Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна фармацевтична академія України

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фармацевтичних наук

15.00.02 -- Фармацевтична хімія та фармакогнозія

Хіміко-токсикологічне дослідження метоклопраміду

Мороз Валерій Петрович

Харків 2000

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі аналітичної хімії Національної фармацевтичної академії України, Міністерство охорони здоров'я України.

Науковий керівник: доктор хімічних наук, професор Болотов Валерій Васильович Національна фармацевтична академія України, завідувач кафедрою аналітичної хімії

Офіційні опоненти: доктор фармацевтичних наук, професор Безуглий Петро Овксентійович Національна фармацевтична академія України, завідувач кафедрою фармацевтичної хімії

доктор фармацевтичних наук, професор Петюнін Геннадій Павлович Харківська медична академія післядипломної освіти, завідувач кафедрою клінічної біохімії і судово-медичної токсикології

Провідна установа: Київська медична академія післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика МОЗ України, кафедра фармацевтичної хімії та фармакогнозії

Захист відбудеться “15” грудня 2000 року о 1000 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.605.01 при Національній фармацевтичній академії України за адресою: 61002, м. Харків, вул. Пушкінська, 53.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Національної фармацевтичної академії України (61168, м. Харків, вул. Блюхера, 4).

Автореферат розісланий “ 9 ” листопада 2000 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Гриценко І.С.

1. Загальна характеристика роботи

метоклопрамід спектроскопія фотометричний лікарський

Актуальність теми. Розробка методів хіміко-токсикологічного аналізу сильнодіючих лікарських засобів є актуальною задачею токсикологічної і фармацевтичної хімії, оскільки перелік імпортних і вітчизняних лікарських препаратів, що пропонуються на фармацевтичному ринку України, постійно розширюється.

Великий інтерес в аналітичному і хіміко-токсикологічному відношенні представляють препарати протиблювотної дії. Відомі випадки використання препаратів цієї групи із суїцидною ціллю, передозувань, дитячих отруєнь.

В хіміко-токсикологічному відношенні практично не вивчений сильнодіючий препарат протиблювотної дії метоклопрамід. У літературі відсутні дані про надійні методи ізолювання метоклопраміду з біологічного матеріалу, виявлення і кількісного визначення, що придатні для цілей хіміко-токсикологічного аналізу. Відсутні відомості про оптимальні умови екстракції метоклопраміду з водних розчинів, розподіл препарату в органах і біологічних рідинах організму, зберігання препарату в біологічному матеріалі.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертацію виконано згідно з планом науково-дослідних робіт Національної фармацевтичної академії України з проблеми МОЗ України, номер держреєстрації 0198U007011.

Мета і задачі дослідження. Метою даного дослідження є розробка ефективних та експресних методів виділення метоклопраміду з біологічного матеріалу, методів його виявлення і кількісного визначення, що придатні для хіміко-токсикологічного та фармацевтичного аналізу.

Для досягнення наміченої мети були поставлені такі задачі:

запропонувати кольорові, осадові та мікрокристалоскопічні реакції для ідентифікації метоклопраміду, виділеного з біологічного матеріалу;

розробити чутливі методики виявлення метоклопраміду за допомогою методу хроматографії в тонких шарах сорбенту та УФ-спектроскопії, що дозволяють відрізнити його від структурних аналогів, а також препаратів, які можуть застосовуватися разом із ним;

вивчити можливість застосування методу хроматографії в тонких шарах сорбенту для ідентифікації та очищення метоклопраміду від співекстрактивних речовин у витяжках з біологічного матеріалу;

розробити методи кількісного визначення метоклопраміду, що придатні для цілей хіміко-токсикологічного і фармацевтичного аналізу (фотоколориметричний, екстракційно-фотометричний);

розробити склад мембрани та конструкцію твердоконтактного іонселективного електрода на метоклопрамід, який би мав кращі аналітичні характеристики ніж відомі раніше і застосувати його для кількісного визначення метоклопраміду в водних розчинах, модельних лікарських формах і витяжках із біологічного матеріалу;

вивчити вплив природи органічних розчинників, рН середовища на екстракцію метоклопраміду з водних розчинів;

порівняти ефективність загальноприйнятих у хіміко-токсикологічному аналізі методів ізолювання органічних речовин основного характеру (О.О. Васильєвої - витягання водою, підкисленою кислотою щавлевою; В.П.Крамаренка - витягання водою, підкисленою кислотою сірчаною; Стаса-Отто - витягання спиртом етиловим, підкисленим кислотою щавлевою) стосовно до метоклопраміду;

розробити ефективний і експресний індивідуальний метод ізолювання метоклопраміду з біологічного матеріалу;

запропонувати методики виділення метоклопраміду з біологічних рідин організму (крові, сечі);

вивчити розподіл метоклопраміду в органах тварин, що отруєні препаратом;

дослідити зберігання метоклопраміду в трупному матеріалі при його гнильному розкладенні;

на підставі виконаних досліджень запропонувати схему хіміко-токсикологічного аналізу біологічного матеріалу на метоклопрамід.

Об'єкт дослідження. Хіміко-токсикологічне дослідження в ряду протиблювотних фармацевтичних препаратів.

Предмет дослідження. Сильнодіючий протиблювотний препарат метоклопрамід, що застосовується при терапії захворювань різної етіології та є цікавим в хіміко-токсикологічному відношенні.

