Iммобілізація ліполітичних і протеолітичних ферментів та сульфамідних лікарських препаратів на полімерних носіях
Вивчення співполімеризації синтезованих біологічно активних сульфамідних мономерів i терполімерів. Синтез фермент-полімерних комплексів на основі ліполактину. Створення лікарських препаратів поліфункціональної дії. Утворення тривимірної просторової сітки.
| Рубрика | Химия |
| Вид | автореферат |
| Язык | украинский |
| Дата добавления | 12.02.2014 |
| Размер файла | 37,8 K |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://allbest.ru
2
Національний університет “Львівська Політехніка”
УДК 541.64:577.156
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата хімічних наук
Іммобілізація ліполітичних і протеолітичних ферментів та сульфамідних лікарських препаратів на полімерних носіях
02.00.06. - хімія високомолекулярних сполук
Краюткіна Олена Миколаївна
Львів - 2000
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана у Національному університеті “Львівська політехніка” Міністерства освіти і науки України.
Науковий керівник:доктор хімічних наук, професор ЧУЙКО Леонід Сидорович, Національний університет “Львівська політехніка”, професор кафедри технології біологічно активних сполук, фармації та біотехнології
Офіційні опоненти:доктор хімічних наук, професор СОЛТИС Михайло Миколайович, Львівський національний університет ім. Івана Франка, професор кафедри фізичної і колоїдної хімії
доктор хімічних наук, професор ТУРОВСЬКИЙ Анатолій Антонович, Відділення фізико-хімії і технології горючих копалин Інституту фізичної хімії ім. Л.В. Писаржевського, завідувач відділу
Провідна установа:Київський національний університет ім. Тараса Шевченка Міністерства освіти і науки України, кафедра хімії високомолекулярних сполук, м. Київ.
Захист відбудеться “ 20 ” грудня 2000 р. о 15 00 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 35.052.01 у Національному університеті “Львівська політехніка” за адресою: 79013, Львів-13, пл. Св.Юра, ѕ, ауд.240.
З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Національного університету “Львівська політехніка” (Львів-13, вул. Професорська,1).
Автореферат розісланий “ 17 ” листопада 2000 р.
Вчений секретар спеціалізованої
вченої ради Д 35.052.01
кандидат хімічних наук, доцентСкорохода В.Й.
Загальна ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність роботи. Ферменти, як специфічні каталізатори біохімічних і хімічних процесів, широко використовуються в харчовій та легкій промисловості, в біотехнології, медицині та інших галузях. Однак використання нативних ферментів як біокаталізаторів має певні обмеження, обумовлені їх властивостями. В цьому плані іммобілізація ферментів дозволяє реально усунути ці недоліки, а саме забезпечити високу стійкість та інші їх корисні властивості, що мають виняткове значення при практичному використанні ферментів, переважно в промисловому виробництві. З відомих методів іммобілізації, найбільш перспективним є хімічна модифікація (ковалентна іммобілізація) ферментів на полімерних носіях.
В цьому плані особливого інтересу заслуговує хімічна модифікація ліполітичних та протеолітичних ферментів, а саме ферментного препарату ліпази “ліполактину” (ЛП) і протеолітичного ферменту протеази “С” (Пр“С”) на полімерних носіях. Як відомо, ліполактин використовується в технологічних процесах ферментативного гідролізу відходів олієжирової промисловості з метою одержання жирних кислот та гліцерину, а протеаза “С” знаходить застосування як лікарський засіб для лікування опікових ран.
З іншого боку досить перспективним є процес одержання біологічно активних полімерів медичного призначення шляхом співіммобілізації протеолітичних ферментів та антимікробних речовин із метою створення лікарських препаратів поліфункціональної дії. При цьому такі лікарські препарати набувають особливих властивостей, які пов'язані з їх полімерною природою, а саме збільшується термін дії препарату (пролонгація), зменшується токсичність тощо.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана у відповідності з державними науково-технічними програмами “Нові хімічні речовини і матеріали малотоннажного виробництва для заміни імпортованих” (проект № 2.11), “Нові екологічно безпечні лікувальні засоби” (проект № 03.06.01/001-95, 03.07/02441).
Мета і задачі досліджень. Метою дисертаційної роботи є ковалентна іммобілізація ліполітичних і протеолітичних ферментів та сульфамідних лікарських препаратів на полімерних носіях; синтез і вивчення біологічно активних полімерних носіїв та фермент-полімерних комплексів (ФПК), а також пошук шляхів використання синтезованих біологічно активних полімерів як ефективних каталізаторів та лікарських препаратів.
Для досягнення поставленої мети необхідним було:
синтезувати біологічно активні сульфамідні мономери (СМ) і визначити константи їх співполімеризації з вінільними мономерами та склади бінарних і трикомпонентних співполімерів, а також створити на їх основі полімерні носії з біологічно активними сульфамідними групами для іммобілізації ферментів;
вивчити іммобілізацію протеази “С” на синтезованих сульфамідних полімерних носіях;
розробити методи сумісної іммобілізації протеази “С” з антимікробними речовинами на синтезованих полімерних носіях та співполімері стиролу з малеїновим ангідридом - стиромалі (СМА);
показати можливість використання одержаних співіммобілізованих систем як полімерних лікарських препаратів комбінованої дії;
дослідити процес хімічної модифікації СМА ліполактином і синтезувати ФПК з прищепленими фрагментами ЛП та вивчити їх властивості;
вивчити кінетику одночасного структурування та іммобілізації трикомпонентної системи: СМА - ЛП - м-фенілендіамін (м-ФДА) і структуру тривимірної просторової сітки, яка при цьому утворюється;
вивчити синтезовані ФПК на основі ліполактину як каталізатори процесів тотального гідролізу жирів.
