Хроматографические методы

Размещено на http://www.allbest.ru/

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФГБОУ ВПО «СЫКТЫВКАРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

ИНСТИТУТ ЕСТЕСТВЕННЫХ НАУК

КАФЕДРА ХИМИИ

Методические указания для студентов

Хроматографические методы в лабораторном практикуме

Сыктывкар 2012

Данные методические указания посвящаются одной из многочисленных разновидностей хроматографии - жидкостно-адсорбционной. Обсуждаются вопросы, связанные с техникой эксперимента тонкослойной и колоночной хроматографии. Практические работы, описанные в указаниях, входят в программу лабораторного практикума по органической химии.

Методические указания предназначены для студентов - химиков Института естественных наук Сыктывкарского университета.

Составители: к.х.н., доцент Залевская О.А., Чудникова М. В.

Содержание

Введение

1. Жидкостно-адсорбционная хроматография

1.1 Степень адсорбции и строение веществ

1.2 Выбор адсорбента

1.3 Выбор элюента

1.4 Техника эксперимента

2. Практические работы

2.1 Определение активности окиси алюминия

2.2 Определение качественного состава смеси красителей с помощью ТСХ

2.3 Разделение смеси красителей с помощью колоночной хроматографии

Контрольные вопросы

Литература

Приложение

адсорбция хроматография элюент

Введение

Хроматографией называется физико-химический метод разделения смеси веществ, заключающийся в перемещении смеси потоком подвижной фазы вдоль слоя сорбента (неподвижная фаза). Вследствие различия коэффициентов распределения для отдельных компонентов смеси между подвижной и неподвижной фазами происходит селективное замедление движения компонентов, что приводит при достаточной длине слоя сорбента к образованию зон отдельных компонентов смеси. Впервые этот метод был использован русским ботаником М.С. Цветом для разделения смеси растительных пигментов в 1903 году. При этом в колонке с адсорбентом наблюдалось образование ряда окрашенных слоев, что и побудило автора присвоить новому методу название хроматография - цветописание. Хроматографические методы могут быть использованы как для анализа состава смеси - аналитическая хроматография, так и для выделения компонентов смеси в чистом виде - препаративная хроматография.

Хроматографические методы идентификации, разделения и очистки химических веществ находят самое широкое применение в любой лаборатории. Выпускники ВУЗа (как химики, так и биологи) должны знать основы хроматографических методов исследования и владеть экспериментальными навыками. Данные методические указания посвящаются одной из многочисленных разновидностей хроматографии жидкостно-адсорбционной (тонкослойной и колоночной). Именно эти методы получили самое широкое применение в органической химии в связи с их простотой и оперативностью.

1. Жидкостно-адсорбционная хроматография

Неподвижные фазы могут отличаться как по агрегатному состоянию (жидкость или твердые вещества), так и по природе сорбционного взаимодействия с молекулами разделяемой смеси. Неподвижная фаза может:

концентрировать вещество на границе раздела фаз вследствие адсорбции (адсорбционная хроматография);

удерживать вещество вследствие хемосорбции (ионнообменная);

избирательно растворять компоненты смеси (абсорбционная или распределительная);

задерживать одни вещества и пропускать другие в зависимости от размеров и форм их молекул (гель-фильтрация, ситовая или афинная хроматография). [1]

В таблице 1 перечислены основные разновидности хроматографии, классифицированные по характеру подвижной и неподвижной фаз. По технике выполнения и типу аппаратуры различают хроматографию: тонкослойную, бумажную и колоночную. Причем в последнем варианте в настоящее время широко используются различные автоматические приборы (хроматографы).

Таблица 1

Подвижная фаза	Неподвижная фаза	Название хроматографического метода	Экспериментальное оформление
Газ	жидкость	Газожидкостная	Колоночная, Специальные, приборы - хроматографы
	Твердый адсорбент	Газоадсорбционная
Жидкость	Жидкость	Жидкостно-жидкостная (распределительная)	Бумажная, тонкослойная, колоночная
	Твердый адсорбент	Жидкостно-адсорбционная	Тонкослойная, колоночная
	Ионообменная смола	Ионообменная	Колоночная
	Гели, молекулярные сита	Гель-фильтрация, ситовая, афинная	Колоночная

В данном методическом пособии не представляется возможным и целесообразным дать характеристику всем видам хроматографического анализа. При необходимости эту информацию можно найти в соответствующих изданиях (см. список литературы).

В лабораторной практике широко используется жидкостно-адсорбционный вид хроматографии, главным преимуществом которого является простота экспериментного оформления. Именно этому методу мы уделим наибольшее внимание.