Методи дослідження. Для ідентифікації метоклопраміду в водних розчинах, лікарських формах і витяжках з біологічного матеріалу використовували методи тонкошарової хроматографії, УФ- та ІЧ-спектроскопії, кольорові, осадові та мікрокристалоскопічні реакції; для кількісного визначення - фотоколориметричний, екстракційно-фотометричний та іонометричний методи. Для ізолювання метоклопраміду з біологічного матеріалу використовували загальноприйняті методи О.О. Васильєвої, В.П. Крамаренка, Стаса-Отто, а також метод ізолювання хлороформом, який запропоновано нами.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше виконані систематичні дослідження метоклопраміду в хіміко-токсикологічному відношенні.

Запропоновані кольорові та осадові реакції, методи хроматографії в тонкому шарі сорбенту та УФ-спектроскопії для виявлення метоклопраміду, який виділено з біологічного матеріалу. Вказані методи і реакції дозволяють ідентифікувати метоклопрамід у присутності інших препаратів, що можуть застосовуватись разом з ним.

Розроблені нові фотоколориметричний і екстракційно-фотометричний методи кількісного визначення метоклопраміду, що придатні для цілей хіміко-токсикологічного, фармацевтичного та криміналістичного аналізу.

Розроблено конструкцію і склад мембрани нового твердоконтактного іонселективного електрода на метоклопрамід, що перевершує за своїми аналітичними характеристиками відомі раніше. Електрод застосовано для кількісного визначення метоклопраміду у водних розчинах, мікрооб'ємах розчинів і лікарських формах. Вперше іонселективний електрод застосовано для кількісного визначення препарату у витяжках з біологічного матеріалу.

Вивчені умови (природа органічного розчинника, рН середовища) екстракції метоклопраміду з водних розчинів, на основі чого розроблена методика його ізолювання з біологічного матеріалу для хіміко-токсикологічних досліджень.

Вперше проведено порівняльне вивчення загальноприйнятих у хіміко-токсикологічному аналізі методів ізолювання органічних речовин основного характеру стосовно до метоклопраміду. Розроблено ефективний і експресний індивідуальний метод ізолювання метоклопраміду з біологічного матеріалу за допомогою хлороформу.

Запропоновано методики виділення метоклопраміду з біологічних рідин організму (крові, сечі).

Вперше вивчено розподіл метоклопраміду в органах отруєних тварин, що дозволяє вибрати оптимальні об'єкти для проведення хіміко-токсикологічного аналізу.

Вперше досліджено зберігання метоклопраміду в біологічному матеріалі при його гнильному розкладенні.

На підставі виконаних досліджень запропоновано схему хіміко-токсикологічного аналізу біологічного матеріалу на метоклопрамід.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблені методики виявлення і кількісного визначення метоклопраміду, який виділено з біологічного матеріалу, можуть використовуватися в практиці судово-хімічних досліджень для вирішення питань отруєнь метоклопрамідом, в клінічних лабораторіях з метою визначення метоклопраміду в біологічних рідинах, а також у фармацевтичному та криміналістичному аналізі.

Новий твердоконтактний іонселективний електрод на метоклопрамід, на склад мембрани якого отримано рішення про видачу патенту України, може знайти застосування, у фармацевтичному і хіміко-токсикологічному аналізі.

Розроблені методики хіміко-токсикологічного дослідження метоклопраміду впроваджені в практику лабораторій судово-хімічних експертиз Харківського та Одеського обласних бюро судово-медичної експертизи, а також у навчальний процес Національної фармацевтичної академії України та кафедри клінічної біохімії й судово-медичної токсикології Харківської медичної академії післядипломної освіти.

Особистий внесок здобувача:

проведено аналіз літературних даних з методів виявлення і кількісного визначення, фармакології і токсикології протиблювотного препарату метоклопраміду;

розроблено методи ідентифікації і кількісного визначення метоклопраміду у витяжках з біологічного матеріалу і в лікарських формах (кольорові, осадові та мікрокристалоскопічні реакції, методи тонкошарової хроматографії метоклопраміду і інших препаратів, що застосовують разом з ним, УФ-спектроскопії, фотоколориметрії і екстракційної фотометрії);

розроблено склад мембрани та конструкцію твердоконтактного ІСЕ на метоклопрамід, що має кращі аналітичні характеристики ніж відомі раніше;

розроблено методики кількісного визначення метоклопраміду в водних розчинах, модельних лікарських формах і витяжках з біологічного матеріалу за допомогою іонселективного електрода на метоклопрамід;

вивчені умови екстракції метоклопраміду з водних розчинів органічними розчинниками в залежності від їх природи та рН середовища;

проведено порівняльну оцінку ефективності ізолювання метоклопраміду з біологічного матеріалу загальноприйнятими в хіміко-токсикологічному аналізі методами;

розроблено ефективний і експресний індивідуальний метод ізолювання метоклопраміду з біологічного матеріалу за допомогою хлороформу;

запропоновані методики виділення метоклопраміду з біологічних рідин організму (крові, сечі);

досліджено розподіл метоклопраміду в органах отруєних тварин, а також зберігання препарату у біологічному матеріалі.

Апробація результатів дисертації. Основні результати дисертаційної роботи доповідалися на V Національному з'їзді фармацевтів України “Досягнення сучасної фармації та перспективи її розвитку у новому тисячолітті”, (Харків, 1999), Всеукраїнській науково-практичній конференції “Вчені України - вітчизняній фармації” (Харків, 2000).

Роботу заслухано та обговорено на міжкафедральному науковому семінарі Національної фармацевтичної академії України.

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 5 наукових статей, 1 патент, 2 тез доповідей.

Структура дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду літератури, 4 розділів експериментальної частини, загальних висновків, списку літературних джерел, додатків.

Загальний об'єм дисертації складає 142 сторінки.

