Общая фармацевтическая химия

Метод Лоури. Преимущественно используется для ферментных препаратов. Отличается высокой чувствительностью, но определению мешают многие вещества. В последнем случае применяют метод с предварительным осаждением белка (Б). Зависимость поглощения белка от его концентрации нелинейная, однако в области малых концентраций ее можно считать линейной. Определение проводят по калибровочному графику, построенному по растворам стандартного образца белка, который воспроизводят при каждом анализе.

Метод Бредфорда используется для белков и пептидов с молекулярной массой более 3000 Да. Метод имеет высокую чувствительность, но степень связывания красителя в значительной степени зависит от индивидуальных свойств белка.

Метод с бицинхониновой кислотой альтернативен методу Лоури, но отличается более высокой стабильностью реагента, чем реактив Фолина, и меньшей зависимостью от природы белка и сопутствующих соединений.

Колориметрические и некоторые спектрофотометрические методы требуют использования стандартного образца. В качестве стандартного образца белка используют: стандартный образец присутствующего в препарате белка, или бычий сывороточный альбумин, или сывороточный альбумин человека, высушенные перед испытанием до постоянной массы (стандартный образец и условия высушивания указывают в частной фармакопейной статье: в эксикаторе под вакуумом над фосфора(У) оксидом, в вакуумном шкафу при 60 °С или в термостате при 100-105 °С).

Раствор стандартного образца. Стандартный образец белка растворяют в том же растворителе и в той же концентрации, что и в испытуемом растворе. Испытуемый раствор. Растворяют или разводят лекарственное средство в воде, 0,9 % растворе натрия хлорида или буферном растворе до концентрации, указанной в частной фармакопейной статье.

3. Методы определения белка по содержанию азота

Метод Къельдаля - титриметрический (А - микрометод, Б - обратное титрование).

Метод с реактивом Несслера (колориметрический). В качестве стандартного образца, содержащего азот, используют аммония сульфат.

Для многокомпонентных препаратов, содержащих другие вещества, в состав которых входит азот, перед определением белка необходимо предварительно проводить пробоподготовку: осаждение трихлоруксусной или фосфорноволь-фрамовой кислотой.

4. Метод определения белка по аминокислотному составу.

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Результаты достоверны в области линейной зависимости оптической плотности раствора от концентрации белка.

Метод А. Метод основан на способности ароматических аминокислот (тирозина, триптофана и в меньшей степени фенилаланина) в молекуле белка поглощать ультрафиолетовый свет при длине волны около 280 нм.

При низких концентрациях белок адсорбируется на стенках кюветы, что может приводить к заниженным результатам; в этом случае в раствор препарата добавляют неионный детергент, указанный в частной фармакопейной статье, или предварительно концентрируют испытуемый раствор, избегая денатурации белка.

Готовят испытуемый раствор с содержанием белка 0,2-2 мг/мл.

Методика. Выдерживают при комнатной температуре испытуемый раствор, раствор стандартного образца и раствор сравнения в течение 10 мин.

Для высокоочищенных белков концентрацию белка в растворе вычисляют с использованием удельного показателя поглощения.

Рассеяние света. Точность определения содержания белка в УФ-области уменьшается, если белки в растворе существуют в виде частиц, сравнимых по размеру с длиной волны измеряемого света (250-300 нм). Рассеяние светового луча приводит к увеличению поглощения испытуемого раствора, поэтому дополнительно вычисляют оптическую плотность раствора при длине волны 280 нм, обусловленную рассеянием света. С этой целью проводят определение оптической плотности испытуемого раствора при длинах волн 320, 325, 330, 335, 340 и 350 нм. Строят график зависимости логарифма (lg) оптической плотности от lg соответствующей длины волны. Экстраполируют кривую до lg 280 нм и определяют lg оптической плотности. Антилогарифм этого значения соответствует оптической плотности за счет рассеяния света, которое вычитают из оптической плотности раствора, полученной при 280 нм, для расчета истинного содержания белка в испытуемом растворе.

Концентрацию белка в испытуемом растворе (С) в мг/мл вычисляют по формуле:

С = Сст.хА/Аст.,

где: Сст- концентрация белка в растворе стандартного образца, в мг/мл;

А и Аст - значения оптической плотности испытуемого раствора и раствора стандартного образца при длине волны 280 нм соответственно, после вычитания оптической плотности за счет рассеяния света.