Таким образом, в случае жидкостно-адсорбционной хроматографии неподвижной фазой является твердый адсорбент, а подвижная фаза представляет собой жидкость или смесь жидкостей. Подвижную фазу, в потоке которой перемещается разделяемая смесь, называют элюентом, а раствор, выходящий из слоя неподвижной фазы и содержащий растворенные компоненты смеси - элюатом. [2]

На рис. 1 схематически изображено хроматографическое разделение: порция смеси веществ (А, Б, В), введенная в колонку, при промывании колонки элюентом разделяется на зоны. Благодаря меньшему удерживанию сорбентом зона компонента В продвигается быстрее, чем зона компонента Б, которая, в свою очередь, опережает зону компонента А. При этом зоны отдельных компонентов частично размываются вследствие диффузии, и максимальная концентрация наблюдается в середине каждой зоны.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 1 Стадии хроматографического разделения смеси веществ А, Б, В: I - начальная, II - промежуточная, III - конечная

1.1 Степень адсорбции и строение веществ

Адсорбционная хроматография основана на различии в адсорбционных свойствах компонентов разделяемой смеси. Чем лучше адсорбируется вещество, тем меньше скорость продвижения вещества по колонке или слою адсорбента. Поэтому отдельные компоненты смеси движутся через адсорбент с различной скоростью. Чем хуже адсорбируется вещество, тем быстрее оно продвигается по колонке в процессе хроматографирования. [1]

Степень адсорбции на полярных адсорбентах зависит в основном от наличия функциональных групп, двойных связей, ароматических колец и гетероциклов, от конфигурации молекулы, величины ее дипольного момента, поляризуемости и т.д. и относительно мало зависит от величины молекулы. Сравнительная оценка влияния отдельных групп представляет большие трудности. На основании большого числа эмпирических данных Брокман и Вольнерс расположили наиболее известные функциональные группы в следующий ряд по их возрастающему влиянию на степень адсорбции на адсорбенте - окиси алюминия:

-Сl, -Н, -ОСНз, -NO2, -СОСНз, -NНСОСНз, -NH2, -ОН, -СОNН2, -СООН

Изолированные двойные связи сравнительно мало влияют на степень адсорбции, однако с возрастанием их числа степень адсорбции увеличивается иногда даже в несколько раз, особенно в случае сопряженных систем, при наличии которых значительно возрастает поляризация молекулы.

При адсорбции на полярных адсорбентах заметно сказывается также влияние ароматических и гетероциклических колец. По сравнению с ненасыщенными соединениями ароматические соединения адсорбируются, как правило, более прочно. Влияние ароматических колец особенно сильно, если они конденсированы. Весьма сильное влияние на степень адсорбции могут оказать конфигурация молекулы и ее дипольный момент, что в ряде случаев позволяет осуществить разделение геометрических изомеров, а также о-, м- и п-изомеров (например, нитрофенолов, нитроанилинов и т.д.). [2]

Влияние величины молекулы на степень адсорбции в случае полярных адсорбентов незначительно. Увеличение длины алифатической цепи или введение в молекулу органического вещества алифатических заместителей несколько уменьшает степень адсорбции из-за того, что уменьшается «удельное» влияние функциональных групп.

На неполярных (гидрофобных) адсорбентах (например, активированный уголь) адсорбция, наоборот, очень сильно зависит от величины молекулы. По мере возрастания молекулярного веса степень адсорбции вещества повышается до определенного значения. По данным Клессона, максимум адсорбируемости соответствует молекулярному весу 10000. У полимеров высокого молекулярного веса размеры молекулы настолько большие, что они уже не способны проникнуть в поры активированного угля, что приводит к резкому снижению степени адсорбции.[9]

Влияние природы полярных групп при адсорбции на неполярных адсорбентах еще мало изучены.

1.2 Выбор адсорбента

Главное требование, предъявляемое к адсорбенту для хроматографии, - отсутствие химического взаимодействия между адсорбентом и анализируемым веществом. Второе важнейшее требование к адсорбенту - его избирательность, т.е. возможно большее различие в адсорбируемости веществ разделяемой смеси. Кроме этого адсорбенты, применяемые для хроматографии, должны отвечать ряду условий. Они должны иметь большую емкость, т.е. возможно большую активную поверхность. Большая активная поверхность адсорбента может являться следствием либо его значительной пористости (активированный уголь, окись алюминия, силикагель), либо высокой дисперсности адсорбента, т.е. малого размера частиц. При большой пористости адсорбента используется в основном внутренняя поверхность частиц, поэтому их величина играет второстепенную роль. [9]

Тем не менее, всегда желательно иметь адсорбенты со строго определенным размером частиц. Чем меньше размеры частиц адсорбента, тем быстрее устанавливается равновесие и тем меньше нарушается оно вследствие диффузии. Однако при очень малом размере частиц адсорбента в колонке создается значительное сопротивление, и жидкость проходит через нее с большим трудом.