Робота ілюстрована 17 рисунками, 1 схемою і 38 таблицями.

Перелік використаних літературних джерел містить 198 найменувань.

2. Основний зміст роботи

Метоклопрамід - 4-аміно-5-хлор-N-(2-діетиламіноетил)-2-метоксибензаміду гідрохлориду моногідрат.

Широко застосовується в медичній практиці, як ефективний протиблювотний засіб.

1. Ідентифікація метоклопраміду

Для ідентифікації метоклопраміду в фармацевтичному аналізі використовують методи УФ-, ІЧ-спектроскопії, якісні реакції (з п-диметиламінобензальдегідом, 2-нафтолом після діазотування препарату, з розчином срібла нітрату в азотнокислому середовищі) та деякі інші.

Безпосереднє використання цих методів та реакцій не завжди можливе у хіміко-токсикологічному аналізі. Деякі з них недостатньо чутливі та специфічні. Інші потребують попереднього ретельного очищення витяжок з біологічного матеріалу від співекстрактивних речовин, які заважають ідентифікації. Тому в хіміко-токсикологічному аналізі проводять комплекс досліджень, який включає різні методи аналізу, що значно підвищує надійність одержаних даних.

В зв'язку з цим нами вивчена можливість використання для виявлення метоклопраміду при хіміко-токсикологічних дослідженнях кольорових, осадових та мікрокристалоскопічних реакцій, деяких реакцій на функціональні групи препарату (перш за все первинну ароматичну), методів хроматографії в тонких шарах сорбенту (ТШХ), УФ- та ІЧ-спектроскопії.

Нами вивчено кольорові реакції метоклопраміду з реактивами Ердмана (суміш концентрованих сірчаної та азотної кислот), Манделіна (розчин амонію ванадату в концентрованій кислоті сірчаній), Лібермана (розчин натрію нітриту в концентрованій кислоті сірчаній).

Найчутливішими виявилися реактиви Лібермана та Манделіна, які дозволяють виявити 1 і 2 мкг метоклопраміду в пробі відповідно. Реакції з реактивами Лібермана та Манделіна дозволяють відрізнити метоклопрамід від структурних аналогів, протиблювотних та блювотних засобів, деяких інших препаратів, що можуть призначатися разом з ним (новокаїн, новокаїнамід, амідопірин, кислота ацетилсаліцилова, парацетамол, анальгін, галоперідол, димедрол, аміназин, дипразин, морфін, кодеїн, папаверин, апоморфін, кофеїн, атропін, кокаїн, платифілін, скополамін).

При вивченні мікрокристалоскопічних реакцій кристали характерної форми жовтого кольору з розчином метоклопраміду в краплинній пробі утворював 0,5% розчин кислоти пікринової (подвійні пучки голок, які спрямовані в різні боки).

Інші осадові реактиви - Бушарда, Вагнера (розчини йоду в калію йодиді), Драгендорфа (розчин вісмуту йодиду в калію йодиді), Марме, (розчин кадмію йодиду в калію йодиді) Зонненшейна (розчин кислоти фосфорномолібденової), Бертрана (розчин кислоти кремнійвольфрамової), Шейблера (розчин кислоти фосфорновольфрамової), сіль Рейнеке (1% розчин амонію тетрароданодіамінохроміату), 1% розчин калію перманганату давали з метоклопрамідом аморфні осади різного забарвлення. Найбільш чутливими серед осадових реактивів виявилися реактиви Вагнера та Драгендорфа (межа виявлення 0,5 мкг в пробі, граничне розведення 1:100000).

Вказано, що реакція утворення азобарвника, де азоскладовим компонентом є N-(1-нафтил)-етилендіаміну дигідрохлорид (реактив Браттона-Маршалла), має високу чутливість і її зручно використовувати для цілей хіміко-токсикологічного аналізу метоклопраміду. Ця реакція виявилася придатною як для ідентифікації метоклопраміду (метод ТШХ), так і для кількісного визначення препарату у водних розчинах, лікарських формах та витяжках з біологічного матеріалу (фотоколориметричний метод).

Нами вивчені умови виявлення метоклопраміду за допомогою методу хроматографії в тонких шарах сорбенту. Використовували пластини “Sorbfil” (силікагель СТХ-1А; тип основи ПЕТФ), “Армсорб” (сорбент КСКГ, фракція 5ч20 мкг, товщина шару 100±25 мкм), “Silufol UV-254”, скляні пластини для високоефективної ТШХ “Merck”. Розмір всіх пластин 10Ч10 см (“Армсорб” - 5Ч10 см). Пластини обприскували 0,1М розчином калію гідроксиду в метанолі, висушували і активували в сушильній шафі при 110°С протягом 30 хв. Хроматографування проводили в камері об'ємом 1000 см3, в 4-х системах розчинників: метанол-25% розчин аміаку (100:1,5), хлороформ-метанол (90:10), метанол-хлороформ (90:10), гексан-толуол-діетиламін (75:15:10). В цих системах розчинників одержали значення Rf для метоклопраміду від 0 до 0,54.

Плями метоклопраміду проявляли за допомогою УФ-світла (темно-фіолетова флуоресценція, межа виявлення 1 мкг у пробі), парів йоду (коричневе забарвлення, межа виявлення 0,2 мкг у пробі), реактиву Драгендорфа за Муньє (оранжеве забарвлення, межа виявлення 0,2 мкг у пробі), лужного розчину 2-нафтолу після діазотування препарату (червоно-оранжеве забарвлення, межа виявлення 0,1 мкг у пробі), 0,1% розчину N-(1-нафтил)-етилендіаміну дигідрохлориду після діазотування препарату (лілово-рожеве забарвлення, межа виявлення 0,02 мкг у пробі), розчину п-диметиламінобензальдегіду в кислоті сірчаній (жовто-зелене забарвлення, межа виявлення 0,5 мкг у пробі), послідовної обробки реактивами 0,3М розчином міді сульфату та 0,3М розчином калію йодиду (коричневе забарвлення, межа виявлення 0,2 мкг у пробі).

