Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІООРГАНІЧНОЇ ХІМІЇ ТА НАФТОХІМІЇ

КАРПОВ Олександр Вікторович

УДК 577.323.23.434.435/578.245.2

МОЛЕКУЛЯРНІ КОМПЛЕКСИ ОДНОЛАНЦЮГОВИХ РНК З ІНТЕРКАЛЯТОРАМИ - ІНДУКТОРИ ІНТЕРФЕРОНІВ I ТИПУ

02.00.10 - біоорганічна хімія

03.00.06 - вірусологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ - 2000

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі проблем інтерферону та імуномодуляторів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного Національної академії наук України.

Науковий консультант:

доктор біологічних наук, професор СПІВАК Микола Якович,

Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділу проблем інтерферону та імуномодуляторів

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор РАДАВСЬКИЙ Юрій Леонідович, Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України,

завідувач відділу структури і функції білків та пептидів заслужений діяч науки, доктор медичних наук, професор ЩЕРБИНСЬКА АЛЛА МИХАЙЛІВНА, Інститут епідеміології і інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського МОЗ України,

завідувач лабораторії загальної вірусології доктор біологічних наук, професор ВОЙЦІЦЬКИЙ Володимир Михайлович, Київський національний університет ім. Тараса Шевченка, професор кафедри біохімії

Провідна установа: Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, відділ молекулярної вірусології

Захист відбудеться 21 квітня 2000 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.220.01 в Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, 02094, Київ-94, вул.Мурманська, 1.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, 02094, Київ-94, вул.Мурманська, 1.

Автореферат розіслано 20 березня 2000 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д.М. Федоряк

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Значення поглибленого вивчення інтерферонів (ІФН) важко переоцінити. В теоретичному плані ці дослідження відкривають нові перспективи на шляху встановлення механізму дії цитокінової системи організму. До того ж процес регуляції експресії генів ІФН є цікавим і на даний час одним з найбільш вивчених прикладів регуляції складних еукаріотичних генів. В практичному плані багаторічний досвід клінічного використання препаратів ІФН дозволив встановити їх ефективність для профілактики та лікування вірусних і деяких онкологічних захворювань.

Експресія генів ІФН, як і багатьох інших цитокінів, починається з індукції, тобто такої активації генів ІФН, яка здійснюється ззовні клітини. Індукторами ІФН І типу (ІФН-/) виступають віруси, а також природні дволанцюгові РНК (длРНК) різного походження та синтетичні дволанцюгові рибополінуклеотиди. Крім того, здатність до індукції притаманна також цілому ряду низькомолекулярних синтетичних сполук.

Індуктори ІФН знайшли застосування при широкомасштабному виробництві препаратів ІФН, а також, внаслідок своєї інтерфероногенної, противірусної, імуномодулюючої та антипроліферативної дії, поряд з самим ІФН, в лікарській практиці. Однак жоден з відомих інтерфероногенів не відповідає головним критеріям, що висуваються до них практикою, а саме: отримання досить значних і довготривалих рівнів концентрації ІФН в організмі (і в культурах клітин) при мінімальному рівні токсичності індуктора. До того ж на сьогодні відсутня теоретично обгрунтована концепція, яка узагальнювала б механізми дії всіх відомих інтерфероногенів з огляду на сучасні дані щодо регуляції експресії генів ІФН. Виходячи з цього, вирішення окремих аспектів загальної проблеми індукованого біосинтезу ІФН-/ та пошук і конструювання принципово нових індукторів ІФН-/ з метою їх подальшого застосування в медицині та біотехнології, чому присвячена дана робота, вважається досить перспективним напрямком досліджень як в теоретичному, так і в практичному планах.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась згідно з тематикою відділу проблем інтерферону та імуно-модуляторів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, а також з науковою програмою ДКНТ України 1993-1995 р.р. “Здоров'я людини”.

Мета і завдання досліджень. Мета роботи - створити принципово нові індуктори ІФН І типу (ІФН-/) на основі молекулярних комплексів одноланцюгових полірибонуклеотидів з низькомолекулярними лігандами - інтеркаляторами, відбір найбільш перспективних з них, з подальшим викори-станням в умовах in vivo та in vitro, встановити їх фізико-хімічні параметри і біологічні властивості, та оцінити перспективність їх застосування як противірусних препаратів. Для досягнення поставленої в роботі мети вирі-шувались такі завдання:

1. Одержати молекулярні комплекси одноланцюгових полірибонуклеотидів з низкою низькомолекулярних лігандів;

2. Вивчити спектральні характеристики утворених молекулярних комплексів;

3. Встановити термодинамічні параметри зв'язування компонентів найбільш ефективного з отриманих комплексів, а саме комплексів з гідрохлоридом тилорону, в залежності від структури полімерного компоненту;

4. Створити за допомогою комп'ютерного моделювання молекулярну модель інтеркаляції гідрохлорида тилорону між парами азотистих основ дволанцюгової РНК в А-конформації;

5. Дослідити інтерфероногенну дію комплексів дріжджова РНК - тилорон та встановити тип ІФН, що при цьому індукується, і з огляду на отримані значення хіміотерапевтичних індексів, дати оцінку перспективності їх застосування, як індукторів ІФН-/ in vivo та in vitro;

6. Вивчити пов'язану з інтерфероногенезом противірусну дію комплексів на моделях референс-вірусів та ВІЛ-інфекції в дослідах in vitro;

7. Оцінити цитотоксичність комплексу та його вплив на рівні синтезу ДНК, РНК та білка в клітинах;

8. Дослідити імуномодулюючу активність комплексів.

Наукова новизна одержаних результатів. Досліджені фізико-хімічні властивості молекулярних комплексів полірибонуклеотидів з низкою синте-тичних лігандів. Вперше виявлена здатність одноланцюгових полірибонук-леотидів при комплексоутворенні з тилороном утворювати стабільні двоспі-ральні ділянки.

За допомогою комп'ютерного моделювання вперше створена моле-кулярна модель інтеркаляції тилорону між парами азотистих основ длРНК в А-конформації. Аналіз моделі дозволив відстежити стеричні фактори, які потенційно сприяють утворенню дволанцюгових структур при комплексо-утворенні.

Вперше продемонстрована здатність одноланцюгової дріжджової РНК в комплексі з тилороном до індукції ІФН І типу (ІФН-/) як в організмі лабораторних тварин, так і в культурах клітин людини та тварин. Детально вивчені кількісні та часові параметри інтерфероногенезу. Встановлено, що ефект індукції пов'язаний з виникненням в структурі нуклеїнового компо-ненту комплексу подовжених двоспіральних ділянок, які утворюються вна-слідок взаємодії між РНК та тилороном.