Размеры зерен адсорбентов и носителей оценивают, как правило, в мешах, т.е. по числу отверстий на дюйм самого тонкого сита, через которое могут пройти зерна; эффективным диаметром частиц является размер отверстий сита (в мкм). Практически оптимальным размером частиц следует считать диаметр от 200 до 1500 мкм.

Одинаковая величина частиц адсорбента позволяет лучше разделить вещества и способствует лучшей проникаемости колонки. При неодинаковой величине зерен адсорбента маленькие частицы заполняют пространство между большими, что повышает сопротивление колонки.

Свойства полярных адсорбентов очень сильно зависят от влажности, которая к тому же значительно снижает их емкость. Некоторые полярные адсорбенты могут быть полностью дезактивированы водой и полярными растворителями. Поэтому полярные адсорбенты активируют, удаляя связанную воду, например, прокаливанием (СаО, МgО и т.д.), нагреванием при невысокой температуре (окись алюминия, силикагель) или просто высушиванием, чаще всего в вакууме, при температурах, не превышающих 110°С (крахмал, сахароза). [3]

В настоящее время в хроматографических работах применяются почти исключительно адсорбенты заводского производства. Это прежде всего окись алюминия, силикагель (окись кремния), уголь, магнезия (окись магния), диатомитовая земля (кизельгур), молекулярные сита, целлюлоза, силикат магния (феорисил) и другие. [17]

Окись алюминия является наиболее широко употребляемым адсорбентом для адсорбционной хроматографии. На ней удается хроматографировать весьма широкий круг смесей веществ как в полярных, так и в неполярных растворителях благодаря ее амфотерному характеру.

Техническая (основная) окись алюминия представляет собой в основном гидроокись алюминия с неопределенным содержанием воды (2-3%). Она содержит, как правило, также небольшие количества щелочи, которую частично можно вымыть водой. Таким образом, техническая окись алюминия имеет слабощелочную реакцию (Рн водного экстракта 9-10). Основная окись алюминия пригодна для разделения соединений нейтрального и основного характера, спиртов, углеводородов, стероидов, алкалоидов и природных пигментов. При использовании окиси алюминия не следует применять в качестве элюентов ацетон, этилацетат; последний в условиях разделения способен омыляться. [4]

Нейтральную окись алюминия можно приготовить, промывая технический продукт разбавленной азотной или соляной кислотой. Окись алюминия в этой форме значительно менее активна, чем в основной. Ее используют для разделения альдегидов, кетонов, хинонов, сложных эфиров, лактонов, гликозидов.

Кислая окись алюминия (Рн 4-5) - наименее активная и редко используемая форма, пригодна для разделения пигментов и сильных кислот.

Активность окиси алюминия зависит от ее влагосодержания. Увлажняя наиболее активную форму окиси алюминия (первая степень активности) различным количеством воды, можно получить набор адсорбентов с различной активностью. Стандартизацию активной окиси алюминия по Брокману см. в разделе 3.1. Оптимальной активности можно достигнуть нагреванием окиси алюминия при температуре 400-500°С. Окись алюминия, прокаленная при очень высокой температуре, теряет активность вследствие перехода в другую кристаллическую форму.

Силикагель - широко используемый адсорбент для большинства типов функциональных групп и ионных и неионных соединений. Для достижения максимальной активности силикагель перед употреблением нагревают при 150-160°С в течение нескольких часов. Активированный силикагель используют для разделения углеводородов. Чаще всего применяют технический «дезактивированный» силикагель, содержащий 10-20% воды (слабокислый). [1]

В какой-то мере выбор сорбента может быть предсказан заранее. На практике в первую очередь нужно исходить из свойств разделяемых соединений: их растворимости (гидрофильность, гидрофобность), содержание и характеры функциональных групп (см. раздел 2.1).

1.3 Выбор элюента

Правильный выбор элюента (растворителя или смеси растворителей) в адсорбционной хроматографии имеет существенное значение и тесно связан как с природой выбранного адсорбента, так и со свойствами компонентов анализируемой смеси. Нет единой зависимости между свойствами растворителя (диэлектрической проницаемостью, дипольным моментом и т д.) и его элюирующей способностью, а также растворимостью соединения и его способностью адсорбироваться. Тем не менее, существует экспериментально выявленный элюотропный ряд растворителей, в котором наиболее часто применяемые в хроматографии растворители расположены в порядке возрастания десорбирующей (элюирующей) способности (табл. 2).

В случае бинарных смесей растворителей добавление небольшого количества одного растворителя (0-40% смеси) к другому, менее полярному приводит к резкому возрастанию элюирующей способности смеси. Этот эффект усиливается по мере продвижения вниз в приведенных элюотропных рядах, однако в том же порядке ухудшается смешиваемость растворителей в бинарных смесях. [1]

В таблице 3 приведен список растворителей и адсорбентов, наиболее часто применяемых для разделения растворов смесей веществ методом адсорбционной хроматографии.