Ми також застосували метод ТШХ для виявлення метоклопраміду в присутності деяких інших лікарських препаратів, які являють собою органічні основи та їх солі (аміназин, анестезин, дибазол, димедрол, новокаїн, трифтазин, дипразин, кодеїн, кокаїну гідрохлорид, папаверину гідрохлорид, пахікарпіну гідройодид, платифіліну гідротартрат, морфіну гідрохлорид, фентаніл). Вивчена можливість застосування розроблених умов хроматографування для виявлення метоклопраміду та його очистки від співекстрактивних речовин у витяжках з біологічного матеріалу. Найбільш придатною для цієї мети виявилася система метанол-хлороформ (90:10).

Нами встановлено, що розчин солі діазонію на основі метоклопраміду при концентрації препарату 140 мкг/мл і вище має лимонно-жовте забарвлення. Реакцію можна виконувати краплинно, а також на пластинах для ТШХ. Крім того, для ідентифікації метоклопраміду можна використати електронний спектр солі діазонію препарату, який суттєво відрізняється від його спектра в 0,1М розчині кислоти хлороводневої. Спектр препарату в 0,1М розчині кислоти хлороводневої має дві смуги поглинання з лмакс 273 нм та 309 нм, а спектр солі діазонію метоклопраміду має дві смуги поглинання з лмакс 284 нм та 380 нм.

Реакцію діазотування метоклопраміду ми застосовували для ідентифікації препарату в субстанції, лікарських формах (ін'єкційні розчини, таблетки) та витяжках з біологічного матеріалу.

Вивчена можливість застосування УФ-спектроскопії для ідентифікації метоклопраміду в витяжках з біологічного матеріалу. Встановлено, що співекстрактивні речовини заважають ідентифікації метоклопраміду цим методом. В зв'язку з цим необхідна додаткова екстракційна та хроматографічна очистка витяжок.

2. Кількісне визначення метоклопраміду

Для кількісного визначення метоклопраміду нами розроблені доступні і надійні фотоколориметричний, екстракційно-фотометричний, а також іонометричний методи.

Фотоколориметричний метод визначення метоклопраміду заснований на реакції утворення азобарвника при взаємодії продукту діазотування препарату з N-(1-нафтил)-етилендіаміну дигідрохлоридом. При розробці даного методу ми провели дослідження впливу на оптичну густину азобарвника зміни концентрації кислоти хлороводневої, вивчили стабільність оптичної густини азобарвника протягом 60 хв, дослідили інтервали часу для внесення в реакційну суміш кожного з компонентів, а також провели вибір оптимального світлофільтра та робочої довжини кювети.

Нами встановлено, що метоклопрамід в кислому середовищі після діазотування і видалення надлишку нітрит-іонів вступає в реакцію з N-(1-нафтил)-етилендіаміну дигідрохлоридом з утворенням лілово-рожевого забарвлення. Оптичну густину розчинів азобарвника вимірювали на фотоколориметрі КФК-2 (світлофільтр з леф = 540±10 нм, кювета з товщиною шару 20 мм). Оптична густина забарвлених розчинів підпорядковується основному закону світлопоглинання в межах концентрацій метоклопраміду від 2 до 40 мкг в 10 мл кінцевого об'єму.

Розрахунок вмісту метоклопраміду в розчинах, що досліджували, проводили за допомогою калібрувального графіку. Відносна помилка визначень становить ±2,02%. Метод застосований для кількісного визначення метоклопраміду в водних розчинах, модельних лікарських формах, а також у витяжках з біологічного матеріалу.

Екстракційно-фотометричний метод визначення метоклопраміду заснований на утворенні іонного асоціату препарату з метиловим оранжевим (молярне співвідношення 1:1), який при рН 4,6 екстрагується хлороформом. Вказаний іонний асоціат має малий питомий коефіцієнт світлопоглинання, тому для підвищення чутливості методу ми розкладали його за допомогою спиртового розчину кислоти сірчаної. При цьому виділялася еквівалентна препарату кількість вільного метилового оранжевого, що має значно більший питомий коефіцієнт світлопоглинання.

При розробці даного методу ми вивчили вплив рН водної фази на утворення та екстракцію іонних асоціатів метоклопраміду з метиловим оранжевим, вплив на цей процес кількості барвника, а також провели вибір оптимального світлофільтра та робочої довжини кювети. Оптичну густину забарвлених розчинів вимірювали на фотоколориметрі КФК-2 (світлофільтр з леф = 540±10 нм, кювета з товщиною шару 10 мм). Оптична густина забарвлених розчинів підпорядковується основному закону світлопоглинання в межах концентрацій препарату від 5 до 100 мкг в 12 мл кінцевого об'єму.

Розрахунок вмісту метоклопраміду в розчинах, що досліджували, проводили за допомогою калібрувального графіку. Відносна помилка визначень становить ±2,49%. Метод застосований для кількісного визначення метоклопраміду у водних розчинах, модельних лікарських формах, а також у витяжках з біологічного матеріалу.