Визначені показники цитотоксичності комплексу дріжджова РНК - тилорон, а також досліджений його вплив на рівні внутрішньоклітинних синтезів ДНК, РНК та білка. З огляду на ці дані проведена оцінка пер-спективності застосування препарату цього комплексу, як індуктора ІФН in vivo та in vitro.

Встановлено, що препарат комплексу має значну противірусну дію. Виявлені значення хіміотерапевтичного індексу препарату дають змогу розглядати його, як перспективний противірусний препарат широкого спек-тру дії. Вперше показано, що сполукам цього типу притаманна здатність до інгібіції репродукції ВІЛ в культурах клітин.

Виявлена здатність препарату комплексу дріжджова РНК - тилорон до імуномодуляції.

На основі аналізу одержаних результатів і даних літератури запро-поновано нову гіпотезу інтегрального механізму індукції ІФН І типу, ключовим етапом якого є специфічна локальна деформація клітинної мембрани.

Практичне значення одержаних результатів. Отриманий в роботі блок принципово нових даних щодо фізико-хімічних та біологічних власти-востей молекулярних комплексів одноланцюгової РНК з тилороном може бути використаний для подальшого розвитку теоретичних аспектів вивчення механізму індукції ІФН.

Розроблений і експериментально підтверджений принцип викори-стання молекулярних комплексів дріжджової РНК з тилороном як перспек-тивних індукторів ІФН І типу. Комплекси можуть бути застосовані при широкомасштабному виробництві ІФН-/ як достатньо активні та високо-технологічні індуктори з низькою собівартістю.

Виявлені і підтверджені в дослідах інтерфероногенна, антивірусна та імуномодулююча активності комплексів можуть стати основою для розробки і клінічного впровадження сімейства принципово нових противірусних препаратів широкого спектру дії і зокрема анти-ВІЛ препаратів, а також препаратів - імуномодуляторів.

Особистий внесок здобувача. Дослідження виконано з ініціативи автора та за його безпосередньою участю в експериментах та аналізі результатів. Основний експериментальний матеріал одержано автором особисто та разом із співробітниками, які були залучені до роботи в ході виконання планових завдань дослідницької групи, керованої дисертантом. Визначення термодинамічних параметрів комплексів проведено на кафедрі генетики Київського національного університету ім.Т.Г. Шевченка спільно з докт. біол. наук, проф. С.М. Храпуновим та канд. біол. наук. А.В. Сиволо-бом; досліди з комп'ютерного моделювання - в Інституті молекулярної біології і генетики НАН України спільно з докт. біол. наук Д.М. Говоруном та канд. біол. наук Я.Р. Міщенко; вивчення анти-ВІЛ активності препаратів - в Київському науково-дослідному інституті епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського МОЗ України у співпраці з канд. біол. наук С.В. Антоненко та канд. мед. наук О.В. Барбашевою. В оцінці токсичної та противірусної дії препаратів приймала участь докт. мед. наук С.Л. Рибалко (Київський науково-дослідний інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського МОЗ України). Консультативна допомога при уза-гальненні фізико-хімічних даних була надана канд. фіз.-мат. наук В.М. Зозулею (Фізико-технічний інститут низьких температур ім. Б.І. Вєркіна НАН України, Харків). Сформульована в роботі гіпотеза обговорювалась на етапі підготовки з академіком НАН України І.С. Магурою (Інститут фізіоло-гії ім. O.O. Богомольця НАН України). Загальне керівництво при підготовці дисертації здійснювалось докт. біол. наук, проф. М.Я. Співаком.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповіда-лись та публікувались на Першій національній науково-практичній конференції з проблем ВІЛ/СНІД з міжнародною участю (Київ,1995), 3-й Міжнародній конференції “СПИД, рак и родственные проблемы” (Cанкт-Петербург, 1995), Міжнародній конференції “The 3-rd International Conference on AIDS in Asia and the Pacific” (Chiang Mai, Таіланд, 1995), Міжнародній конференції “The XI International Conference on AIDS” (Vancouver, Канада, 1996), Міжнародному симпозіумі FEMS “Novel methods and standardisation in microbiology” (Koice, Словаччина, 1996); II з`їзді українського біофізичного товариства (Харків, 1998) та Міжнародному конгресі “XIIIth International Congress of Pharmacology” (Mnchen, Німеччина, 1998). По темі роботи була зроблена доповідь на робочій нараді Національного комітету з проблем боротьби зі СНІДом при Президенті України (1997).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 33 роботи, в т.ч. 3 оглядові і 2 проблемні статті, 17 експериментальних статей та 7 тез допові-дей у вітчизняних і закордонних виданнях, одержано 4 патенти України на винаходи.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, чотирьох розділів - огляду літератури, загальної методики і основних методів досліджень, результатів досліджень, узагальнення отриманих даних, а також заключення, висновків та списку використаних джерел. Роботу викладено на 271 сторінці машинопису. Вона містить 20 таблиць та 48 малюнків. Список літератури включає 505 бібліографічних найменувань.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

В роботі використовували молекулярні комплекси одно- та дволанцю-гових полінуклеотидів різного походження з низькомолекулярними ліганда-ми. Високомолекулярними компонентами комплексів слугували РНК, отримані з різних джерел. Як низькомолекулярні компоненти комплексів використовувались тилорон гідрохлорид та ряд інших сполук (Табл.1). Препаратами порівняння в біологічних дослідах слугували відомі індуктори ІФН-/ рибонуклеїнової природи - ларифан, ридостин та poly(I)-poly(C).

Загальна методика дослідження полягала в отриманні найбільш суттєвих фізико-хімічних характеристик комплексів з синтетичними низькомолекулярними лігандами, які дозволяли скласти загальну картину як процесу комплексоутворення в цілому, так і конформаційних особливостей полімерних компонентів в складі молекулярних комплексів, виходячи з чого можна було проводити цілеспрямований відбір найбільш перспективних з комплексів для подальших біологічних випробувань. З цією метою застосо-вувався метод УФ-спектроскопії (Зенгер, 1987; Кантор, Шиммел, 1984).

Спектральні характеристики комплексів у видимому та УФ- діапазонах визначали за допомогою спектрофотометра “Specord UV-VIS” в диференційному режимі.

Використовуючи дані спектрофотометричного титрування полінуклеотидів тилороном, будували ізотерми зв'язування в координатах Скетчар-да (Crothers, 1969; McGhee, von Hippel, 1974).

Температурну денатурацію комплексів проводили в термостатованих комірках спектрофотометра “Beckman DU-88” (Австрія) з автоматичною реєстрацією при безперервному підвищенні температури. Денатураційні криві отримували в диференційному режимі.