Об'єкт дослідження - одержання біологічно активних полімерів з фрагментами протеолітичних і ліполітичних ферментів та сульфамідних лікарських препаратів.
Предмет дослідження - ковалентна іммобілізація протеолітичних і ліполітичних ферментів та сульфамідних лікарських препаратів на синтезованих біологічно активних полімерних носіях і стиромалі.
Методи дослідження. Синтез полімерів проводили шляхом радикальної співполімеризації та реакціями полімераналогічних перетворень, кінетику співполімеризації досліджували дилатометричним методом, склад співполімерів визначали елементним аналізом, властивості модифікованих співполімерів вивчали диференційно-термічним і термогравіметричним методами; структуру мономерів та полімерів підтверджували ІЧ спектроскопією, кінетику структурування ФПК вивчали методом рівноважного набухання, ферментативні активності та масову долю білка розчинних ферментів і синтезованих ФПК визначали спектрофотометричними та потенціометричними методами.
Наукова новизна одержаних результатів. Вивчена співполімеризація синтезованих біологічно активних СМ з вінільними мономерами в бінарних та трикомпонентних системах. Вперше визначені константи співполімеризації СМ (r1 та r2) із стиролом (С) і малеїновим ангідридом (МА) та склади бінарних співполімерів і терполімерів. На основі таких бінарних та трикомпонентних систем вперше синтезовані полімерні носії, які мають у своїй структурі біологічно активні сульфамідні групи, а також високореакційноздатні ангідридні групи, за рахунок яких відбувається ковалентна іммобілізація ферментів.
Вперше розроблені методи співіммобілізації Пр“С” з антимікробними речовинами (норсульфазолом (НС) та стрептоцидом (СЦ)) на синтезованих біологічно активних полімерних носіях та стиромалі, в результаті чого синтезовані полімерні лікарські препарати поліфункціональної дії. Вивчено основні закономірності процесу іммобілізації цих систем та визначені оптимальні умови його проведення.
Вперше досліджено процес ковалентної іммобілізації ліполактину на СМА та синтезовані ФПК, які містять у бічних ланцюгах макромолекул носія хімічно пов'язаний фермент. Вивчено властивості ФПК порівняно з нативним ЛП і показано, що вони є більш стабільними, а температурний оптимум дії ФПК є розширеним та зміщеним в область більш високих температур.
досліджено процес одночасного структурування та іммобілізації трикомпонентної системи: СМА - ЛП - м-ФДА. Показано, що в даній системі перебігають одночасно дві конкуруючі реакції ацилювання з ковалентним прищепленням ферменту до полімерної матриці й утворенням поперечних зв'язків між макромолекулами СМА в результаті зшивання їх структуруючим агентом - м-ФДА. Вивчено кінетику зшивання та структуру тривимірної просторової сітки, і показано, що процес структурування залежить виключно від концентрації м-фенілендіаміну і не залежить від концентрації ліполактину. Показано, що синтезовані ФКП є каталізаторами процесів гідролізу жирів.
Практична цінність роботи. На основі співіммобілізації систем: терполімер (С - МА - СМ-ІІІ) - протеаза “С” та стиромаль - норсульфазол - протеаза “С” створені ФПК із комбінованою дією, які можуть бути використані як біологічно активні полімери медичного призначення, в першу чергу для лікування опікових ран.
В результаті проведених досліджень одержані структуровані м-фенілендіаміном ФПК на основі ліполактину, ковалентно іммобілізованого із СМА. Такі каталізатори мають поліпшену механічну міцність, стабільність та активність і можуть бути використані в процесах тотального гідролізу рослинних олій з метою одержання жирних кислот та гліцерину за безвідходною технологією, що підвищить екологічну чистоту виробництва.
Особистий внесок дисертанта полягає в безпосередній участі в постановці задачі, самостійному виконанні експериментальних досліджень та обробці даних експерименту, формулюванні основних положень і висновків дисертаційної роботи. Автором зроблений основний внесок у розробку наукових результатів, що виносяться на захист.
Апробація роботи. Основні результати роботи доповідались й обговорювались на шостій науковій конференції “Львівські хемічні читання - 97” (Львів, 1997), на першій міжнародній конференції видавництва “Наука і освіта-98” (Дніпропетровськ, 1998), на другій науково-технічній конференції - “Поступ в нафтогазопереробній та нафтохімічній промисловості” (Львів, 1999) та щорічних науково-технічних конференціях ДУ “Львівська політехніка” у 1996-1999 рр.
Публікації. За темою дисертаційної роботи опубліковано 5 статей і 3 тез доповідей.
Структура та об'єм роботи. Дисертаційна робота складається з вступу, чотирьох розділів, висновків, списку використаних джерел. Список літератури містить 185 найменувань.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
У першому розділі дисертаційної роботи проведено аналіз літературних даних з питань ковалентної іммобілізації протеолітичних та ліполітичних ферментів на полімерних носіях різної природи через утворення амідного та азідного зв'язків, а також з використанням реакцій ацилюваня, алкілування, біфункціональних реагентів тощо. Розглянуто особливості синтезу полімерних носіїв для ковалентної іммобілізацї шляхом співполімеризації відповідних мономерів з реакційноздатними групами чи з наступним введенням реакційноздатних груп у попередньо одержаний полімер реакціями полімераналогічних перетворень. Описано закономірності одержання полімерних носіїв на основі похідних стиролу, акрилової кислоти, поліамідів, полівінілового спирту тощо. Показана перспективність одержання біологічно активних сульфамідних полімерів.