Мутные растворы для уменьшения светового рассеяния перед определением содержания белка фильтруют через фильтры из поливинилиденфторида или указанные в частной фармакопейной статье с размером пор 0,2 мкм, не адсорбирующие белок, или центрифугируют.

Метод Б. Метод измерения оптической плотности растворов при двух длинах волн используют как для растворов чистых белков, так и для их смесей, в области концентраций 0,0015-0,0450 мг/мл, если не указано иначе в частной фармакопейной статье.

Готовят серию разведений (не менее трех) образца лекарственного средства с равными интервалами и измеряют оптическую плотность полученных растворов при длинах волн 215 нм и 225 нм. Концентрацию белка (Q) в каждом растворе в мг/мл вычисляют по формуле:

Сi =(А215-А 225)хРiх0,144,

где: A215 и А 225 - оптическая плотность разведенного раствора при 215 нм и 225 нм соответственно;

Рi - разведение;

0,144 - эмпирически вычисленный коэффициент для белков при измерении оптической плотности растворов при длинах волн 215 нм и 225 нм.

Рассчитывают среднее значение.

КОЛОРИМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

1. Метод с биуретовым реактивом

Метод основан на образовании в щелочной среде окрашенного комплекса ионов двухвалентной меди с пептидными связями молекулы белка.

Методика. К 1 мл испытуемого раствора, приготовленного растворением испытуемого вещества в 0,9 % растворе натрия хлорида, с содержанием белка от 2 до 8 мг прибавляют 4 мл биуретового реактива, перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 30 мин. Измеряют оптическую плотность раствора при длине волны 540 нм (или указанной в частной фармакопейной статье, в пределах 540-650 нм).

Биуретовую реакцию нельзя проводить в присутствии солей аммония из-за образования медно-аммиачных комплексов, а также с растворами, в которых появляется мутность или образуется осадок. Для устранения влияния посторонних веществ проводят осаждение белка из раствора испытуемого образца следующим образом: к 1 объему раствора испытуемого образца прибавляют 0,1 объема 50 % раствора трихлоруксусной кислоты, удаляют надосадочную жидкость и растворяют осадок в небольшом объеме 0,5 М раствора натрия гидроксида. Полученный раствор используют для приготовления испытуемого раствора.

Метод может использоваться в различных вариантах: с построением калибровочной кривой или с использованием стандартного образца.

Калибровочный график строят каждый раз при приготовлении новых реактивов или использовании другого спектрофотометра, но не реже 1 раза в 3 мес.

2. Метод Лоури

Метод основан на биуретовой реакции белков с солями меди(П) в щелочном растворе и восстановлении фосфорномолибдено-вольфрамового реактива (или реактива Фолина) в гетеромолибденовый краситель с максимумом поглощения при длине волны 750 нм в результате окисления ароматических аминокислот белка (главным образом тирозина, а также триптофана и фенилаланина и в меньшей степени цистеина). Развитие окраски достигает максимума через 20-30 мин при комнатной температуре, в дальнейшем идет уменьшение ее интенсивности. Степень окрашивания зависит от природы белка. Определению мешают некоторые соли, тиоловые соединения, углеводы, липиды, неионные детергенты, органические растворители, комплексоны и другие соединения. Для уменьшения влияния веществ, мешающих определению, проводят дополнительное разведение раствора или осаждение белков трихлоруксусной кислотой.

Метод А (без предварительного осаждения белка). К 1 мл испытуемого раствора, содержащего 0,020-0,100 мг белка; к 1 мл каждого раствора стандартного образца белка и к 1 мл используемого для приготовления испытуемого раствора растворителя, помещенным в отдельные пробирки, прибавляют по 5 мл реактива В. Содержимое пробирок перемешивают и оставляют на 10 мин при комнатной температуре. Затем в каждую пробирку прибавляют 0,5 мл фос-форномолибденово-вольфрамового реактива, разбавленного перед употреблением водой в 2 раза, быстро и тщательно перемешивают и оставляют на 30 мин при комнатной температуре. Измеряют оптическую плотность испытуемого и стандартных растворов на спектрофотометре при длине волны 750 нм в кюветах с толщиной слоя 10 мм относительно раствора сравнения.

Примечания

1. Приготовление реактива А. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 2 г натрия карбоната, растворяют в 0,1 М растворе натрия гидроксида и доводят объем до метки этим же раствором.

Срок годности раствора - 1 мес.