Побудову молекулярних моделей інтеркаляційних комплексів проводили за допомогою напівемпіричного квантовохімічного методу MNDO/H (Burstein, Isaev, 1984). Комп'ютерний експеримент виконували на ПК “Pentium-166” з використанням програми “Desktop Molecular Modelling” (Oxford Electronic Publishing).

Блок біологічних методів, який увійшов в загальну методику досліджень, був підібраний згідно існуючих методичних рекомендацій щодо доклінічних випробувань нових інтерфероногенів і противірусних речовин (Ильенко, 1977; Вотяков с соавт., 1986).

Титри ІФН, який індукувався під дією МК в сироватках дослідних тварин та культурах клітин, визначали шляхом мiкротитрування в переще-плюванiй культурi клiтин L₉₂₉ (Садыков с соавт., 1978).

Токсичність препаратів МК оцінювали в дослідах in vitro за двома параметрами - життєздатністю перещеплюваних клітин та (у випадку суспензійних культур) щільністю клітинної суспензії. Розрахунки параметрів токсичності МК проводили, використовуючи значення максимально витриваної (МВК) і мінімально активної концентрацій (МАК), встановлені в дослідах.

Вплив МК на синтез ДНК, РНК та білка оцінювали в умовах in vitro за включенням радіоактивних попередників (³Н-тимiдину, ³Н-уридину та ³Н-лейцину) в загальний пул первинної культури мононуклеарних клітин (МНК) периферійної крові людини.

Вплив МК на противірусну резистентність культур клітин вивчали за допомогою мікрометоду скрінінгу противірусних сполук (Вотяков с соавт., 1986). Досліди проводили на трьох моделях клітина-вірус, використовуючи віруси хвороби Ньюкасла (ВХН), енцефаломіокардиту мишей (ВЕМК) і енцефаломіеліту коней (ВЭЛ), що розглядалися для нашого випадку, як референтні. В окремих дослідах проводили оцінку проти-ВІЛ дії МК in vitro на моделях гострої (культура клітин МТ-4, інфікована ВІЛ-І/BRU) і хронічної (культура клітин Н-9, інфікована ВІЛ-І/ІІІ В) інфекції.

Iмуномодулюючу дiю МК оцінювали на моделi лiмфоцитiв селезiнки мишей. Виходячи зі значень індексу стимуляції (ІС), який визначали по включенню Н³-тимiдину в лімфоцити згідно загальноприйнятої методики (Лефковитс, Пернис, 1988), визначали спонтанну проліферативну активність клітин та проліферативну активність у відповідь на дію стандартних мiтогенів - фітагемагглютиніну, конканаваліну A та ліпополісахариду під впливом МК.

Статистичну обробку експериментальних даних проводили за методом Бейлі (1962). Як критерій суттєвості відмінностей показників, що порівнювалися, використовували t-критерій Стьюдента. Відмінності оцінювалися як статистично достовірні у випадках, коли ймовірність випадковості у відмінності між показниками не перевищувала 0,05.

ОСНОВНІ РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

1. Фізико-хімічні властивості молекулярних комплексів одноланцюгових рибополінуклеотидів з тилороном та іншими лігандами

При вивченні зв'язування тилорону з одноланцюговою РНК (олРНК) за допомогою спектрофотометрії нами був знайдений ряд специфічних ефектів, що притаманні взаємодії інтеркаляторів з дволан-цюговими структурами, а саме, виражені гіпохромний і батохромний зсуви в УФ-спектрах комплексів та поява нового максимуму поглинання в області 280 нм (Рис.1).

Рис. 1. Абсорбційні спектри одноланцюгової РНК бактеріофагу MS2 в УФ-діапазоні при титруванні її тилороном (крива 1 - вихідна РНК, криві 2 - 5 - комплекси РНК-тилорон зі співвідношенням компонентів 1/22, 1/11, 1/7,4 та 1/5,6 М/М тилорон/РНК(фосфат) відповідно).

Вказані особливості УФ-спектрів, що спостерігалися також і при комплексоутворенні тилорону з одноланцюговими гомополірибонуклеотидами різного складу, свідчать, в свою чергу, про виникнення в розчині дійсного молекулярного комплексу олРНК - тилорон з відповідною зміною конформації нуклеїнового компоненту, а наявність гіпохромізму пояснюється утворенням в структурі олРНК впорядкованих дволанцюгових фрагментів.

Серед досліджених лігандів, здатних до комплексоутворення з ДНК (в тому числі і шляхом інтеркаляції) аналогічна поведінка при взаємодії з одноланцюговою РНК в досить значній мірі виявилась притаманна також трипафлавіну, адріаміцину, мітоксантрону та 2,5-діамінофлуоренону, але в найбільшій мірі - саме тилорону (Табл.1). Це може свідчити про те, що для здійснен-ня вказаного ефекту структура лігандів повинна в першу чергу забезпечувати можливість їх взаємодії з дволанцюговими полінуклеотидами шляхом інтеркаляції. Виняток складає актиноміцин Д, який, як відомо, внаслідок стеричних обмежень не взаємодіє з длРНК. Однак те, що дане явище не спостерігалося при комплексоутворенні з класичними інтеркаляторами - бромистим етидієм і акридиновим оранжевим, вказує на існування структурних особливостей, які відрізняють вищезгадані сполуки від інших. До таких особливостей можна, в першу чергу, віднести наявність в структурі ліганду достатньо великих аліфатичних бічних залишків (мітоксантрон, тилорон), а також характерне розміщення позитивного заряду молекул тилорону і трипафлавіну. На відміну від більшості трициклічних сполук такого типу, включаючи і вищезгадані інтеркалятори, в молекулах тилорону і трипафлавіну цей заряд розміщений на значній відстані від центру хромо-фора.

Аналіз отриманих денатураційних кривих олРНК та її комплексу з тилороном підтвердив припущення щодо виникнення в структурі комплексу олРНК - тилорон стабільних дволанцюгових ділянок (Табл.2).

Таблиця 2

Параметри теплової денатурації одноланцюгової РНК бактеріофагу MS2 та її комплексу з тилороном

Речовина	Гіперхромний ефект Н, %	Температура плавлення Тпл, 0С	Інтервал плавлення Т, 0С
РНК	2,10 0,05	44,8 0,2	15,3 0,1
Комплекс РНК - тилорон	4,05 0,05	45,8 0,2	9,7 0,1

В той час як перша крива має типовий вигляд для одноланцюгових полінуклеотидних структур, денатураційна крива РНК в складі комплексу суттєво відрізняється від вихідної. Так, при температурах нижче 40⁰C спостерігається зменшення поглинання (гіпохромний ефект), що відповідає утворенню двоспіральних структур в складі нуклеїнового компоненту комплексу. Величина гіпохромізму складає близько 47% від усього підви-щення поглинання при плавленні і пояснюється одночасним перебігом двох процесів - розплітанням двоспіральних ділянок та десорбції тилорону. Окрім того, форма денатураційної кривої змінюється на одностадійну з відповідним звуженням інтервалу плавлення.