Обгрунтовані шляхи використання іммобілізованих систем в біотехнології, медицині, харчовій та легкій промисловостях.
У другому розділі розглянуті об'єкти і методи досліджень. Об'єктами досліджень були вибрані як вихідні речовини: протеолітичний фермент протеаза “С” з ММ=40-50тис. та протеолітичною активністю (ПА) 80тис. од/г; ферментний препарат ліпази “ліполактин” з ММ=30-50 тис. та ліполітичною активністю (ЛА) 1600 од/г; антимікробні препарати - норсульфазол та стрептоцид, загальної формули H2N-C6H4-SO2-NHХ, де Х=Н або N ; полімерний носій - стиромаль загальної формули з кислотним числом КЧ=524 КОН/г співполімеру та ММ=100-110 тис.; структуруючий агент - м-фенілендіамін: ацилюючі агенти - малеїновий ангідрид та метакрилоїлхлорид (МАХ); мономери - стирол та малеїновий ангідрид; ініціатор - динітрил азо-біс-ізомасляної кислоти (ДАК); а також синтезовані біологічно активні сульфамідні мономери акрилатного та малеїнатного типів на основі НС та СЦ за методиками, розробленими на кафедрі технології біологічно активних сполук фармації та біотехнології НУ “Львівська політехніка”.
Дослідження кінетики полі- та співполімеризиції проводили дилатометричним методом. Cклад бінарних та трикомпонентних співполімерів визначали елементним аналізом за вмістом сірки та азоту. ІЧ спектроскопічні дослідження проводили на “Specord-80M”. Кінетику зшивання вивчали за рівноважним ступенем набухання (Qрсн), визначення якого проводили ваговим методом при температурі 20°С, після витримки взірців полімеру протягом 48 год в диметилформаміді (ДМФА). Характеристичну в'язкість синтезованих співполімерів визначали за допомогою віскозиметра Убелоде в бензолі при температурі 25°С. Диференційно-термічні та термогравіметричні дослідження властивостей модифікованих співполімерів проводили з використанням приладу “Derivatograph Q-1500”. У роботі також використовувались спектрофотометричні та потенціометричні методи дослідження.
Наведені методики визначення основних властивостей розчинних ферментів та синтезованих ФПК, глибини гідролізу рослинних олій розчинним та іммобілізованим ліполактином, а також модифікації полімерних носіїв ферментними та лікарськими препаратами.
У кінці розділу приведені описи методик визначення ферментативних активностей (протеолітичної і ліполітичної) та масової долі білка за Лоурі.
У третьому розділі наведені результати досліджень з питань встановлення кінетичних закономірностей синтезу біологічно активних полімерних носіїв для іммобілізації ферментів та вивчення їх властивостей. Синтез біологічно активних полімерних носіїв проводили співполімеризацією синтезованих СМ з вінільними мономерами. Сульфамідні мономери одержували взаємодією НС та СЦ з ацилюючими агентами різної природи та активності МАХ та МА. Синтезовані СМ малеїнатного (СМ-І, СМ-ІV) та акрилатного (СМ-ІІ, СМ-ІІІ) типів є біфункціональними сполуками, тобто вони мають у своїй структурі одночасно подвійні зв'язки, за рахунок яких вони можуть вступати в реакції полі- та співполімеризації, та сульфамідні групи, що надають таким сполукам біологічної активності. Вивчення полімеризації СМ-І та СМ-ІІ показало, що радикальна гомополімеризація СМ-І, на відміну від СМ-ІІ, не протікає, очевидно, за рахунок впливу стеричного фактора, що є характерним для 1,2-заміщених малеїнатів.
В подальшому була вивчена кінетика бінарної співполімеризації модельної системи С?СМ-ІІ. Процес проводили в ДМФА при 70°С в присутності ДАК (0,5 мас.%) в атмосфері аргону. Конверсію системи (S,%) визначали дилатометричним методом. Показано, що швидкість співполімеризації дещо зростає із збільшенням концентрації СМ-ІІ, досягаючи максимуму при 5%-ному вмісті СМ-ІІ. При вищих концентраціях спостерігається деяке зменшення швидкості реакції. Неоднозначний вплив концентрації (СМ-ІІ) на швидкість процесу, ймовірно пов'язаний із можливістю участі тіазольного циклу мономера в реакціях передачі ланцюга. Швидкість співполімеризації бінарних систем С?СМ суттєво залежить від природи подвійних зв'язків і природи сульфамідних фрагментів в мономері. Так, мономери акрилатного типу співполімеризуються значно з більшою швидкістю, ніж малеїнатного типу. Це пов'язано з різною активністю спряженої системи кратних зв'язків.
Концентрація та характер розподілу сульфамідних груп в співполімерах буде визначати в певній мірі їх біологічну активність. Така інформація може бути одержана тільки при наявності констант співполімеризації СМ з вінільними мономерами. Тому була досліджена кінетика співполімеризації СМ з вінільними мономерами і визначені константи співполімеризації та склади бінарних систем. Показано, що відносна активність СМ до співполімеризації суттєво залежить від природи співмономерів. Так в обох бінарних системах С?СМ-ІІ (1) та С?СМ-ІІІ (2), r1<1 і r2<1. Виходячи з добутку констант співполімеризації (r1*r2<1) цих систем, можна припустити, що розподіл сульфамідних груп в них буде досить регулярним. При цьому, відносна активність мономерів (М2) до співполімеризації із стиролом падає в ряду ММА > СМ-ІІІ > СМ-ІІ.