Таблица 3 Растворители и адсорбенты, наиболее часто применяемые в жидкостной адсорбционной хроматографии

Разделяемые смеси	Растворители	Адсорбенты
Углеводороды	Пентан, петролейный эфир, бензин, изооктан, хлороформ, четыреххлористый углерод, хлорбензол, этиловый спирт, ацетон	Активированная окись алюминия, силикагели различных марок, алюмосиликатный катализатор
Галогено-производные	Пентан, изооктан, петролейный эфир, четыреххлористый углерод	Силикагели различных марок, активированная окись алюминия
Спирты	Изопропиловый спирт, диэтиловый эфир, н-бутиловый спирт, хлороформ, диоксан, бензол, петролейный эфир	Активированный уголь, окись алюминия, силикагель
Альдегиды и кетоны	Петролейный эфир, бензол. диэтиловый эфир, этиловый спирт	Окись алюминия, окись кальция
Карбоновые кислоты	Бензол, петролейный эфир, этиловый спирт, н-гептан, нитропропан, вода (для низших кислот)	Тальк, активированный уголь, окись алюминия, силикагели
Сложные эфиры	Петролейный эфир, бензол, диэтиловые эфир, четыреххлористый углерод, хлороформ, н-гексан	Окись алюминия, силикагели, активированный уголь
Хиноны	Бензол, н-гексан, этиловый спирт, ацетон, метиловый спирт	Окись алюминия, кизельгур
Амины, амиды	Петролейный эфир, бензол, четыреххлористый углерод, диэтиловый эфир	Силикагели, окись алюминия
Нитро- и нитрозо-соединения	Бензол, петролейный эфир, хлористый метилен	Тальк, гидроокись кальция, карбонат кальция, силикагели, окись алюминия
Сульфокислоты	Вода	Окись алюминия
Сахара	Вода, изопропиловый спирт, этиловый спирт, н-бутиловый спирт, диоксан, петролейный эфир, бензол, хлороформ	Боксит, активированный уголь, силикагели, окись алюминия
Аминокислоты	Вода, метиловый спирт, водный раствор формальдегида, диэтиловый эфир, раствор фенола, м-крезол, хлороформ	Активированый уголь, силикагели, окись алюминия, двуокись титана, крахмал
Гетероциклические соединения	Бутиловый спирт, диэтиловый эфир, хлороформ, петролейный эфир, бензол, этиловый спирт, ацетон, 0,004 н. раствор соляной кислоты, вода, уксусная кислота	Окись алюминия, гидроокись кальция, крахмал, силикагели, кизельгур, карбонат кальция, сахар, тальк
Алкалоиды	Вода, бензол, хлороформ, диэтиловый эфир, этиловый спирт, ацетон, раствор фенола	Окись алюминия, силикагели, фуллерова земля
Витамины	Петролейный эфир, бензол, вида, этилацетат, этиловый спирт	Окись алюминия, гидроокись кальция, окись магния
Терпены	Четыреххлористый углерод, петролейный эфир, гексан, бензол, этиловый спирт, ацетон, метиловый спирт, этилацетат, хлороформ	Окись алюминия
Сераорганические соединения	Петролейный эфир, изооктан, спиртбензольная смесь, этиловый спирт, ацетон	Силикагели, окись алюминия

1.4 Техника эксперимента

По технике выполнения и типу аппаратуры различают хроматографию тонкослойную и колоночную.

Тонкослойная хроматография (ТСХ)

ТСХ представляет собой разновидность адсорбционной хроматографии, когда разделение происходит на "открытых колонках", т.е. в тонком слое адсорбента, нанесенного на твердую основу (например, стеклянную пластинку). Преимуществами ТСХ являются высокая скорость хроматографирования и высокая чувствительность (достаточно микроколичества разделяемых веществ). ТСХ получила очень широкое распространение и в настоящее время является неотъемлемым методом любой органической лаборатории. [2]

Приготовление пластин

В настоящее время существуют две основные разновидности этого метода, которые, по существу, различаются лишь способом приготовления тонкого слоя адсорбента: хроматография на закрепленном и на незакрепленном слое адсорбента.