При дослідженні термодинамічних параметрів зв'язування тилорону з полінуклеотидами, виходячи з отриманих ізотерм адсорбції (Рис.2), встановлено, що константи зв'язування для ДНК та poly(U) дорівнюють 5,3 10⁵ М¹ та 4,7 10⁴ М¹ відповідно, в той час як розмір сайтів зв'язування для цих полінуклеотидів дорівнює відповідно приблизно 2 парам основ і 1 нуклео-тидові. Константи зв'язування для одно- і дволанцюгових ділянок нативної дріжджової РНК в наших дослідах дорівнювали 1,3 10⁵ М¹ та 1,1 10⁴ М¹ відповідно. При цьому частка дволанцюгових ділянок у структурі РНК досягала 32%, що значно вище згаданої кількості, раніше визначеної для тих же зразків РНК у відсутності тилорону.

Таким чином в цих дослідах вдалось зафіксувати досить унікальне явище - здатність деяких низькомолекулярних інтеркалюючих лігандів спричиняти утворення дволанцюгових ділянок в складі одноланцюгових полірибонуклеотидів при їх взаємодії. Відомо, що структура одноланцюгових гетеро-полінуклеотидів, які знаходяться в розчині, зазнає динамічних змін у вигляді утворення і розпаду великої кількості ділянок з частковою комплемен-тарністю. За даних умов тилорон, інтеркалюючи між парами основ двоспі-ральних ділянок, що тільки-но утворилися, зсуває динамічну рівновагу системи саме в бік накопичення вказаних двоспіральних фрагментів, висту-паючи в ролі своєрідного “закріплювача” такої структури.

Молекулярне моделювання структури фрагментів дволанцюгового полірибонуклеотиду в А-конформації, що складався з двох Уотсон-Криківських пар нуклеотидів, між яких була прошарована молекула тилорону (Рис.3), дало незалежний доказ комплексоутворення тилорону з длРНК саме шляхом інтеркаляції. При цьому в моделях зафіксоване розташування аліфа-тичних бічних ланцюгів, які приєднані до флюоренонового кільця тилорону, в районі великої боріздки дуплексів. Цей факт не виключає можливості реалізації в даному випадку процесу “бічної” інтеркаляції, існування якого припускається для взаємодії тилорону з ДНК (Hiscott et al., 1989). До того ж отримані в цих експериментах дані підтверджують і причетність процесу комплексоутворення до появи в розчині “сітчастої” третинної структури полімеру длРНК, що сприяє, як вважається, підвищенню його інтерфероногенної активності.

Оскільки наявність дволанцюгової структури є головною умовою здатності РНК до індукції ІФН, далі проводили оцінку індукторної активності препаратів комплексів дріжджової РНК з тилороном (МК) в умовах in vitro на моделях клітинних культур різного походження, та in vivo в організмі мишей. Встановлено, що в обох випадках МК, порівняно зі стан-дартними індукторами полірибонуклеотидної природи, виявляв підвищену інтерфероногенну дію (Табл. 3 і 4).

Таблиця 3

Продукція ІФН культурою клітин L₉₂₉ під дією МК, його компонентів та стандартних індукторів*

Індуктор, що вносили	Доза (мкг/106 кл)	Титр ІФН (М log2)	Квадратичне відхилення log2	t	Р
Контроль	0	0,03	0,014
МК**	25,0	6,67	0,205	78,860	< 0,001
Ларифан Ридостин	50,0 50,0	4,67 5,02	0,210 0,190	53,953 63,974	< 0,001 < 0,001
Poly(I)-poly(C)	50,0	6,69	0,194	68,660	< 0,001
Тилорон***	2,2	0,04	0,019	1,018	> 0,05
РНК дріжджова***	22,3	2,01	0,570	41,358	< 0,001

Примітка: *Титри ІФН визначали через 24 години після введення індуктора; n = 6;

** Співвідношення тилорон / РНК (фосфат) - 1/10;

*** Доза відповідає такій в складі МК.

Максимум продукції ІФН у випадку моделі in vitro припадає на 6 годину після контакту МК з клітинами, після чого досягнутий рівень підтримується протягом 24 годин. В сироватці крові мишей максимальний рівень ІФН спостерігався на першу добу після введения МК; досягнутий рівень підтримувався практично до 5 діб, повертаючись до вихідного тільки на 7 добу. При використанні обох моделей оптимальним для інтерфероногенезу cпіввідношенням компонентів МК виявилось 1/10 (тилорон/РНК фосфат) (M/M). Також встановлено, що ІФН, який індукується у відповідь на дію МК, за своєю кислото- і термостабільністю відноситься до ІФН 1 типу (ІФН-).

Характерно, що, як in vitro, так і in vivo, компоненти МК самі по собі індукторних властивостей були практично позбавлені. В випадку in vivo спостерігався синергідний ефект компонентів, що можна пояснити здатністю самих по собі тилорону і дріжджової РНК в дослідних концентраціях індукувати певну кількість ІФН в організмі тварин. Щодо такої дії дріжджової РНК, то вона може бути зумовлена невеликою кількістю дволанцюгових фрагментів, які присутні в препараті у вихідному стані. Стосовно тилорону, то в умовах in vitro сам по собі індукторної дії він був повністю позбавлений, про що свідчать і дані літератури. Для пояснення цього факту, виходячи з відміченого вище характерного комплексоутворення тилорону з РНК, можна припустити, що в організмі відбувається взаємодія цієї речовини з малими молекулами РНК, які, як показано, знаходяться в позаклітинному просторі і практично відсутні в культурах клітин (Смирнов, 1988). При взаємодії таких молекул з тилороном поза межами клітин можуть утворюватися стабільні дволанцюгові фрагменти, які обумовлюють інтерфероногенну дію. Таким чином індукторний ефект в умовах in vivo спричиняє не сам тилорон, а його комплекс з РНК. Вказана ситуація - стабілізація дволанцюгових фрагментів позаклітинних РНК при їх взаємодії з індук-торами з наступною дією таких фрагментів, як інтерфероногенів, відбувається, напевне, в тій чи іншій мірі, в усіх випадках індукторного ефекту сполук-інтеркаляторів.