Досліджено біологічну активність синтезованих сульфамідних співполімерів (С?СМ-ІІ) з різною кількістю біологічно активних функціональних груп і показано, що незалежно від того, де знаходиться сульфамідний фрагмент: в лікарському препараті, в біологічно активному мономері чи в співполімері його антимікробна дія зберігається.
З метою синтезу біологічно активних полімерних носіїв із сульфамідними групами та високореакційноздатними ангідридними групами, вивчена співполімеризація бінарної системи МА?СМ. Як видно із визначених констант співполімеризації для обох бінарних систем МА?СМ-ІІ та МА?СМ-ІІІ, константа r10, тобто будуть утворюватися співполімери, в яких ланки мономерів МА та СМ-ІІ, СМ-ІІІ чергуються у співвідношенні 50:50.
Для одержання терполімерів з сульфамідними та ангідридними групами, було вивчено співполімеризацію системи: стирол ? малеїновий ангідрид ? сульфамідний мономер. Процес проводили в умовах, аналогічних для бінарних систем С?СМ та МА?СМ. Показано, що в трикомпонентній системі С?СМ?МА спостерігаються ті самі кінетичні закономірності, що і в бінарних системах МА?СМ-ІІ і МА?СМ-ІІІ. Встановлено, що експериментально знайдені і розраховані за константами співполімеризації склади терполімерів, є досить близькими за значеннями, що дає можливість використовувати ці дані для оптимізації процесу синтезу поліфункціональних біологічно активних полімерних носіїв із реакційноздатними ангідридними групами. За методом Хема розраховані добутки ймовірностей і добутки констант співполімеризації трикомпонентних систем, і одержані результати свідчать про задовільне експериментальне визначення констант співполімеризації для СМ. При цьому, синтез таких терполімерів можна проводити при низьких концентраціях МА. експериментальне визначення констант співполімеризації для СМ. При цьому, синтез таких терполімерів можна проводити при низьких концентраціях МА.
Структуру синтезованих трикомпонентних полімерних носіїв на основі даних елементного аналізу, ІЧ спектроскопії можна подати схемою:
Таким чином, вперше синтезовані бінарні та трикомпонентні полімерні сульфамідні носії для іммобілізації ферментів.
У четвертому розділі досліджено хімічну модифікацію синтезованих біологічно активних полімерних носіїв та промислового співполімеру - стиромаля ферментними та сульфамідними препаратами реакціями полімераналогічних перетворень з утворенням ковалентного зв'язку.
Терполімер (С ? СМ-ІІІ ? МА) на основі стрептоциду, одержаний при співвідношенні мономерів С:СМ-ІІІ:МА = 45:10:45, у складі якого було знайдено 47,1 мол.% фрагментів МА, був вибраний як полімерна матриця для іммобілізації протеази “С” з метою створення лікарських препаратів комбінованої дії. Необхідно відмітити, що склад вибраного терполімеру є близьким до складу азеотропної суміші. Процес взаємодії терполімеру з Пр“С” проводили при різній концентрації ферменту і постійному перемішуванні реакційної маси протягом двох годин у розчині ДМФА при 25°С. Ступінь модифікації ферменту терполімером оцінювали за зміною кислотного числа методом потенціометричного титрування. В результаті було синтезовано біологічно активні полімери з фрагментами протеази “С” та СМ-ІІ, структура яких підтверджена ІЧ спектроскопією.
З метою подальшого вивчення співіммобілізованих систем: полімерний носій - протеолітичний фермент - антимікробний препарат, були проведені дослідження по cпівіммобілізації Пр“С” і норсульфазолу на стиромалі. Для цього, була вивчена хімічна модифікація стиромалем норсульфазолу в розчині ДМФА при температурі 50°С та синтезовано реакціями полімераналогічних перетворень біологічно активний полімерний носій з фрагментами антимікробної речовини.
Для визначення змін, які пов'язані з введенням сульфамідних біоцидних фрагментів в СМА, були вивчені гідрофільні та термічні властивості модифікованих стиромалем сульфамідних препаратів. Вивчення термостабільності модифікованого стиромалем норсульфазолу за допомогою ДТА показало, що введення сульфамідного фрагменту в макромолекулу стиромаля не знижує його термічної стабільності, не змінює температурного режиму його використання та обумовлені цими характеристиками експлуатаційні властивості.
Дослідження біологічної активності полімерних плівок на основі модифікованого стиромалем норсульфазолу, показали, що одержані полімерні покриття мають антимікробну дію. Показано, що діаметр зон пригнічення росту мікроорганізмів на дослідних тест-культурах залежить від їх природи.