По способу, разработанному Шталем, тонкий слой адсорбента получают, нанося на стеклянную пластинку кашеобразную смесь адсорбента, связующего вещества и воды. Этот вид ТСХ носит название хроматографии в закрепленном слое. Чаще всего в качестве адсорбентов для приготовления закрепленных слоев используется Аl2О3 и силикагель. В качестве связующего вещества обычно применяют сульфат кальция (смесь силикагеля с 5% СаSО4 выпускается фирмой "Мерк" под названием кизельгель Г). В последнее время широкое распространение получила хроматография на пластинках "Silufol", представляющих собой пластинки из алюминиевой фольги, на которых закреплен слой силикагеля (обычно 0,4-0,6 мм). [5]

При втором способе приготовления пластинок (с незакрепленным слоем) сухой адсорбент равномерно распределяется с помощью стеклянной палочки на пластинке. На оба конца стеклянной палочки приклеены полоски, толщина которых (0,1 мм) соответствует толщине выбранного слоя адсорбента (намазывать, а не раскатывать!). Перед нанесением адсорбент очищают от крупных частичек, которые при хроматографировании могли бы дать неровности на поверхности адсорбента. Для этого адсорбент просеивают в сосуд для хранения через тонко сито (капрон). [3]

Нанесение веществ

Анализируемые смеси веществ по возможности наносят в виде 1%-ных растворов (следует применять неполярные легко летучие растворители). Раствор испытуемой смеси наносят на пластинку (на линию старта) тонким стеклянным капилляром на расстоянии 1-2 см друг от друга. Пятна веществ по возможности должны быть небольшими (диаметр 2-3 мм) и находиться не ближе 1,5-2 см от краев пластинки (рис. 2).

Рис. 2 Пример хроматографической пластинки

Элюирование проводят в плотно закрытой камере. Пластинки погружают в жидкость (элюент) на 5-6 мм (следить, чтобы растворитель не касался линии старта). Пластинки с закрепленным слоем адсорбента устанавливают практически вертикально. Для пластинок с незакрепленным слоем применяют плоские камеры (малый угол наклона пластинки). Элюирование проводят в течение времени, необходимого для продвижения фронта растворителя практически до края пластинки (следить, чтобы растворитель "не убежал" за край). [4]

Следует отметить, что существуют технические приемы, позволяющие организовать хроматографирование в тонком слое (закрепленном) как с восходящим, так и с нисходящим фронтом растворителя.

После хроматографирования отмечают фронт растворителя, пластинки высушивают на воздухе и проявляют пятна веществ, если они не являются окрашенными. Положение пятен некоторых бесцветных веществ можно установить при рассмотрении пластинок в УФ-свете, если использовать специально подготовленный адсорбент (с УФ-индикатором). В большинстве случаев удается сделать хроматографические пятна видимыми путем обработки их парами иода. Для этого хроматограмму помещают в закрытый сосуд (например, эксикатор), в котором находится кристаллик иода. Вещество проявляется в виде коричневого пятна. Для проявления пятен неокрашенных веществ применяют, кроме того, опрыскивание соответствующими реагентами. Пластинки с незакрепленным слоем целесообразно опрыскивать влажными, так как при опрыскивании их в сухом состоянии незакрепленный слой адсорбента может быть легко разрушен. [1]

Количественной характеристикой хроматографической подвижности каждого вещества (пятна) является коэффициент подвижности Rf, рассчитанный из соотношения:



Где h - длина пробега соответствующего пятна (измеренная в мм от линии старта до центра пятна), X - длина пробега фронта растворителя.

Коэффициент подвижности является индивидуальной характеристикой вещества, определяемой степенью адсорбции и зависящей от природы адсорбента и состава элюента. Поэтому при оформлении результатов следует указывать эти условия хроматографирования, например Rf = 0,19 (А12O3, ССl4). [3]

ТСХ может быть использована для следующих целей:

1. Определение качественного состава смеси веществ. Для этого на линию старта наносится исследуемая смесь и в качестве свидетелей предполагаемые вещества (см рис. 2) Сравнивая Rf веществ, образующих исследуемую смесь, с Rf свидетелей, устанавливают, из каких соединений состоит смесь.

2. Препаративное разделение смеси веществ. В этом случае используется ТСХ с незакрепленным слоем адсорбента. На линию старта наносят (полосой) исходную смесь (количество ее ограничивается емкостью адсорбента). После элюирования зоны, соответствующие отдельным компонентам смеси, собирают и вещества десорбируют с адсорбента подходящим растворителем. Недостатком этого способа разделения веществ является количественное ограничение ТСХ. Поэтому препаративное разделение смеси веществ обычно осуществляют методом колоночной хроматографии (см. ниже). Однако с помощью ТСХ, как правило, проводят подбор условий (выбор адсорбента, состава элюента) для колоночного хроматографирования.