3. Іонометричний аналіз метоклопраміду

Нами розроблені склад мембрани та конструкція нового твердоконтактного іонселективного електрода (ІСЕ) на метоклопрамід, який має кращі електроаналітичні характеристики, ніж відомі раніше.

Мембрана твердоконтактного ІСЕ на метоклопрамід складається з структурного компонента (полівінілхлорид), пластифікатора-розчинника (дибутилфталат), електродоактивної речовини (комплекс метоклопраміду з кислотою фосфорновольфрамовою) та стабілізатора потенціалу електрода в зоні утворення твердого контакту (високодисперсне активоване вугілля). Співвідношення компонентів мембрани (вагові %):

Конструктивно твердоконтактний ІСЕ на метоклопрамід є полівінілхлоридним стрижнем діаметром 10 мм і довжиною 120 мм, у якому висвердлено 2 співосних канали: перший - діаметром 3 мм і довжиною 90 мм та другий - діаметром 5 мм до кінця стрижня. В більший за діаметром канал запресований графітовий стрижень, на внутрішній торець якого гальванічно нанесений шар міді, та припаяний вивід електрода. На зовнішній торець графітового стрижня, який заздалегідь запресований врівень в полівінілхлоридний корпус електрода, наносять мембранну композицію. Конструкція твердоконтактного ІСЕ на метоклопрамід представлена на:



Рис. 1.1 Конструкція твердоконтактного ІСЕ на метоклопрамід: 1 - полівінілхлоридна трубка; 2 - графітовий стрижень; 3 - шар міді; 4 - мембрана електрода; 5 - місце припаювання провідника; 6 - пробка, що загвинчується; 7 - провідник.

Електродна функція запропонованого нами ІСЕ на метоклопрамід є лінійною в інтервалі концентрацій від (1,0±0,2)•10-1 до (3,0±0,4)•10-6М препарату з крутістю 59±1 мВ. Мінімальна концентрація метоклопраміду у водних розчинах, яку можна визначити за допомогою розробленого електрода складає 1,3•10-6 моль/л. Потенціал запропонованого ІСЕ на метоклопрамід, стійкий в інтервалі рН 2,0-8,0. Мембрана працездатна протягом 1 року.

Запропоновані методи іонометричного визначення метоклопраміду у водних розчинах (відносна помилка ±1,84%), модельних лікарських формах (ін'єкційні розчини, таблетки) за допомогою розробленого ІСЕ на препарат. Іонселективний електрод на метоклопрамід застосовано для кількісного визначення препарату у витяжках з біологічного матеріалу. Вказано на можливість визначення метоклопраміду за допомогою розробленого ІСЕ в мікроб'ємах (1 мл, 1 крапля) розчинів препарату.

На склад мембрани нового твердоконтактного іонселективного електрода на метоклопрамід отримано рішення про видачу патенту України.

4. Вивчення умов екстракції метоклопраміду з водних розчинів

Для наступної розробки оптимальних умов ізолювання метоклопраміду з біологічного матеріалу ми вивчили екстракцію препарату з водних розчинів деякими органічними розчинниками в залежності від рН середовища.

Для утворення необхідних значень рН водних розчинів використовували універсальну буферну суміш. Кислотність буферних розчинів контролювали потенціометрично. Використовували розчини з рН від 2,0 до 10,0. Як органічні розчинники (екстрагенти) застосовували найбільш поширені в хіміко-токсикологічному аналізі, свіжоперегнані хлороформ, діетиловий ефір і гексан. Проводили одноразову екстракцію метоклопраміду. Об'єм органічного розчинника (екстрагента) дорівнював об'єму водної фази. Шар органічного розчинника відділяли та випарювали. Сухий залишок розчиняли в 2М розчині кислоті хлороводневої і кількість метоклопраміду в цьому розчині визначали фотоколориметричним методом за реакцією утворення азобарвника.

Одержані дані свідчать про те, що при рН 2-4 жоден з вибраних розчинників не екстрагує метоклопрамід. Хлороформ починає екстрагувати препарат з водних розчинів при рН 4,0-5,0 (ступінь екстракції 0,8-3,0%). Максимум екстракції препарату хлороформом має місце при рН 10 (ступінь екстракції біля 99%). Діетиловий ефір починає екстрагувати препарат при рН 6,0-7,0 (ступінь екстракції 1,2-6,4%), а максимум екстракції в інтервалі, що досліджували, спостерігався при рН 10 (ступінь екстракції біля 94%). Незначна кількість препарату (ступінь екстракції біля 5%) екстрагується гексаном тільки при рН 10.

Таким чином, кращим з вищевказаних екстрагентів для виділення метоклопраміду з лужних водних витяжок є хлороформ, а діетиловий ефір зручно використовувати для екстракційного очищення кислих водних витяжок, що містять препарат.

5. Виділення метоклопраміду з біологічного матеріалу

В літературі відсутні відомості про методи виділення метоклопраміду з біологічного матеріалу. Спочатку ми порівняли ефективність загальноприйнятих в хіміко-токсикологічному аналізі методів ізолювання органічних речовин основного характеру з біологічного матеріалу стосовно до метоклопраміду:

О.О. Васильєвої (витягання водою, підкисленою кислотою щавлевою);

В.П. Крамаренка (витягання водою, підкисленою кислотою сірчаною);

Стаса-Отто (витягання спиртом етиловим, підкисленим кислотою щавлевою).

Виявилося, що ці методи дозволяють ізолювати від 30% (Стаса-Отто) до 50-55% (О.О. Васильєвої та В.П. Крамаренка) препарату з біологічного матеріалу (тканина печінки).