Виходячи з одержаних результатів, була розроблена технологія одержання на основі синтезованих біологічно активних полімерів, високоадгезійних та еластичних плівкових покрить, які можуть бути використані як полімерні лікарські препарати, а також як антисептики в клінічній практиці. співполімеризація ліполактин терполімер
Наступним етапом роботи було вивчення процесу іммобілізації протеолітичного ферменту протеази “С” на стиромалі. Реакцію ацилювання можна подати рівнянням:
Знайдено оптимальні умови перебігу процесу іммобілізації, які дозволили розробити метод співіммобілізації системи: СМА - НС - Пр“С”. Процес синтезу співіммобілізованого біологічно активного полімеру на основі такої трикомпонентної системи можна представити схемою 2:
Показано, що послідовність ацилювання стиромалем ферменту та норсульфазолу впливає на кінцевий результат. Так, активність одержаних ФПК суттєво залежить від порядку введення складових компонентів у реакційну суміш. Отимальним виявилася така послідовність введення цих компонентів у макромолекулу носія: спочатку проводиться модифікація стиромалем норсульфазолу при 50°С, а потім при зменшенні температури до 25°С по залишкових ангідридних групах носія проводиться прищеплення протеази “С”. Хімізм перебігу процесу підтверджено даними по загальному вмісту карбоксильних та ангідридних груп у модифікованих ФПК. Синтезовані такі співіммобілізовані полімери, являють собою лікарські препарати нового типу, оскільки вони мають комбіновану біологічну дію, яка складається з терапевтичного ефекту ферменту та антисептичного характеру антимікробної речовини (норсульфазолу або стрептоциду). Так, при використанні синтезованих біополімерів для лікування різних запальних процесів, фрагменти протеази “С” будуть, очевидно, прискорювати лізис некротичних субстратів опікових ран, а фрагменти норсульфазолу, в свою чергу, будуть проявляти антибактеріальну дію - тобто прискорювати процес загоювання ран.
З іншого боку, з метою створення ефективних каталізаторів біохімічних та хімічних процесів, була вивчена іммобілізація ліполітичного ферментного препарату “ліполактину” на промисловому полімерному носії - стиромалі. Для цього, дослідна партія ферментного препарату ліполактину була одержана в напівпромислових умовах ДП “Ензим” (м.Ладижин Вінницької області). Перш ніж провести дослідження по іммобілізації ліполактину на полімерному носії, спочатку було вивчено властивості розчинного ферментного препарату, а саме: оптимальні умови дії, стабільність при зміні кислотності середовища та температури.
Ковалентна іммобілізація ліполак-тину на стиромалі відбувалася за рахунок реакції ацилювання аміногруп ферменту ангідридними групами СМА. Процес проводили в розчині ДМФА при 25°С та постійному перемішуванні. В результаті знайдено оптимальне співвідношення розчинного ЛП і СМА, необхідне для процесу іммобілізації та оптимальний час перебігу реакції. При цьому, вміст білка в ФПК поступово збільшується і процес іммобілізації, ймовірно, протікає через стадію утворення комплексів з переносом заряду (КПЗ) з виникненням сорбційно-ковалентного типу зв'язку між ангідридними групами СМА і аміно-групами ферменту. По мірі перебігу реакції ацилювання КПЗ руйнується та поступово зростає кількість ковалентних зв'язків між полімерною матрицею та ферментом з утворенням ФПК, що підтверджено ІЧ спектрами.
Вивчено властивості ФПК, одержаних при оптимальних умовах процесу іммобілізації, порівняно з розчинною ліпазою. Показано, що іммобілізований ліполактин проявляє максимальну активність при рН=7,5-7,7, як і розчинна ліпаза. Температурний оптимум дії іммобілізованого ліполактину є розширеним та зміщеним на 4-5°С в сторону вищих температур (42°-45°С) порівняно з нативним ліполактином. Іммобілізована ліпаза втрачає активність повільніше, ніж розчинна, тобто іммобілізація призвела до одержання більш стабільних ФПК.
Синтезовані ФПК також були вивчені як каталізатори процесу гідролізу рослинних олій порівняно з нативним ліполактином. Вибрані оптимальні умови проведення процесу гідролізу для нативної та іммобілізованої ліпаз (вміст ферменту відносно маси жиру (15%), співвідношення жирова фаза:вода (1:2 за масою), рН - 7,5, температура 34-35°С, тривалість процесу - 14 год, швидкість перемішування 600 об/хв. Показано, що синтезовані ФПК є каталізаторами процесу гідролізу рослинних олій, хоча їх активність дещо менша порівняно з нативною ліпазою. Цей недолік може бути компенсований багаторазовим використанням іммобілізованих ліполітичних ферментів в безперервному процесі, забезпечуючи практично повний гідроліз жирів.
Для поліпшення експлуатаційних властивостей одержаних ФПК, як каталізаторів, досліджено процес одночасного структурування та іммобілізації системи: стиромаль ? ліполактин ? м-фенілендіамін. Ступінь структурування ФПК вивчали методом рівноважного набухання. Розрахунок параметрів просторової сітки проводили за рівнянням Флорі-Ренера. З досліджень кінетики процесу структурування видно, що ступінь зшивання (1/Qрсн) суттєво залежить від концентрації м-ФДА і зростає із її збільшенням (рис.5). Крім цього, концентрація активних ланцюгів досягає максимального значення за 90-120 хв. Вивчення впливу концентрації ліполактину на процес зшивання макромолекул СМА показало також, що ступінь структурування системи не залежить від Слп і визначається виключно См-ФДА. Тобто, в даній системі перебігають одночасно дві конкуруючі реакції ацилювання з ковалентним прищепленням ферменту до полімерної матриці і утворенням поперечних зв'язків між макромолекулами стиромаля в результаті зшивання їх структуруючим агентом - м-ФДА, який є більш активним субстратом відносно ангідридних груп СМА, ніж ЛП. Вже на початку реакції практично весь білок пов'язується з полімерною матрицею за рахунок утворення КПЗ із виникненням зв'язку сорбційно-ковалентного типу, як у випадку з неструктурованою системою.