Таблиця 4

Титри ІФН в сироватках крові мишей після введення МК, його компонентів та стандартних iндукторів*

Індуктор, що вводили	Доза (мг\кг ваги тварин)	Титр ІФН (Мlog2)	Квадратичне відхилення log2	t	Р
Контроль	0	0,12	0,076
МК**	1,45	6,65	0,521	30,372	0,001
Ларифан Ридостин	1,00 1,00	4,54 6,12	0,187 0.053	53,780 157,895	0,001 0,001
Poly(I)-poly(C)	0,66	5,65	0,248	52,343	0,001
Тилорон*** Тилорон****	50,00 0,13	4,32 1,32	0,406 0,030	24,852 36,364	0,001 0,001
РНК дріжджова****	1,33	0,15	0,070	0,714	0,05

Примітка: * Введення індукторів внутрішньом'язеве; титри ІФН визна-чали через 24 години після введення індуктора; n = 6;

** Співвідношення тилорон/РНК (фосфат) - 1/10;

*** Доза відповідає рекомендованій для отримання індукторного ефекту:

**** Доза відповідає такій в складі МК

Згідно загальноприйнятим вимогам до характеристики інтерфероногенів, як і біологічно активних сполук взагалі, визначали рівень токсичності МК в умовах in vitro на моделях чотирьох культур клітин. Виходячи з отриманих даних щодо визначення життєздатності клітин, були розраховані головні параметри токсичності МК, а саме: МВК - максимально витривана концентрація і ТЦД₅₀ - тканинна цитотоксична доза (Табл. 5).

молекулярний цитотоксичность синтез днк

Таблиця 5

Параметри токсичності МК та відомих інтерфероногенів для різних культур клітин

Препарат,	Тип клітин
концентрація, (мкг/106	L929	СНЕВ	ПТП	МНК крові людини
клітин)	МВК	ТЦД50	МВК	ТЦД50	МВК	ТЦД50	МВК	ТЦД50
МК	500	1017,4	250	598,8	250	621,2	500	964,6
тилорон	30	75,0	25	50,0	25	50,0	30	75,0
poly(I)-poly(C)	600	1250,5	350	826,3	400	911,7	500	1055,6
ларифан	400	805,4	250	450,3	250	492,5	400	766,2
ридостін	400	810,0	250	462,2	250	454,8	450	720,0

Виявилося, що у всіх досліджених культурах клітин згадані параметри для МК за порядками величин корелюють зі значеннями, отриманими для інтерфероногенів полінуклеотидної природи, а визначені за допомогою цих параметрів величини ІЕІ - індексу ефективності інтерфероногенезу МК (який для даного випадку відповідає відомому показникові - хіміотерапевтичному індексу ХТІ) для всіх культур клітин значно перевищували величину 8, в той час як препарати з таким значенням ХТІ вважаються перспективними для клінічного впровадження. Останнє, а також досить широкий спектр клітинних культур, в яких МК виявляв інтерфероногенну дію і відносна пролонгованість синтезу ІФН, яка спостерігалась в дослідах, дозволяє розглядати цей препарат як перспективний індуктор в разі застосування його в промисло-вому виробництві ІФН І типу для потреб медицини і ветеринарії. При цьому вважається, що в такій якості МК буде мати ряд переваг перед індукторами, які зараз застосовуються (віруси та синтетичні і природні длРНК), оскільки, на відміну від перших, використання МК не потребуватиме технологічних операцій по видаленню його з культурального середовища після завершення процесу інтерфероногенезу, а препарати другої групи МК очевидно перева-жають своєю порівняно низькою вартістю виготовлення при співставимих рівнях ІФН, що індукують дані інтерфероногени.

Рис.4. Вплив МК та стандартних індукторів полінуклеотидної природи на включення ³Н-тимідину (А), ³Н-уридину (Б) та ³Н-лейцину (В) в МНК

Дослідження рівнів синтезу ДНК, РНК та білка в клітинах під дією МК та інших індукторів полінуклеотидної природи, що визначали за включенням відповідно ³Н-тимiдину, ³Н-уридину та ³Н-лейцину в загальний пул МНК крові людини, не виявило суттєвих відмінностей в перебігу даних процесів у всіх проаналізованих випадках (Рис.4). Так МК пригнічує включення ³Н-тимідину в ДНК клітин на 13%, що за величиною в цілому відповідає інгібіції включення цього попередника в ДНК під впливом препарату poly(I)-poly(C) (14%), і дещо інтенсивніше, ніж у випадку дії ларифану та ридостину (обидва - на 9%). Включення ³Н-уридину в РНК загального пулу МНК під дією полінуклеотидних індукторів змінюється менш суттєво. Рoly(I)-poly(C) пригнічує даний процес лише на 5%, а ларифан та ридостин практично на нього не впливають. Не складає виключення і МК, інгібуючи синтез РНК на 1%.

На відміну від рівнів синтезу ДНК та РНК, рівні синтезу білка під дією індукторів змінюються в значно більшій мірі. Рoly(I)-poly(C) пригнічує включення ³Н-лейцину в загальний пул МНК на 62%, ларифан - на 57%, ридостин - на 56%, МК - на 40%, що може свідчити про схожість внутрішньоклітинних механізмів індукції ІФН під впливом МК та препаратів длРНК. Відмічене в цих дослідах зниження рівнів клітинного синтезу ДНК, РНК та білка під дією МК, в порівнянні з індукторами природного похо-дження - ридостином та ларифаном, може бути наслідком часткового вивільнення тилорону зі складу комплексу всередині клітин і його подальшого самостійного впливу на згадані процеси шляхом взаємодії з клітинними ДНК та РНК.

Пряма кількісна оцінка противірусної дії МК включала в себе визначення ступенів захисту клітин від цитопатичної дії вірусів і рівнів інгібіції їх розмноження під дією МК у порівнянні зі стандартними індукторами, і була проведена в умовах in vitro з використанням трьох систем вірус-клітина.

У всіх досліджених системах МК виявляв досить значний захисний ефект (Табл.6). За умов множинності інфікування клітин (10 ТЦД₅₀/0,1мл), яку ми використовували в інфікованих культурах клітин (контроль вірусу), вже на 24 годину спостереження реєструвалась загибель від 32,3% (система ПТП / ВВЕК) до 32,9% (система ПТП / ВЕМК) клітин порівняно з контрольними неінфікованими культурами. В той же час, при одночасному з зараженням клітин вірусами внесенні в поживне середовище МК, спостерігалося помітне підсилення життєздатності інфікованих клітин. Так, вже в дозі 2,5 мкг/мл МК достовірно збільшував життєздатність клітин в системах ПТП / ВЕМК та СНЕВ / ВХН (в системі ПТП / ВВЕК різниця недостовірна, Р 0,05). Підвищення концентрації МК до 100 мкг/мл викликало більш значне (на 23 - 30% по відношенню до контроля вірусу) збільшення життєздатності клітин, після чого подальше підвищення дози препарату призводило до деякого зниження їх життєздатності.