Ми поставили задачу розробити більш ефективний та експресний індивідуальний метод ізолювання метоклопраміду з біологічного матеріалу. Метод заснований на розтиранні подрібненого біологічного матеріалу, що містить препарат, з потрійною кількістю безводного натрію сульфату та наступним елююванням метоклопраміду з одержаної суміші у скляній колонці хлороформом. Хлороформний елюат піддавали додатковому екстракційному очищенню, оскільки наявність великої кількості співекстрактивних речовин заважала подальшому дослідженню витяжок.

Очищені проби витяжок використовували для ідентифікації метоклопраміду, виділеного з біологічного матеріалу за допомогою кольорових і осадових реакцій, методу ТШХ, а також для кількісного визначення препарату фотоколориметричним, екстракційно-фотометричним та іонометричним методами.

Розроблений метод ізолювання метоклопраміду за допомогою хлороформу дозволяє виділити 70-75% препарату з біологічного матеріалу.

Для виявлення метоклопраміду, виділеного з біологічного матеріалу методами УФ-, ІЧ-спектроскопії, необхідно додаткове очищення витяжок методами екстракції, ТШХ або іншими.

Слід зазначити, що співекстрактивні речовини з біологічного матеріалу часто заважають процесу хроматографування (розтягнуті плями метоклопраміду разом із співекстрактивними речовинами, близьке значення Rf препарату та вищезгаданих речовин). Для покращення умов хроматографування, пластини з нанесеними зразками вміщували в хроматографічну камеру з хлороформом. При цьому плями метоклопраміду залишалися на старті, а плями співекстрактивних речовин мігрували в бік фінішу. Після цього пластини висушували та вміщували в камеру з системою розчинників метанол-хлороформ (90:10). В цих умовах спостерігався задовільний розподіл плям метоклопраміду та співекстрактивних речовин.

Для виявлення метоклопраміду методом УФ-спектроскопії проводили попередню хроматографічну очистку, як зазначено вище. Після цього ретельно елюювали препарат з фрагменту шару сорбенту, який відповідав плямі метоклопраміду за допомогою метанолу. Екстракт відфільтровували та випарювали. Сухий залишок розчиняли в 0,1М розчині кислоти хлороводневої. Проводили ідентифікацію метоклопраміду в цьому розчині за допомогою методу УФ-спектроскопії.

Нами також запропоновані методики виділення метоклопраміду з біологічних рідин організму (крові, сечі).

Методика виділення метоклопраміду з крові заснована на осадженні формених елементів крові 0,1М розчином кислоти хлороводневої (з центрифугуванням), очищенні кислої водної витяжки ефіром діетиловим, підлуговуванні витяжки до рН 10 та екстракції препарату за допомогою хлороформу. Методика дозволяє виділити 55-60% метоклопраміду з крові.

Виділення метоклопраміду з сечі засноване на підкисленні проби з препаратом 0,1М розчином кислоти хлороводневої до рН 2,0-3,0, очищенні кислої водної витяжки ефіром діетиловим з подальшим підлуговуванням водної витяжки до рН 10 та екстракції препарату хлороформом. Методика дозволяє виділити 67-72% метоклопраміду з сечі.

Результати вивчення розподілу метоклопраміду в органах отруєних тварин (щурів) через 3 години після внутрішньошлункового введення препарату показали, що метоклопрамід в найбільших кількостях знаходиться в шлунку, кишечнику зі вмістом, легенях, нирках, серці і печінці (в порядку зменшення).

Вивчено зберігання метоклопраміду в трупному матеріалі при його гнитті. Вказано, що метод ізолювання за допомогою хлороформу через

40 діб зберігання біологічного матеріалу (тканина печінки) дозволяє виділити з нього біля 61% метоклопраміду.

Висновки

Запропоновано кольорові, осадові і мікрокристалоскопічні реакції, а також методи ТШХ, УФ-спектроскопії, що придатні для виявлення метоклопраміду, який виділено з біологічного матеріалу. Межа виявлення становить 25 мкг препарату в 10 г біологічного матеріалу.

Розроблено доступні і чутливі методи кількісного визначення

метоклопраміду:

а) фотоколориметричний, що заснований на реакції утворення азобарвника, де азоскладовим компонентом є N-(1-нафтил)-етилендіаміну дигідрохлорид; оптична густина забарвлених розчинів підпорядковується основному закону світлопоглинання в межах концентрацій від 2 до 40 мкг метоклопраміду в 10 мл кінцевого об'єму;

б) екстракційно-фотометричний, що заснований на утворенні іонного асоціату метоклопраміду з метиловим оранжевим; оптична густина забарвлених розчинів підпорядковується основному закону світлопоглинання в межах концентрацій від 5 до 100 мкг метоклопраміду в

12 мл кінцевого об'єму.

Методи застосовані для кількісного визначення метоклопраміду в водних розчинах, лікарських формах (ін'єкційні розчини і таблетки) та в витяжках з біологічного матеріалу.

Розроблено склад мембрани і конструкцію нового твердоконтактного іонселективного електрода на метоклопрамід, що перевершує за своїми електроаналітичними характеристиками відомі раніше. Електрод застосований для кількісного визначення препарату в водних розчинах, лікарських формах (ін'єкційні розчини і таблетки). Вперше розроблено метод визначення метоклопраміду за допомогою нового ІСЕ у витяжках із біологічного матеріалу. Вказано на можливість визначення концентрацій препарату в мікрооб'ємах розчинів (1 мл і 1 крапля) за допомогою даного електрода. На склад мембрани ІСЕ на метоклопрамід отримано рішення про видачу патенту України. Запропонований електрод може знайти застосування у фармацевтичному і хіміко-токсикологічному аналізі.