Параметри просторової сітки стиромаля, модифікованого ЛП та м-ФДА вказують на те, що експериментально знайдені значення Мс для даної системи складають 800-850 (См-ФДА=10%). Ці значення є досить близькими до розрахованих значень Мс за структурою просторової сітки (Мс=609-812).
Тому, з деяким ступенем наближення можна стверджувати, що з кожними двома ангідридними групами стиромаля (при См-ФДА=10%), проходить один акт прищеплення ферменту до макромолекули СМА та один акт зшивки полімерних ланцюгів м-ФДА. Одержані дані та аналіз ІЧ спектрів, дозволяють тривимірну структуру ФПК представити схемою:
Таким чином, вперше синтезовано просторово зшиті ФПК, що містять в полімерній матриці прищеплені фрагменти ліполактину. Вони були вивчені як каталізатори процесу гідролізу рослинних олій порівняно з неструктурованими ФПК і встановлено, що структуровані ФПК мають поліпшену механічну міцність, стабільність та активність, яка достатня для їх практичного застосування як каталізаторів процесів гідролізу відходів олієжирової промисловості.
ВИСНОВКИ
Вивчено співполімеризацію синтезованих біологічно активних сульфамідних мономерів з вінільними мономерами в бінарних та трикомпонентних системах. Вперше визначені константи співполімеризації СМ (r1 та r2) із стиролом і малеїновим ангідридом та склади бінарних співполімерів і терполімерів. На основі таких бінарних та трикомпонентних систем вперше синтезовано полімерні носії, що мають у своїй структурі біологічно активні сульфамідні групи та високореакційноздатні ангідридні групи, за рахунок яких відбувається ковалентна іммобілізація ферментів.
Встановлено основні закономірності процесу іммобілізації протеолітичного ферменту протеази “С” на синтезованому терполімері (С ? СМ-ІІІ ? МА) і вперше одержано співіммобілізовані полімери, що містять в бокових ланцюгах макромолекул полімерного носія ковалентно прищеплені сульфамідні та ферментні групи різної біологічної дії.
Досліджено хімічну модифікацію серійним стиромалем норсульфазолу і синтезовано реакцією полімераналогічних перетворень біологічно активний полімерний носій з фрагментами антимікробної речовини. Вивчено також іммобілізацію протеолітичного ферменту протеази “С” на стиромалі. На основі одержаних даних вперше розроблений метод сумісної іммобілізації протеази “С” та норсульфазолу на стиромалі. Синтезовані такі поліфункціональні біологічно активні полімерні системи також можуть бути використані як лікарські препарати комбінованої дії.
Вперше проведено систематичні дослідження процесу ковалентної іммобілізації ферментного препарату ліпази ліполактину на співполімері стиролу з малеїновим ангідридом і синтезовано ФПК, які містять в бічних ланцюгах макромолекул носія хімічно пов'язані ферментні фрагменти. Вивчено властивості ФПК порівняно з нативним ліполактином і показано, що вони є більш стабільними, а температурний оптимум дії ФПК є розширеним та зміщеним в область більш високих температур. Встановлено, що синтезовані ФПК є каталізаторами процесу гідролізу рослинних олій, але їх активність дещо зменшується порівняно з нативним ліполактином.
досліджено процес одночасного структурування та іммобілізації трикомпонентної системи: стиромаль ? ліполактин ? м-фенілендіамін. Показано, що в даній системі перебігають одночасно дві конкуруючі реакції ацилювання з ковалентним прищепленням ферменту до полімерної матриці й утворенням поперечних зв'язків між макромолекулами стиромаля в результаті зшивання їх структуруючим агентом ? м-ФДА. Вивчено кінетику зшивання та структуру тривимірної просторової сітки, і показано, що процес структурування залежить виключно від концентрації м-фенілендіаміну і не залежить від концентрації ліполактину.
Встановлено, що структуровані ФПК, порівняно з неструктурованими, мають поліпшену механічну міцність, пролонговану дію, стабільність та активність і можуть бути використані в процесах тотального гідролізу рослинних олій з метою одержання жирних кислот та гліцерину за безвідходною технологією.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ ВИКЛАДЕНО У РОБОТАХ
Чуйко Л.С., Ткачук В.О., Алексеєнко С.І., Краюткіна О.М., Карплюк Ю.Я. Розробка методів одержання біологічно-активних полімерів з сульфамідними та “ліполактинними” групами // Вісник ДУ“ЛП”. - 1997. - № 332. - С.204-207.
Чуйко Л.С., Краюткіна О.М., Мартинюк Н.Б. Ковалентна іммобілізація ферментного препарату ліполактину на співполімері стиролу з малеїновим ангідридом // Наукові записки Тернопільського державного педагогічного університету ім. В.Гнатюка. Серія: Хімія. - 1998. - № 2. - Вип.6. - С.63-68.
Чуйко Л.С., Краюткіна О.М., Болаховська В.А., Мартинюк Н.Б. Іммобілізація ферментного препарату ліпази “ліполактину” на полімерному носії // Вісник ДУ“ЛП”. - 1998. - № 339. - С.95-97.