3. ТСХ как модель колоночной хроматографии. В соответствии с химической природой разделяемых веществ подбирают подходящий адсорбент. Для модельного разделения методом ТСХ и последующего разделения на колонке следует использовать адсорбент, изготовленный одной и той же фирмой (различие в размерах частиц адсорбента при препаративном разделении существенного значения не имеет). Состав элюента подбирают, добиваясь максимального разделения пятен. Для этого, как правило, состав элюента изменяют в сторону увеличения полярности. Следует помнить, что чем ниже полярность элюента, тем больше различие в хроматографической подвижности веществ, тем эффективнее их разделение. Хотя скорость хроматографирования в этом случае низкая, но лучше пожертвовать временем, чем качеством разделения (или очистки) веществ. Следует отметить, что для эффективного использования на колонке важно, чтобы большинство компонентов, входящих в состав смеси, в условиях ТСХ имело величины Rf не более 0,3.

4. Наконец, ТСХ может быть использована в органическом синтезе для экспресс-контроля за ходом реакции. Для этого на линию старта наносится реакционная смесь (в любой момент реакции) и в качестве свидетелей - исходное соединение и конечный продукт реакции. Особенно удобно использовать для этих целей пластинки Silufol, предварительно только подобрав элюент, позволяющий дифференцировать исходные и конечные соединения. [3]

Колоночная хроматография

Как уже было отмечено выше, колоночная хроматография (КХ) используется, как правило, для препаративного разделения веществ. Этот метод разделения весьма эффективен. Его применяют прежде всего для разделения малых количеств веществ или для соединений, разделение которых классическими методами (перегонка, перекристаллизация) невозможно.

Хроматографические колонки представляют собой вертикально закрепленные стеклянные трубки, снабженные краном в нижней части, которые заполняют тонкоизмельченным адсорбентом (неподвижная фаза). Раствор, подлежащий разделению или очистке (подвижная фаза), под действием силы тяжести стекает по колонке вниз (нисходящая КХ) или под действием капиллярных сил поднимается вверх (восходящая КХ).

Отдельные соединения в зависимости от их сродства к адсорбенту и растворителю адсорбируются в различной степени (или, соответственно, с различной скоростью проходят сквозь колонку). Извлекают отдельные "зоны" из колонки, продолжая промывание колонки элюентом.

Рекомендуется использовать 25-30 г адсорбента на 1 г адсорбируемого материала (и 100-1000 г адсорбента, если образец обладает слабой адсорбцией или если приходится работать с небольшим количеством - порядка миллиграммов - адсорбируемого материала). Оптимальный размер гранул адсорбента 100-150, 150-200 мк.

С уменьшением размеров гранул разделительная способность сорбента возрастает, однако вместе с тем возрастает и гидродинамическое сопротивление всей колонки (очень снижается скорость хроматографирования). [15]

Заполнение хроматографических колонок. Наиболее оптимальными являются трубки следующих размеров: 15*1, 25*2, 40*3, 60*4см. Простейшим примером хроматографической колонки является бюретка. В нижнюю часть трубки вставляется неплотный тампон из обычной или стеклянной ваты. Заполнение колонок адсорбентом проводят двумя способами мокрым и сухим. И в том и в другом случае основное требование - равномерное наполнение хроматографической колонки. [3]

Сухой способ: в колонку постепенно засыпают предварительно просеянный адсорбент, осторожно постукивая стеклянной палочкой с резиновым наконечником по колонке. После того, как весь адсорбент засыпан, сверху помещают тампон (или кружочек фильтровальной бумаги) для того, чтобы при введении раствора анализируемой смеси и добавлении элюента не происходило взмучивание верхнего слоя адсорбента. [4]

Мокрый способ: приготавливают суспензию необходимого количества адсорбента в растворителе, которым будет осуществляться элюирование. Если элюент состоит из смеси растворителей, то для этих целей используют менее полярный растворитель, входящий в состав элюента. Суспензию медленно вливают в хроматографическую колонку (при постукивании). Можно также сухой адсорбент засыпать в колонку, наполненную растворителем. При этом необходимо следить за тем, чтобы в объеме не было пузырьков воздуха. По мере заполнения колонки избыток элюента сливают через нижний кран. К концу заполнения колонка над поверхностью адсорбента должен быть слой элюента около 2-3 мм. [4]

При заполнении колонки и в процессе элюирования необходимо следить за тем, чтобы хроматографическая колонка ни на секунду не оставалась "сухой" (без слоя растворителя над адсорбентом), так как в противном случае в слое адсорбента образуются трещины. [14]

В подготовленную колонку вносится анализируемая смесь. Здесь тоже можно выделить два способа введения - "сухой" и "мокрый". Причем использовать можно и тот и другой независимо от способа заполнения колонки адсорбентом. Чаще всего хроматографируемую смесь вносят в виде концентрированного раствора (максимально возможной концентрации), причем для растворения используют менее полярный растворитель, стоящий в элюотропном ряду перед растворителем, которым будут проводить элюирование, или менее полярный компонент смешанного элюента. Как только раствор впитается, начинают добавлять элюент. [6]

В "сухом" варианте анализируемую смесь предварительно наносят на небольшое количество адсорбента. Для этого в отдельной колбочке смешивают адсорбент и раствор анализируемой смеси (в данном случае концентрация раствора не имеет значения), затем растворитель удаляют на вакуумном испарителе. Полученную таким образом сухую смесь адсорбента и анализируемых веществ переносят в хроматографическую колонку на "линию" старта.