Вивчено умови екстракції метоклопраміду з водних розчинів у залежності від рН середовища. Вказано, що максимум екстракції препарату хлороформом має місце при рН 10, а діетиловий ефір зручно використовувати для екстракційного очищення водних витяжок з біологічного матеріалу від співекстрактивних речовин у кислому середовищі.

Вперше проведена порівняльна оцінка виділення метоклопраміду з біологічного матеріалу загальноприйнятими в хіміко-токсикологічному аналізі методами, а також розроблений більш ефективний і експресний індивідуальний метод ізолювання препарату за допомогою хлороформу. Метод дозволяє виділити 70-75% метоклопраміду з біологічного матеріалу.

Вивчено умови виявлення метоклопраміду у витяжках із біологічного матеріалу методами ТШХ й УФ-спектроскопії. Для кількісного визначення препарату у витяжках із біологічного матеріалу застосовані фотоколориметричний, екстракційно-фотометричний та іонометричний методи.

Запропоновано методики виділення метоклопраміду з біологічних рідин організму (крові і сечі), що дозволяють ізолювати до 60 і до 72% препарату відповідно.

Встановлено, що найбільша кількість метоклопраміду, через 3 години після внутрішньошлункового введення тваринам, знаходиться в шлунку, кишечнику зі вмістом, легенях, нирках, серці та печінці. Ці органи рекомендовано відправляти на судово-хімічні дослідження біологічного матеріалу на метоклопрамід в разі летальних отруєнь препаратом.

Вивчено зберігання метоклопраміду в біологічному матеріалі при його гнитті. Вказано, що за допомогою методу ізолювання хлороформом через 40 діб з тканини печінки, що піддалася гнильним змінам, можна виділити до 61% препарату.

На основі проведених досліджень запропоновано схему хіміко-токсикологічного аналізу біологічного матеріалу на метоклопрамід.

Список опублікованих праць за темою дисертації

Болотов В.В., Мороз В.П., Зареченський М.А. Порівняльна оцінка методів виділення метоклопраміду з біологічного матеріалу // Вісник фармації. - 1999. - №1(19). - С.45-48.

Болотов В.В., Зареченский М.А., Мороз В.П. Ионометрическое определение метоклопрамида гидрохлорида в лекарственных формах // Фізіологічно активні речовини. - 1999. - №1(27). - С.66-68.

Болотов В.В., Мороз В.П. Застосування тонкошарової хроматографії, кольорових і осадових реакцій для виявлення метоклопраміду // Вісник фармації. - 1999. - №2(20). - С.98-100.

Болотов В.В., Зареченский М.А., Мороз В.П. Твердоконтактный ионоселективный электрод на метоклопрамид // Фізіологічно активні речовини. - 1999. - №2(28). - С. 75-78.

Болотов В.В., Мороз В.П. Фотоколориметрические методы определения метоклопрамида и его экстракция из водных растворов органическими растворителями в зависимости от рН среды // Вісник проблем біології і медицини. - 1999. - №9. - С.105-109.

Рішення про видачу патенту України за заявкою №99042019 МПК6 G 01 N27/30. Мембрана твердоконтактного іонселективного електрода для визначення концентрації іонів метоклопраміду /

Болотов В.В., Зареченський М.А., Мороз В.П. (Україна). Заявл. 09.04.99.

Болотов В.В., Мороз В.П., Зареченский М.А. Сравнительная оценка методов выделения метоклопрамида из биологического материала // Досягнення сучасної фармації та перспективи її розвитку у новому тисячолітті: Матеріали V Національного з'їзду фармацевтів України (6-10 вересня 1999 р., м. Харків). - Харків, 1999. - С.486-487.

Болотов В.В., Мороз В.П. Хіміко-токсикологічне дослідження метоклопраміду // Всеукраїнська науково-практична конференція “Вчені України - вітчизняній фармації”: Тез. доп. 19 жовтня

2000 р. - Харків, 2000. - С.179-181.

Анотація

Мороз В.П. “Хіміко-токсикологічне дослідження метоклопраміду”. - Рукопис.

Дисертація на здобуття вченого ступеня кандидата фармацевтичних наук за спеціальністю 15.00.02 - фармацевтична хімія та фармакогнозія.

Національна фармацевтична академія України, Харків, 2000.

У роботі представлені результати виявлення метоклопраміду в біологічному матеріалі за допомогою кольорових, осадових та мікрокристалоскопічних реакцій, методів ТШХ, УФ-спектроскопії.

Запропоновані доступні та чутливі фотоколориметричний та екстракційно-фотометричний методи кількісного визначення препарату у водних розчинах, лікарських формах та витяжках з біологічного матеріалу.

Розроблено склад мембрани і конструкцію нового твердоконтактного іонселективного електрода на метоклопрамід.

Вивчено виділення метоклопраміду з біологічного матеріалу загальноприйнятими у хіміко-токсикологічному аналізі методами і запропоновано ефективний індивідуальний метод ізолювання метоклопраміду за допомогою хлороформу.

Ключові слова: метоклопрамід, кольорові та осадові реакції, тонкошарова хроматографія, фотоколориметрія, іонселективний електрод, екстракція, біологічний матеріал, хіміко-токсикологічний аналіз.

Аннотация

Мороз В.П. “Химико-токсикологическое исследование метоклопрамида”. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук по специальности 15.00.02. - фармацевтическая химия и фармакогнозия. - Национальная фармацевтическая академия Украины, Харьков, 2000.

Диссертационная работа посвящена химико-токсикологическому исследованию противорвотного препарата метоклопрамида.