Краюткіна О.М., Чуйко Л.С. Вивчення процесу одночасного структурування та іммобілізації системи фермент-полімерний носій // Наукові записки Тернопільського державного педагогічного університету ім. В.Гнатюка. Серія: Хімія. - 2000. - Вип.4. - С.35-39.
Чуйко Л.С., Карплюк Ю.Я., Ткачук В.О., Алексеєнко С.І., Краюткіна О.М. Синтез та дослідження полімерів з біологічно активними функціональними групами // Укр. хім. журнал. - 2000. - Т.66 - № 4. - С.121-125.
Краюткіна О.М., Чуйко Л.С., Болаховська В.А. Дослідження процесу іммобілізації ферментного препарату ліпази ліполактину на полімерних носіях // Тези доп. шостої наук. конф. “Львівські хімічні читання”. - Львів. - 1997. - С.151.
Чуйко Л.С., Краюткіна О.М., Ткачук В.О., Алексеєнко С.І. Синтез та дослідження біологічно-активних полімерів поліфункціональної дії // Тези доп. другої н-т конф. “Поступ в нафтогазопереробній та нафтохімічній промисловості”. - Львів. - 1999. - С.151.
Чуйко Л.С., Краюткіна О.М. Вивчення ковалентної іммобілізації ферментного препарату ліпази “ліполактину” на полімерному носії // Тези доп. першої міжнар. конф. видавництва “Наука і освіта-98”. - Том15 (Хімія). - Дніпропетровськ. - 1998. - С.19.
АНОТАЦІЯ
Краюткіна О.М. Іммобілізація ліполітичних і протеолітичних ферментів та сульфамідних лікарських препаратів на полімерних носіях. - Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата хімічних наук за спеціальністю 02.00.06 - хімія високомолекулярних сполук. Національний університет “Львівська політехніка”, Львів, 2000.
Дисертація присвячена вивченню ковалентної іммобілізації ліполітичних і протеолітичних ферментів та сульфамідних лікарських препаратів на синтезованих біологічно активних полімерних носіях та стиромалі. Вивчено співполімеризацію синтезованих біологічно активних сульфамідних мономерів з вінільними мономерами в бінарних та трикомпонентних системах, а також визначені константи їх співполімеризації та склади бінарних співполімерів і терполімерів. На основі таких систем створені полімерні носії з біологічно активними сульфамідними групами для іммобілізації ферментів. З метою створення лікарських препаратів поліфункціональної дії розроблені методи співіммобілізації протеази “С” з антимікробними речовинами (норсульфазолом та стрептоцидом) на синтезованих біологічно активних полімерних носіях та стиромалі. Вивчено основні закономірності процесу іммобілізації та визначені оптимальні умови його проведення.
Синтезовано фермент-полімерні комплекси на основі ліполактину, ковалентно іммобілізованого із стиромалем, вивчено їх властивості порівняно з нативною ліпазою. Вивчено кінетику утворення тривимірної просторової сітки при одночасному структуруванні та іммобілізації системи: стиромаль - ліполактин - м-фенілендіамін. Встановлено можливість використання фермент-полімерних комплексів на основі ліполактину як каталізаторів тотального гідролізу відходів олієжирової промисловості, а одержаних співіммобілізованих систем як полімерних лікарських препаратів комбінованої дії.
Ключові слова: співполімеризація, сульфамідні мономери, ковалентна іммобілізація, співполімер, терполімер, фермент-полімерний комплекс, біологічна активність.
АННОТАЦИЯ
Краюткина Е.Н. Иммобилизация липолитических и протеолитических ферментов и сульфамидных лекарственных препаратов на полимерных носителях. - Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук по специальности 02.00.06 ? химия высокомолекулярных соединений. Национальный университет “Львивська политехника”, Львов, 2000.
Диссертация посвящена изучению ковалентной иммобилизации липолитических и протеолитических ферментов, и сульфамидных лекарственных препаратов на синтезированных биологически активных полимерных носителях и стиромале. Изучена сополимеризация синтезированных биологически активных сульфамидных мономеров с винильными мономерами в бинарных и трехкомпонентных системах, а также определены константы их сополимеризации и составы бинарных сополимеров и терполимеров. На основе таких систем созданы полимерные носители с биологически активными сульфамидными группами для иммобилизации ферментов.
Установлены основные закономерности процесса иммобилизации протеолитического фермента протеазы “С” на синтезированном терполимере на основе стрептоцида. Впервые получены соиммобилизированные полимеры, боковые цепи которых содержат ковалентно связанные сульфамидные и ферментные группы различного биологического действия.
Исследована химическая модификация серийным стиромалем норсульфазола и синтезирован реакцией полимераналогичных превращений биологически активный полимерный носитель с фрагментами антимикробного вещества. Изучена также иммобилизация протеолитического фермента протеазы “С” на стиромале. С целью создания лекарственных препаратов полифункционального действия разработан метод соиммобилизации протеазы “С” и норсульфазола на стиромале. Установлены основные закономерности процесса соиммобилизации и определены оптимальные условия его проведения.
Синтезированы фермент-полимерные комплексы (ФПК) на основе липолактина, ковалентно иммобилизованного со стиромалем, а также определены их свойства по сравнению с нативной липазой, а именно: оптимальные условия действия, стабильность при изменении кислотности среды и температуры.
Изучена кинетика образования трехмерной пространственной сетки при одновременном структурировании и иммобилизации системы: стиромаль - липолактин - м-фенилендиамин. Установлено, что структурированные ФПК, по сравнению с неструктурированными, обладают повышенной механической прочностью, пролонгированным действием, стабильностью и активностью.
