France). -1999. -P.306.

10. O.I. Bilyi, E.M. Kiselyov, R.O. Petrina, Ya.P. Ferensovich, R. Ya. Yaremyk. Immunoassay control method on the base light scattering // Fourth Inter. Conf. "Correlation Optics". 1999. Pros.SPIE. - V.3904. -P.601-605.

11. Петріна Р.0., Краюткіна О.М., Кісельов Є.М., Лонич Л.І. Полімерні носії з реакційноздатними функціональними групами // тези 2-ої наук.-техн. конф. "Поступ в нафтогазопереробній і нафтохімічній промисловості". -1999, с. 172.

Размещено на Allbest.ru