Элюирование. Скорость движения раствора в колонке не должна быть слишком большой, чтобы достигалось адсорбционное равновесие (для колонки высотой 40 см примерно 3-4 мл/мин). Скорость регулируют с помощью крана на выходе из колонки или уменьшая скорость поступления жидкости на колонку. Если элюат стекает слишком медленно, давление в колонке несколько повышают. Для этого увеличивают слой жидкости над адсорбентом либо поддавливают с помощью компрессора. Элюат собирают фракциями по 0,5-10 мл. Соответствующими аналитическими методами определяют, содержится ли в этих фракциях хроматографическое вещество. Чаще всего хроматографируют в тонком слое каждую фракцию элюата. [6]

Если применяемый растворитель не вызывает элюирования адсорбированного вещества или же после вымывания одного вещества появляются фракции, содержащие только растворитель, надо повысить элюотропную способность растворителя. Для этого постепенно добавляют (начиная с 1-2%) к применяемому растворителю другой, расположенный ниже в элюотропном ряду, и контролируют, элюируется ли из колонки следующее вещество. Этот процесс (разбавление растворителя и элюирование) продолжают до тех пор, пока из колонки не будут извлечены все компоненты, введенные с исходным растворителем. [19]

Описанные приемы хроматографирования не исчерпывают всего многообразия методов колоночной и тонкослойной адсорбционной хроматографии, хотя и являются наиболее широко используемыми.

2. Практические работы

2.1 Определение активности окиси алюминия

Сорбенты, в частности окись алюминия, весьма гигроскопичны и при хранении на воздухе их активность уменьшается. Для определения активности сорбента в ТСХ чаще всего применяют стандартные красители: азобензол, п-метоксибензол, 1-(фенилазо)-нафтол-2 (судан-I), 1-(2,4-диметилфенилазо)-нафтол-2 (судан II), п-аминоазобензол, значения Rf которых для разной активности известны (таблица 4). [20]

Таблица 4 Активность Al2O3 по Брокману

Краситель	Степень активности
	II	III	IV	V
Азобензол	0,59	0,74	0,85	0,95
Судан-I	0,01	0,25	0,57	0,78
Судан-II	0,001	0,10	0,33	0,56
п-Аминоазобензол	0,000	0,03	0,08	0,19

Чистую, тщательно вымытую стеклянную пластинку вставляют в станок, насыпают на нее слой просеянной окиси алюминия для хроматографии и разравнивают слой с помощью валика. Отмечают осторожным прикосновением натянутой нитки линию старта на расстоянии 1,2-2 см от нижнего края пластинки и наносят пробы стандартных азокрасителей, растворенных в бензоле. Точки нанесения должны лежать строго на стартовой прямой на расстоянии 1,2-2 см друг от друга. Каждый из красителей следует наносить своим капилляром, лишь слегка касаясь слоя адсорбента, чтобы не нарушить этот слой.

Подготовленную пластинку ставят в наклонном положении в кювету, в которую предварительно наливают ССl4, высота слоя которого не должна превышать 1-1,5 см. Ставить пластинку в кювету надо с максимальной осторожностью, не увеличивая угол наклона пластинки и избегая ударов ее о стенки кюветы. Кювету закрывают пришлифованной крышкой, что предохраняет растворитель от испарения и дает возможность несколько раз использовать эту систему. После того, как растворитель поднимается до верха пластинки, ее вынимают и отмечают положение фронта растворителя. Определяют Rf стандартных красителей и по таблице 4 находят активность окиси алюминия по Брокману.

2.2 Определение качественного состава смеси красителей с помощью ТСХ

В задачу входят два красителя из следующего перечня: флуоресцеин, Судан-I, Судан-II, п-аминоазобензол, эозин, азобензол. Следует определить состав смеси с помощью ТСХ на пластинке "Сорбфил". В качестве элюента используют 1)хлороформ, 2)смесь хлороформ-этанол (50:1) или четыреххлористый углерод. На линию старта наносят исследуемую смесь и в качестве свидетелей все красители. В хроматографическую кювету (в простейшем случае это стакан, прикрытый чашкой Петри) наливают на дно элюент (толщина слоя 0,5-1 см) и помещают туда хроматографическую пластинку. Следить, чтобы уровень элюента был ниже линии старта. Кювету обязательно закрывают и следят за элюированием. Элюирование продолжают до тех пор, пока фронт растворителя не поднимется практически до конца пластинки. Затем пластинку вынимают, отмечают фронт растворителя и определяют Rf компонентов смеси и свидетелей. Сравнивая эти значения, определяют состав анализируемой смеси. Изменяя состав элюента, подбираем оптимальный вариант, добиваясь наибольшей разницы в Rf компонентов смеси. Этот результат используем в следующей задаче для препаративного разделения красителей с помощью колоночной хроматографии.