2. Приготовление реактива Б. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 0,5 г меди сульфата и растворяют в 1 % растворе: калия-натрия тартрата, или натрия тартрата, или натрия цитрата (должно быть указано в частной фармакопейной статье).

Срок годности раствора - 2 мес.

3. Приготовление реактива В. Перед анализом смешивают 50 мл реактива А и 1 мл реактива Б.

Метод Б (с предварительным осаждением белка). Метод рекомендован для лекарственных средств, содержащих компоненты, влияющие на результаты анализа (фенол, ароматические аминокислоты, трис-буфер, цистеин, дитиотреитол, аскорбиновая кислота, этилендиаминтетраацетат; тритон Х-100, твин-20, соли, сахара и др.).

Методика. В центрифужную пробирку помещают 1 мл испытуемого раствора, содержащего 0,10-0,30 мг белка, прибавляют 1 мл 20 % раствора трихлоруксусной кислоты и перемешивают. Пробу оставляют на 18-20 ч при температуре 4-8 °С. Осадок отделяют центрифугированием в течение 30 мин при температуре около 5 °С и скорости вращения 2000 об/мин, промывают 1 мл 10 % раствора трихлоруксусной кислоты, центрифугируют в тех же условиях. Осторожно сливают надосадочную жидкость, оставшийся осадок растворяют в 0,2 мл 0,1 М раствора натрия гидроксида и доводят объем раствора водой до 1 мл. К 0,5 мл полученного раствора, содержащего 0,050-0,150 мг белка, прибавляют 0,5 мл воды, перемешивают, вносят 5 мл реактива В и далее поступают, как описано выше в методе А.

В качестве раствора сравнения используют пробу, содержащую 0,1 мл 0,1 М раствора натрия гидроксида, 0,9 мл воды, 5 мл реактива В и 0,5 мл разбавленного в 2 раза фосфорномолибденово-вольфрамового реактива.

Примечание. Приготовление 20 % раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ). 150 г ТХУ растворяют в 100 мл воды. 1 мл полученного раствора титруют 1 М раствором натрия гидроксида с индикатором фенолфталеин и рассчитывают концентрацию трихлоруксусной кислоты в полученном растворе (приблизительно 80 % раствор трихлоруксусной кислоты).

1 мл 1 М раствора натрия гидроксида соответствует 0,1634 г трихлоруксусной кислоты.

Срок годности полученного раствора - 1 год.

Раствор разводят водой до концентрации 20 %.

Срок годности 20 % раствора трихлоруксусной кислоты - 1 мес.

Метод В (с натрия додецилсульфатом). Определение проводят, как описано в методе А, но вместо 5 мл реактива В к растворам прибавляют по 1 мл щелочного реагента меди.

Примечание. Приготовление щелочного реагента меди. В мерной колбе вместимостью 100 мл растворяют в воде 0,2 г меди сульфата и 0,4 г натрия тартрата, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. 1 объем полученного раствора смешивают с 2 объемами 5 % раствора натрия додецил-сульфата и 1 объемом 3,2 % раствора натрия гидроксида.

Срок годности - 2 недели при комнатной температуре.

3. Метод Бредфорда

Метод основан на измерении светопоглощения продукта взаимодействия красителя кислотного синего 90 с белком при длине волны 595 нм. Связывание красителя происходит в анионной форме преимущественно с остатками аргинина и в меньшей степени с остатками лизина, гистидина, триптофана и фенилала-нина белка.

Методика. 0,1 мл испытуемого раствора, содержащего 0,04-0,05 мг белка, помещают в пробирку, прибавляют 5 мл реактива Бредфорда, тщательно перемешивают и через 10 мин измеряют оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 595 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм против раствора сравнения, содержащего растворитель и реактив Бредфорда. Окраска стабильна в течение 1 часа. Для соблюдения линейной зависимости оптической плотности определяемого белка от его концентрации конечная концентрации белка в растворе красителя должна быть 0,008-0,010 мг/мл. В частных фармакопейных статьях допускается изменение объемов испытуемого раствора и реактива Бредфорда с соблюдением данного условия.

Содержание белка в растворе рассчитывают по калибровочному графику, построенному в пределах от 0,01 до 0,10 мг стандартного образца белка в 0,1 мл раствора.

Калибровочный график воспроизводят при каждом анализе.

Примечание. Приготовление реактива Бредфорда. В мерную колбу вместимостью 500 мл помещают 0,05 г кислотного синего 90, растворяют в 25 мл спирта 96 %, прибавляют 50 мл фосфорной кислоты концентрированной, доводят объем раствора водой до метки и тщательно перемешивают.