В работе представлены результаты обнаружения метоклопрамида с помощью цветных, осадочных и микрокристаллоскопических реакций, методов ТСХ, УФ-спектроскопии.

Показано, что высокую чувствительность имеют цветные реакции метоклопрамида с реактивами Либермана и Манделина. Эти реактивы дают с метоклопрамидом окрашивание отличное от ряда препаратов, выбранных для сравнения. Наиболее чувствительной и пригодной для целей химико-токсикологического анализа метоклопрамида оказалась реакция образования азокрасителя, где в качестве азосоставляющего компонента выступает N-(1-нафтил)-этилендиамина дигидрохлорид. Данная реакция использована нами для обнаружения метоклопрамида в вытяжках из биологического материала (метод ТСХ), а также для количественного определения (фотоколориметрический метод).

Среди осадочных наиболее чувствительными оказались реакции с реактивами Вагнера и Драгендорфа (предел обнаружения 0,5 мкг в пробе, предельное разведение 1:100000). С каплей 0,5% раствора кислоты пикриновой в капельной пробе раствора метоклопрамида выпадают светло-желтые кристаллы, имеющие характерную форму (двойные пучки игл, направленные в разные стороны).

Для обнаружения и разделения метоклопрамида и ряда препаратов, которые могут назначаться вместе с ним, использовали хроматографические пластины “Sorbfil”, “Амсорб”, “Silufol UV-254”, “Merck” и четыре системы растворителей. Предел обнаружения в данных условиях 0,02 мкг в пробе (проявление по реакции образования азокрасителя с реактивом Браттона-Маршалла), значение Rf от 0 до 0,54.

Разработан доступный и чувствительный метод фотоколориметрического определения метоклопрамида в водных растворах, лекарственных формах и извлечениях из биологического материала на основе реакции образования азокрасителя при взаимодействии с N-(1-нафтил)-этилендиамина дигидрохлоридом. Метод позволяет обнаружить от 2 мкг препарата в 10 мл конечного объема с относительной ошибкой ±2,02%.

Предложен простой и надежный метод экстракционно-фотометрического определения метоклопрамида в водных растворах, лекарственных формах и вытяжках из биологического материала, основанный на образовании ионного ассоциата препарата с метиловым оранжевым. Метод позволяет обнаружить от 5 мкг метоклопрамида в 12 мл конечного объема с относительной ошибкой ±2,49%.

Разработаны конструкция и состав мембраны нового твердоконтактного ионоселективного электрода (ИСЭ) на метоклопрамид, превосходящего по своим аналитическим характеристикам известные ранее. Электрод применен для количественного определения препарата в водных растворах, лекарственных формах и извлечениях из биологического материала.

Исследованы условия экстракции метоклопрамида из водных растворов хлороформом, диэтиловым эфиром и гексаном в интервале рН от 2,0 до 10,0. Показано, что максимум экстракции препарата хлороформом имеет место при рН 10 (степень экстракции около 99%), а диэтиловый эфир удобно использовать для очистки кислых водных вытяжек, содержащих метоклопрамид.

Изучены условия изолирования метоклопрамида из биологического материала с помощью общепринятых в химико-токсикологическом анализе методов А.А. Васильевой, В.Ф. Крамаренко, Стаса-Отто. Установлено, что методы Васильевой и Крамаренко позволяют изолировать 50-55% препарата из биологического материала, а метод Стаса-Отто - около 30%. Разработан эффективный частный метод изолирования метоклопрамида с помощью хлороформа, который позволяет выделить 70-75% препарата из биологического материала.

Предложены методы изолирования метоклопрамида из биологических жидкостей организма (крови и мочи), которые позволяют выделить 56-60% препарата из крови, и 66-72% из мочи. Изучено распределение метоклопрамида в органах отравленных животных. Установлено, что через 3 ч после внутрижелудочного введения метоклопрамида крысам, наибольшее количество препарата содержится в желудке, кишечнике с содержимым, легких, почках, сердце и печени (в порядке уменьшения). Показано, что с помощью метода изолирования хлороформом после 40 суток хранения (при температуре 5°С) из биологического материала (ткань печени) можно выделить около 61% метоклопрамида.

На основе проведенных исследований предложена схема химико-токсикологического анализа биологического материала на метоклопрамид.

Ключевые слова: метоклопрамид, цветные и осадочные реакции, тонкослойная хроматография, фотоколориметрия, ионоселективный электрод, экстракция, биологический материал, химико-токсикологический анализ.

Summary

Moroz V.P. “The chemico-toxicological investigation of Metoclopramide”. - Manuscript.

The thesis for the Master D. of Pharmacy on speciality 15.00.02 - Pharmaceutical chemistry and Pharmacognosy. - National Academy of Pharmacy of Ukraine, Kharkov, 2000.

The results of Metoclopramide identification in biological materials colour, sedimentary and microcrystalloscopic reactions, thin-layer chromatographic, UV-spectroscopic methods are represented in the thesis.

Accessible and sensitive methods of Metoclopramide quantitative determination in water solutions, pharmaceutical preparations and extracts from biological material - photocolorimetry and extractive photometry are offered.

Optimum membrane structure and design of new solid-contact ion-selective electrode on Metoclopramide.

The Metoclopramide extraction from biological material with generally accepted in chemico-toxicological analysis methods has been studied. The effective individual method of Metoclopramide isolation by chloroform is carried out.

Key words: Metoclopramide, colour and sedimentary reactions, thin-layer chromatography, photocolorimetry, ion-selective electrode, extraction, biological material, chemico-toxicological analysis.

Размещено на Allbest.ru