Більш показовий вплив МК на життєздатність інфікованих клітин виявлявся на 48 год спостереження. Так, при загибелі клітин на рівні 61,6 - 62%, що спостерігалась у контролі, МК в найбільш дієвій концентрації (100 мкг/мл) у випадках всіх систем вірус-клітина знижував цей показник до 22,3 - 22,9 %.

Використовуючи отримані дані щодо рівнів захисної дії та токсичності МК в порівнянні з стандартними індукторами ІФН, визначали хіміотерапев-тичні індекси (ХТІ) вказаних сполук. Значення ХТІ, що були визначені в даний спосіб, склали 10, 35, 16 і 18 для МК, poly(I)-poly(C), ларифану та ридостину відповідно. Виявлено, що МК має найменше значення ХТІ, порівняно зі всіма дослідженими інтерфероногенами цього типу. Разом з тим значення ХТІ МК перевищувало граничну межу значень даного параметру - 8 (Вотяков с соавт., 1986), що дозволяє розглядати МК, як перспективний противірусний препарат.

Вивчення впливу МК безпосередньо на репродукцію вірусів в культурах клітин, в порівнянні зі стандартними індукторами ІФН рибополінуклеотидної природи, проводили, визначаючи інфекційний титр вірусів. У випадку профілактичної схеми застосування (внесення МК в клітинні культури за 6 год перед інфікуванням) даний препарат значно пригнічував репродукцію вірусів в клітинних моделях, що досліджувалися, знижуючи інфекційні титри вірусів на величини в диапазоні від 1,94 lg ТЦД₅₀ (система ПТП / ВЕМК) до 2,01 lg ТЦД₅₀ (система ПТП / ВВЕК), подібно до полінуклеотидних інтерфероногенів природного походження - ларифану та ридостину (зниження титрів від 1,93 lg ТЦД₅₀ в системі ПТП / ВЕМК до 2,04 lg ТЦД₅₀ в системі СНЕВ / ВХН). Зниження врожаю вірусу, що спостерігалось при дії МК, було в межах 68 - 70 відсотків, аналогічно вказаним інтерфероногенам. При цьому достовірних розбіжностей в дії всіх вказаних сполук, в залежності від природи модельних систем, не спостерігалось. В описаних умовах найбільшу вірусінгібуючу активність виявляв poly(I)-poly(C) (зниження титрів вірусу від 1,99 lg ТЦД₅₀ в системі ПТП / ВЕМК до 2,22 lg ТЦД₅₀ в системі СНЕВ / ВХН, зниження врожаю вірусу - 71 та 76% відповідно).

В усіх дослідах сумарний противірусний ефект окремих складових МК виявився значно меншим, ніж противірусний ефект, притаманний комплексному препаратові. Зниження інфекційного титру вірусів під дією тилорону складало від 0,31 lg ТЦД₅₀ (система СНЕВ / ВХН) до 0,86 lg ТЦД₅₀ (система ПТП / ВЕМК) (зниження врожаю вірусу - 10,6% та 30,6% відповідно), в той час як додавання дріжджової РНК на величини титрів практично не впли-вало.

При внесенні стандартних індукторів ІФН в клітинні культури через 40 хв після їх інфікування вірусами (терапевтична дія) також спостерігалося пригнічення вірусної репродукції, хоча і з дещо меншою, в порівнянні з профілактичним застосуванням, ефективністю. Так, зниження інфекційних титрів вірусів під дією ларифану і ридостину склало від 1,68 до 1,76 lg ТЦД₅₀, (зниження врожаю вірусу - 60 %), що в середньому на 10 % менше аналогічного ефекту, який спостерігався в попередньому випадку. Серед всіх стандартних індукторів найбільш ефективним виявився poly(I)-poly(C), знижуючи титр вірусів на 1,71 - 1,95 lg ТЦД₅₀ (зниження врожаю вірусу на 60 - 66%). На цьому фоні досить суттєвим ми вважали значне (від 2,17 до 2,22 lg ТЦД₅₀) зниження титру вірусів у всіх системах, що досліджувалися, під дією МК. Зниження врожаю вірусу в цьому випадку на 9 - 17% переви-щує даний ефект під дією poly(I)-poly(C), і на 16 - 18% - ларифану і ридостину. По відношенню до дії МК за профілактичною схемою викори-стання, противірусний ефект терапевтичної дії цього препарату, виражений в показниках зниження врожаю вірусу, зростає на 6 - 8 %. В порівнянні з профілактичною дією, вірусінгібуючий ефект тилорону, що вносили окремо, також підвищується (збільшення показника зниження врожаю вірусу від 7% для системи ПТП / ВЕМК до 25% для системи СНЕВ / ВХН).

Підвищена вірусінгібуюча дія МК у випадку терапевтичного застосу-вання може пояснюватися двома обставинами. Так, в цьому разі, поряд з інгібіцією репродукції вірусів, яка опосередкована ІФН-індукованими противірусними білками, може реалізуватися і пряма противірусна дія індукторів в інфікованих клітинах - процес, достатньо висвітлений в літературі як для полінуклеотидів (DeClercq,1974), так і для тилорону (Chandra et al., 1972).

При оцінці дії потенційних противірусних препаратів прийнято вважати, що зниження інфекційного титру вірусу таким препаратом по відношенню до контролю не менш, ніж на 1,78 lg, свідчить про його перспективність для клінічного випробування (Вотяков с соавт., 1986). За цим показником МК, повністю відповідаючи даній вимозі, може розгля-датися як потенційний противірусний препарат з переважно терапевтичною дією.

Окремо проводили дослідження щодо здатності МК пригнічувати репродукцію ВІЛ в культурах клітин на моделях гострої і хронічної ВІЛ-інфекції. В обох випадках було встановлено, що під дією МК суттєво підвищується життєздатність клітин, які інфіковані ВІЛ. Так, у випадку моделі гострої інфекції (клітини МТ-4, інфіковані ВІЛ-І/BRU) найбільшу захисну дію на 4 добу спостереження МК справляє в концентрації 50 мкг/мл (захист клітин - 57%) і дещо меншу - в більш високих концентраціях. Вказана дія МК є більш суттєвою в порівнянні з стандартними індукторами ІФН полінуклеотидної природи. Так, в дозі 50 мкг/мл значення відсотка життєздатності інфікованих клітин під впливом МК на 4 добу спостереження переважає відповідні показники для ридостіну та ларифану на 7 - 9%, а на 8 добу - на 15 - 33%.