Реактив хранят при комнатной температуре во флаконе темного стекла. Срок годности - 2 недели.

Перед использованием реактив фильтруют.

Допускается использование коммерческого реактива Бредфорда.

4. Метод с бицинхониновой кислотой

Метод основан на восстановлении двухвалентного иона меди в одновалентный при взаимодействии с остатками цистеина, цистина, триптофана, тирозина, пептидной связью белка и образовании окрашенного комплекса Си+ с бицинхониновой кислотой (2,2'-бихинолин-4,4'-дикарбоновая кислота-БХК). Определению мешают восстанавливающие вещества: сахара, аскорбиновая кислота, тиоловые соединения, этилендиаминтетраацетат. Влияние мешающих веществ может быть уменьшено разбавлением испытуемого раствора или устранено отделением белка путем его осаждения, описанного в методе Лоури. Интенсивность окраски образующегося комплекса зависит от природы белка, поэтому белок стандартного образца должен быть тот же, что и в испытуемом образце.

Методика. К 0,1 мл испытуемого раствора, содержащего 0,025-0,05 мг белка; 0,1 мл раствора стандартного образца белка и к 0,1 мл растворителя, используемого для приготовления испытуемого раствора, прибавляют 2 мл реагента меди с БХК. Выдерживают растворы при 37 °С в течение 30 мин, охлаждают при комнатной температуре и через 60 мин (от конца выдержки при 37 °С) измеряют оптическую плотность испытуемого и стандартных растворов на спектрофотометре при длине волны 562 нм в кюветах с толщиной слоя 10 мм относительно раствора сравнения.

Содержание белка в испытуемом растворе рассчитывают по калибровочному графику.

Примечания

1. Приготовление БХК-реагента. В мерной колбе вместимостью 1 л в воде растворяют 10 г бицинхониновой кислоты (БХК) или ее динатриевой соли, 20 г натрия карбоната моногидрата, 1,6 г натрия тартрата, 4 г натрия гидроксида, 9,5 г натрия гидрокарбоната, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают; рН полученного раствора должен быть 11,25. При необходимости рН доводят раствором натрия гидроксида 10 % или натрия гидрокарбоната 5 %.

2. Приготовление реагента меди с БХК. Смешивают 1 мл 4 % раствора меди сульфата и 50 мл БХК-реагента.

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЛКА ПО СОДЕРЖАНИЮ АЗОТА

Определение белка по содержанию азота основано на том, что содержание азота в большинстве белков практически одинаково и может быть принято равным 16 %. По количеству найденного азота во взятой пробе рассчитывают содержание белка в лекарственном средстве, используя коэффициент пересчета азота на белок, равный 6,25.

1. Метод Къельдаля

А. Микрометод. Определение проводят в соответствии с ОФС «Определение азота в органических соединениях» (раздел 2 - микрометод Къельдаля) из точной навески препарата, содержащей 10-20 мг белка.

Б. Метод Къельдаля (обратное титрование). Определение проводят в соответствии с ОФС «Определение азота в органических соединениях» (раздел 3, подраздел Б - определение азота преимущественно в препаратах крови) из точного объема испытуемого раствора, содержащего 50-200 мг белка.

2. Метод с реактивом Несслера

Метод основан на цветной реакции ионов аммония с реактивом Несслера.

Содержание азота в испытуемом растворе определяют по калибровочному графику, построенному с использованием в качестве стандартного образца аммония сульфата, высушенного до постоянной массы в эксикаторе над серной кислотой или кальция хлоридом.

Метод А. Точную навеску лекарственного средства, содержащую около 10 мг белка, минерализуют по способу, описанному в микрометоде Кьельдаля. После минерализации пробу количественно переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят объем раствора водой до метки.

0,5-1,0 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 10 мл воды, 2 мл реактива Несслера, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Через 15 мин измеряют оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 400-410 нм (указанной в частной фармакопейной статье) в кювете с толщиной слоя 10 мм.

В качестве раствора сравнения используют смесь этих же реактивов без испытуемого образца.

Калибровочный график строят в пределах содержания азота от 0,03 до 0,07 мг в 25 мл конечного раствора.