2.3 Разделение смеси красителей с помощью колоночной хроматографии

Идентифицированную в предыдущем опыте смесь красителей подвергают разделению на индивидуальные компоненты с помощью колоночной хроматографии на силикагеле. Заполнение колонки, представляющей собой бюретку, проводят любым из описанных способов (см. раздел 2.4.2). В "мокром" способе в качестве растворителя используют хлороформ или другой неполярный компонент элюирующей смеси. В заполненную колонку вливают раствор красителей, открывают кран и дают этому раствору впитаться. Затем добавляют элюент (состав подобран заранее с помощью ТСХ). Элюирование проводят до тех пор, пока из колонки не выйдут индивидуальные красители (отдельные окрашенные зоны). Элюат собираем в отдельные заранее подготовленные и пронумерованные приемники. Если "снятие" с колонки второго компонента затруднительно, то после выхода первого можно увеличить полярность элюента, повышая долю полярного компонента (можно и до 100%). Для подтверждения степени чистоты полученных фракций можно воспользоваться ТСХ.

Контрольные вопросы

1. В чем заключается метод хроматографии?

2. Кем впервые был разработан этот метод?

3. Функции неподвижной фазы.

4. Как различаются виды хроматографии по агрегатному состоянию подвижной фазы, по природе сорбента?

5. Для каких целей используют хроматографию?

6. От чего зависит степень адсорбции на полярных адсорбентах?

7. Какие адсорбенты используют для хроматографии?

8. Требования, предъявляемые к адсорбентам.

9. Для каких целей используют колоночную хроматографию? Способы заполнения хроматографических колонок.

10. Техника выполнения колоночной хроматографии.

11. Как повысить элюотропную способность растворителя?

12. Для каких целей используют тонкослойную хроматографию (ТСХ)

13. Что такое проявитель и для чего он используется? Какие проявители вам известны?

14. Что такое Rf?

15. Техника выполнения ТСХ.

16. Как определить активность Al2O3?

Литература

1. Гордон А., Форд Р. Спутник химика. М.: Мир, 1976. С. 380-415.

2. Органикум. Ч.1. М.: Мир, 1979. С. 100-105.

3. Лабораторные работы по органической химии / Под ред. О.Ф.Гинзбурга, Л.А. Петрова. М.: Высшая школа, 1982. С. 44-66.

4. Хроматография. Практическое применение метода: В 2 ч. / Под ред. Э.Хефтмана. _ М.: Мир, 1986.

5. Хроматография в тонких слоях / Под ред. Э.Шталя. М.: Мир, 1965.

6. Жидкостная колоночная хроматография: В 3 ч. / Под ред. З.Дейла, К.Мацека, Я.Янека. М.: Мир, 1978.

7. Высокоэффективная тонкослойная хроматография /Под ред. А. Златкиса, Р.Кайзера. М.: Мир, 1980.

8. Кирхнер. Тонкослойная хроматография: В 2 т. М.: Мир, 1980.

9. Гроссе Э., Вайсмантель Х. Химия для любознательных: пер. с нем. М.: Химия, 1985. 336 с.

10. Тяглова Е.В. Исследовательская деятельность учащихся по химии. М. Глобус, 2007.

11. Айвазов Б.В. Введение в хроматографию. М.: Высшая школа, 1983.

12. Айвазов Б.В. Практическое руководство по хроматографии. М.: Высшая школа, 1968. 279 с.

13. Сычев К. С. Практическое руководство по жидкостной хроматографии. М.: Техносфера, 2010. 272 с.

14. Лурье А. А. Сорбенты и хроматографические носители. М.: Химия, 1972. 320 с.

15. Аналитическая хроматография / Под ред. В.И. Сакодынского и др. М.: Химия, 1993.

16. Алесковский В.Б., Бардин В.В., Булатов М.И. Физико-химические методы анализа. Практическое руководство. Л.: Химия, 1988. 376 с.

17. Ольшанова К.М. Практикум по хроматографическому анализу. М.: Высш. школа, 1970. 312 с.

Приложение 1

Формулы красителей

	Азобензол
	Судан I 1-(фенилазо)-нафтол-2
	Судан II (2,4-диметилфенилазо)-нафтол-2
	n-Аминоазобензол
	Каротин
	Ксантофилл

Размещено на Allbest.ru