Вивчення впливу МК безпосередньо на репродукцію ВІЛ в даній клітинній моделі в цілому виявило закономірності, які простежені і при встановленні захисного ефекту. Найбільш дієва доза МК - 50 мкг/мл на 4 добу спостереження знижує врожай вірусу на 33%, що на 4 - 5% вище за відповідні показники для ридостину та ларифану.

При використанні моделі хронічної інфекції (клітини Н-9, інфікова-ні ВІЛ-І/ІІІВ) картина захисної дії МК та стандартних індукторів на 4 добу спостереження практично повторювала отриману для МТ-4/BRU, відрізняючись за величинами абсолютних значень життєздатності клітин в бік підвищення (в усіх випадках в середньому на 12%).

На фоні пропорційного зменшення абсолютних показників титрів вірусу в контрольних і дослідних зразках в даній моделі приблизно на 1,5 lg ТЦД₅₀, рівні репродукції ВІЛ під дією МК та стандартних індукторів виявились подібними до відповідних величин, встановлених у випадку гострої інфекції.

Важливо відмітити, що при використанні обох моделей інфекції показники захисної дії і інгібіції репродукції ВІЛ МК за порядками величин практично співпадали з такими для відомих полірибонуклеїнових препаратів - амплігену та poly(A)-poly(U), анти-ВІЛ дія яких в умовах in vitro експериментально доведена (Montefiori, Mitchell, 1987; Crust et al., 1992).

Рис. 5. Вплив МК на синцитієутворення, яке індукує ВІЛ-1/BRU в культурі клітин МТ-4

1 - контроль; 2 - МК (10 мкг/мл); 3 - МК (100 мкг/мл)

Дослідження інших характеристик вірусінгібуючої дії МК (рівнів пригнічення вірусіндукованого утворення синцитіїв і синтезу антигену р24 ВІЛ) підтвердило загальний висновок щодо досить суттєвої анти-ВІЛ активності МК. Як видно з Рис. 5, МК в концентраціях 10 та 100 мкг/мл помітно пригнічує вірусіндуковане утворення синцитіїв. До того ж строк появи синцитіїв в культурі МТ-4, інфікованій ВІЛ-1/BRU, пролонгується, що свідчить про збільшення латентного періоду протікання інфекційного процесу під дією цього препарату.

Рис. 6. Вплив МК на вміст р24 антигену ВІЛ-1/BRU в культуральному середовищі клітин МТ-4 (модель гострої інфекції).

Примітка: 5 доба спостереження.

Рис. 7. Вплив МК на вміст р24 антигену ВІЛ-1/ІІІВ в культуральному середовищі клітин Н-9 (модель хронічної інфекції).

Примітка: 20 доба спостереження.

Додавання МК в дозі 10 мкг/мл знижує синтез даного антигену більш ефективно, ніж доза 100 мкг/мл як при гострій, так і при хронічній інфекції (Рис. 6 і 7). При цьому інгібуючий вплив МК на даний параметр більш вира-жений у випадку моделі ВІЛ-1/ІІІВ (хронічна інфекція).

Вивчення часових характеристик анти-ВІЛ дії МК (Табл. 7.) дозво-лило встановити, що найбільшу анти-ВІЛ активність цей препарат виявляє при його внесенні за 1 год до інфікування клітин ВІЛ-1, а також одночасно з інфікуванням, що може свідчити про переважно інгібуючу дію МК на ранні стадії ВІЛ-інфекції.

Таблиця 7

Залежність анти- ВІЛ активності МК від строків внесення препарату^*

Строк внесення МК по відношенню до інфікування клітин ВІЛ-1	Ступінь захисту клітин (%)	Вміст р24 антигену (нг/мл)
За 3 дні до за 2 дні до за 1 день до за 1 год до одночасно з ВІЛ-1 через 1 год через 4 год через 2 дні через 5 днів без препарату (контроль)	5,7 1,2 15,4 3,2 30,5 7,1 62,5 6,2 60,3 3,8 45,1 7,3 40,3 5,6 10,4 3,3 3,2 0,8 0	125 110 84 32 45 68 95 124 145 168

Примітка: модель - клітини МТ4, інфіковані ВІЛ-I/BRU; результати отримані на 8 добу спостереження

При порівняльному дослідженні впливу МК та інших рибополінуклеотидів, яким притаманна анти-ВІЛ активність, а також азидотимідину (АЗТ), на етап проникнення ВІЛ-1 в клітину (Рис.8) виявилося, що і МК, і рибополінуклеотиди, на відміну від АЗТ(1,4%), викликали на цьому етапі суттєве (на 86,5-87,5%) зниження рівня вмісту р24 в клітинних лізатах. Це дає підставу вважати, що, як і у випадку інших поліаніонів (Crust et al., 1992), головну дію МК здійснює на етапі проникнення ВІЛ-1 в клітини. При цьому може здійснюватися безпосередня його взаємодія як з позитивно заряд-женими залишками CD4-рецепторів (Lederman et al., 1992), так і з певним доменом gp120 ВІЛ (Moore, Nara, 1991), що, вірогідно може лежати в основi прямої анти-ВІЛ дії МК. Вважається також, що відмічена раніш інтефероногенна дія МК та противірусний ефект, що здійснює мономолекулярний компонент МК - тилорон сам по собі, можуть, напевне, забезпечувати додатковий вплив на інгібіцію репродукції ВІЛ в організмі.

Рис. 8. Вплив МК та інших анти-ВІЛ агентів на етап проникнення ВІЛ-1/IIIB в клітини МТ-4

Примітка: 1 і 2 - інфікування клітин з наступною інкубацією при 4⁰С і37⁰С відповідно (без препаратів); 3, 4, 5 і 6 - додання азидотимідину (5 мкг/мл), МК, ларифану і poly(I)-poly(C) (по 10 мкг/мл) відповідно з наступною інкубацією при 37⁰С

Пряма оцінка анти-ВІЛ дії МК та стандартних індукторів ІФН полірибонуклеїнової природи в порівнянні з препаратами модифікованих нуклеозидів (АЗТ, Д4Т) різних виробників (Рис.9 і 10) дозволила встановити, що перші є менш ефективними в цьому відношенні. Серед індукторів найбільшу анти-ВІЛ дію виявляв МК, наближаючись за ефективністю до нуклеозидних препаратів. З огляду на це, а також на різницю в механізмах дії препаратів обох вказаних типів, ми вважаємо за доцільне подальше вивчення можливо-сті поєднаного застосування препаратів модифікованих нуклеозидів разом з індукторами ІФН, і, зокрема, МК, для підсилення загального терапевтичного ефекту. Останнє співпадає з тенденцією створення комплексних схем засто-сування препаратів з різним механізмом дії, що переважає в сучасній терапії СНІДу.