Найдена возможность использования ФПК на основе липолактина в качестве катализаторов процесса тотального гидролиза жиров, а полученных соиммобилизированных систем как полимерных лекарственных препаратов комбинированного действия.
Ключевые слова: сополимеризация, сульфамидные мономеры, ковалентная иммобилизация, сополимер, терполимер, фермент-полимерные комплексы, биологическая активность.
summary
O.M. Krayutkina. Immobilization of lipolytic and proteolytic enzymes and sulfumide drugs on polymeric carriers. - Manuscript.
Thesis for a scientific degree of Chemical Sciences in speciality 02.00.06 - chemistry of high-molecular substances. Lviv Polytechnic National University, Lviv, 2000.
The dissertation deals with the analysis of the covalent immobilization of lipolytic and proteolytic enzymes, and sulfumide drugs on the synthesized biologically active polymeric carriers and stiromal.
The copolymerization of synthesized biologically active monomers, based on sulfumides, with vinyl monomers in binary and three-component systems was studied, and also the constants of their copolymerization and compositions of binary copolymers and terpolymers were determined.
On the basis of such systems the polymeric carriers with biologically active sulfumide groups for the immobilization of enzymes were created.
With the purpose of creation of polyfunctional drugs the methods of copolymerization of a protease “С” with antimicrobial substances (norsulfazolum and streptocidum) on the synthesized biologically active polymeric carriers and stiromal were worked out.
The basic regularities of the process of an immobilization were investigated and the optimal conditions of its conducting were defined.
The enzyme-polymer complexes (EPC) including in macromolecules of stiromal the covalent linkage lipolactyn fragments have been produced, their properties were determined in comparison with dissoluble lipase.
The kinetics of formation of a three-dimensional grid was studied with simultaneous structuring and immobilization of a system: stiromal - lipolactyn - m-phenylendiamine.
The possibility of using of EPC on the lipolactyn basis was proved to be catalysts for total hydrolysis wastes of butter-fat industry, while obtained copolymerized systems to be polymeric drugs of the combined activity.
Keywords: copolymerization, sulfumide monomers, covalent immobilization, copolymer, terpolymers, enzyme-polymer complexes, biological activity.
Размещено на Allbest.ru
Подобные документы
Класифікація ферментів. Особлива форма їх молекул. Гіпотези "ключа і замка" та "руки і рукавички". Інгібітори та застосування ферментів. Отримання лікарських препаратів та складних хімічних сполук. Застосування каталази в харчовій і гумовій промисловості.
презентация [1,3 M], добавлен 19.11.2014Контроль якості полімерних матеріалів як наукова дисципліна, її місце в навчальному процесі. Організація контролю полімерних матеріалів на підприємстві. Полімерні матеріали для виготовлення пластмасових та гумових виробів. Контроль якості пластмас.
контрольная работа [27,6 K], добавлен 19.01.2011Методика розробки методів синтезу високотемпературних надпровідників. Сутність хімічного модифікування і створення ефективних центрів спінінга. Синтез, структурно-графічні властивості та рентгенографічний аналіз твердих розчинів LaBa2Cu3O7 та SmBa2Cu3O7.
дипломная работа [309,3 K], добавлен 27.02.2010Cинтез нових поліциклічних систем з тіопірано-тіазольним каркасом. Сучасні вимоги до нових біологічно-активних сполук. Створення "лікоподібних молекул" з невисокою молекулярною масою. Біологічна активність нових поліциклічних конденсованих систем.
автореферат [89,1 K], добавлен 09.04.2009Властивості і застосування циклодекстринів з метою підвищення розчинності лікарських речовин. Методи одержання та дослідження комплексів включення циклодекстринів. Перспективи застосування комплексів включення в сучасній фармацевтичній технології.
курсовая работа [161,5 K], добавлен 03.01.2012Електропровідні полімери, їх властивості. Синтез функціональних плівок полі аніліну. Електрокаталітичні властивості металонаповнених полімерних композитів. Електрохімічний синтез функіоналізованої поліанілінової плівки, властивості одержаних композитів.
дипломная работа [4,1 M], добавлен 26.07.2014Умови синтезу 4-заміщених2-метилхінолінів, визначення їх спектральних показників і квантово-хімічних констант. Реакційноздібна варіація 4-заміщеного 2-метилхіноліну для подальшого моделювання біодоступних біологічно активних речовин на базі хіноліну.
дипломная работа [2,7 M], добавлен 08.06.2017Синтез електропровідних полімерів. Основні форми поліаніліну. Синтез наночастинок золота. Електрокаталітичні властивості металонаповнених полімерних композитів. Окиснення попередньо відновленої до лейкоемеральдинової форми функціоналізованої Пан плівки.
дипломная работа [3,2 M], добавлен 09.07.2014Особливості будови та загальні способи одержання похідних 1,4-дигідропіридину з флуорованими замісниками, їх біологічна активність. Використання синтезу Ганча для утворення похідних 4-арил-1,4-дигідропіридину на основі о-трифлуорометилбензальдегіду.
дипломная работа [734,7 K], добавлен 25.04.2012Якісні і кількісні методи хімічного аналізу, їх загальна характеристика. Опис властивостей кальцію та його солей. Перелік необхідних для аналізу хімічного посуду, реактивів. Особливості хімичного аналізу фармацевтичних препаратів з кальцієм, його опис.
курсовая работа [16,7 K], добавлен 27.04.2009