Зважаючи на те, що всім індукторам ІФН притаманні в тій чи іншій мірі імуномодулюючі властивості, і що з цього правила не складають виключення компоненти МК - дріжджова РНК і тилорон, було досліджено вплив МК на рівні сумарної проліферативної відповіді лімфоїдних клітин миші в нормі та при мітогенному стимулюванні. Виявилося, що у всіх досліджених дозах МК спричиняє досить незначний спонтанний проліфера-тивний ефект (підвищення величин індексу стимуляції на 0,27 - 0,63 ум.од.).

Рис. 9. Вплив препаратів модифікованих нуклеозидів на вміст р24 антигену в культуральному середовищі клітин МТ-4, інфікованих референтним штамом ВІЛ-1/IIIB (А) та клінічними ізолятами ВІЛ-1/11 (Б) і ВІЛ-1/27 (В) відповідно.

Рис. 10. Вплив препаратів - індукторів ІФН полірибонуклеїнової природи на вміст р24 антигену в культуральному середовищі клітин МТ-4, інфікованих референтним штамом ВІЛ-1/IIIB (А) та клінічними ізолятами ВІЛ-1/ 11 (Б) і ВІЛ-1/27 (В) відповідно.

В умовах стимулювання клітин мітогенами (ФГА, КонА та ЛПС) була відмічена супресивна дія МК, що проявлялося в максимальному (на 46%) зниженні величин індексу стимуляції на третю добу спостереження. Оскільки, як встановлено, препарати РНК діють головним чином на функцію системи Т- лімфоцитів, отримані дані можно пояснити здатністю МК активувати певний пул Т-супресорних клітин. Вони, в свою чергу, виділяють фактори, за допомогою яких пригнічується активація В-лімфоцитів. Таким чином, МК, підвищуючи загальну імунологічну реактивність організму, виявляє імунокоригуючі властивості.

Підсумовуючи всі наведені вище дані відносно біологічних особливо-стей МК, слід зазначити, що його головною рисою є здатність до індукції ІФН, з якої витікають і інші притаманні йому властивості.

Для пояснення загального механізму, що лежить в основі індукції ІФН І типу, на основі літературних даних та власних досліджень була сформульо-вана гіпотеза, згідно якої суттєвий внесок в формування сигналу до індукції ІФН привносить специфічна деформація певної частини поверхні клітинної мембрани (Рис. 11).

Рис. 11. Узагальнена схема головних етапів запропонованого універсального механізму індукції ІФН І типу

Така деформація, в свою чергу, викликається самим актом первинного зв'язування індуктору - вірусу чи полірибонуклеотиду - з специфічними клітинними рецепторами, вбудованими в мембрану. В останньому випадку індукція обумовлена конформаційними змінами даних полімерів, що зв'язані з рецепторами, в примембранному iонному шарі клітин; ці зміни далі викликають вказану локальну деформацію клітинної мембрани. В разі вірусів подібна деформація виникає на стадії їх проникнення в клітину. Індуктори /-ІФН інтеркаляторної природи, як припускається гіпотезою, викликають інтерфероногенез in vivo шляхом комплексоутворення з екзогенними молекулами РНК, стабілізуючи їх дволанцюгові ділянки з частковою комплементарністю. Гіпотезою передбачається також, що, як і в багатьох описаних випадках генної регуляції, в наступній за деформацією мембрани активацією експресії генів - і - ІФН, роль передаючого сигналу здійснюють “вторинні месенджери” і, головним чином, циклічний аденозин-3',5'-монофосфат (цАМФ).

ВИСНОВКИ

1. Вперше показано, що при комплексоутворенні ряду низькомо-лекулярних лігандів з одноланцюговою РНК, в складі структури останньої утворюються дволанцюгові фрагменти, що підтверджено спектральними характеристиками отриманих комплексів в УФ- та видимому діапазонах світла. Простежена залежність ефекту утворення дволанцюгових ділянок в складі одноланцюгової РНК від структури низькомолекулярного ліганду.

2. Проведено дослідження плавлення молекулярного комплексу одноланцюгова РНК - тилорон. Визначені параметри теплової денатурації комплексу. Показано, що процес комплексоутворення приводить до стабілізації дволанцюгових ділянок в складі нуклеїнового компоненту комплексу.

3. Встановлені кількісні характеристики комплексоутворення тилорону з одно- та дволанцюговими полінуклеотидами. Показана термодинамічна перевага зв'язування тилорону з дволанцюговими полінуклеотидними структурами. Визначена доля дволанцюгових ділянок, що утворюються в структурі одноланцюгової РНК при взаємодії з тилороном.

4. На основі комп'ютерного моделювання інтеркаляції тилорону між комплементарними парами азотистих основ дуплексів дволанцюгової РНК виявлені стеричні особливості розташування хромофору і аліфатичних бічних ланцюгів тилорону в модельних комплексах.

5. Вперше встановлена інтерфероногенна дія препарату комплексу дріжджова РНК - тилорон в культурах клітин і організмі дослідних тварин. Показано, що титри інтерферону, який індукується за допомогою комплексів, в обох випадках відповідають таким для природних і синте-тичних індукторів рибополінуклеотидної природи, а сам він належить до інтерферонів І типу (ІФН-/). Визначені кінетичні та дозові залежності інтерфероногенезу під дією комплексу в умовах in vivo та in vitro.

6. Проведена оцінка токсичності препарату комплексу дріжджова РНК - тилорон на ряді культур клітин; досліджений його вплив на синтез ДНК, РНК та білка клітинами. Встановлено, що величина індексу ефективності інтерфероногенезу комплексу, визначеного на підставі цих дослідів, дозволяє віднести його до клінічно перспективних інтерфероногенів.

7. На ряді експериментальних моделей вірус-клітина, включаючи ВІЛ-інфекцію, показано, що препарат комплексу дріжджова РНК - тилорон виявляє противірусну дію на рівні стандартних індукторів інтерферону полірибонуклеотидної природи. Виявлені значення хіміотерапевтичного індексу препарату дають змогу розглядати його, як перспективний противірусний агент широкого спектру дії.

8. Показано, що препарату комплексу дріжджова РНК - тилорон притаманна імуномодулююча дія. Встановлено, що в той час як сам по собі комплекс незначним чином підвищує рівень сумарної проліферативної відповіді лімфоїдних клітин, при додатковій стимуляції проліферації за допомогою мітогенів він виявляє супресивний ефект; це дозволяє в цілому характеризувати вплив комплексу на організм, як імунокоригуючий.