Метод Б (с использованием фосфорновольфрамовой кислоты). В центрифужную термостойкую пробирку вместимостью 10 мл вносят от 0,5 до 3 мл испытуемого раствора с содержанием белка от 0,07 до 3,0 мг, доводят при необходимости объем 0,9 % раствором натрия хлорида до 3 мл, прибавляют 0,3 мл 20 % раствора фосфорновольфрамовой кислоты и 0,3 мл серной кислоты концентрированной, тщательно перемешивают и оставляют на 18-20 ч при температуре 2-8 °С. Осадок отделяют центрифугированием при скорости вращения 2000 об/мин в течение 30 мин при температуре 4-6 °С. Осадок промывают смесью, состоящей из 1 мл воды, 0,1 мл серной кислоты концентрированной, 0,1 мл 20 % раствора фосфорновольфрамовой кислоты, затем центрифугируют в тех же условиях. К осадку прибавляют 0,1 мл серной кислоты концентрированной. Пробирку закрывают стеклянным колпачком или стеклянной воронкой и минерализуют на песчаной бане. Одновременно минерализуют контрольную пробу, содержащую 0,1 мл серной кислоты концентрированной. Для ускорения минерализации используют водорода пероксид, который периодически прибавляют по 1-2 капли в предварительно охлажденную пробирку. Минерализацию продолжают до образования осадка желтого цвета (8-10 ч или указанного в частной фармакопейной статье времени), окраска которого не изменяется в течение последних 1-1,5 ч. Пробирку охлаждают, доводят объем минерализата водой до 10 мл и перемешивают. 0,5 мл полученного раствора переносят в мерную пробирку, доводят водой до объема 9,5 мл и перемешивают; прибавляют 0,5 мл реактива Несслера и вновь перемешивают. Через 15 мин измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 400-410 нм (указанной в частной фармакопейной статье) в кювете с толщиной слоя 10 мм.

В качестве раствора сравнения используют контрольный раствор, приготовленный аналогичным образом из контрольной пробы.

Калибровочный график строят в пределах содержания азота от 0,005 до 0,025 мг в 10 мл и воспроизводят при каждом анализе.

4. МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЛКА ПО АМИНОКИСЛОТНОМУ СОСТАВУ Метод включает кислотный гидролиз (обычно в 6 М растворе хлористоводородной кислоты при 110 °С в течение 18-72 ч) белков до аминокислот, которые затем хроматографически разделяют в соответствии с инструкцией, прилагаемой к аминокислотному анализатору, и количественно определяют в сравнении со стандартами аминокислот.

Необходимо учитывать, что при кислотном гидролизе разрушается триптофан и частично треонин и серии. Количество треонина и серина определяют путем экстраполяции данных к нулевому времени гидролиза. Пептидная связь между остатками валина, лейцина и изолейцина более устойчива к гидролизу, чем у других аминокислот, поэтому их количество определяют после гидролиза в течение 72 час. При определении цистеина и метионина необходимо их предварительно окислять соответственно в цистеиновую кислоту и метионин-сульфон или использовать другие методы анализа: для цистина (1/2 цистеина) -гидразинолиз с последующим проведением цветной реакции с реактивом висмута, описанным в частной фармакопейной статье; для метионина - проведение гидролиза в отдельной навеске большой массы (около 0,5 г) с последующей цветной реакцией с натрия нитропруссидом. Триптофан определяют после щелочного гидролиза в отдельной навеске и проводят цветную реакцию с л-диме-ти ламинобензаль дегидом.

Расчет содержания белка проводят следующим образом: зная содержание каждой аминокислоты (А^ в мкг/мг и мкМ/мг, рассчитывают сумму аминокислот. Затем рассчитывают величину средней молекулярной массы аминокислот (Мср), поделив сумму аминокислот в мкг (S At{) на сумму аминокислот в мкМ &Аа):

Из полученного значения Мср вычитают 18 (молекулярная масса воды, которая присоединяется к пептидной связи во время гидролиза с ее разрывом и образованием концевых групп аминокислот), получают величину среднего аминокислотного остатка (Ас„): Затем полученное значение Аср умножают на сумму аминокислот в мг и делят на значение MCD, в результате получают содержание белка в мг (Б):

где 1000 - перевод мкг в мг.

Для определения содержания белка (X) в мг в 1 мг образца лекарственного средства делят значение Б с учетом разведения (Р), проводимого в ходе анализа, на навеску образца (т) в мг, которая обычно составляет около 10 мг:

3.5.3 НИТРИТОМЕТРИЯ (ОФС 42-0054-07)

Нитритометрия - метод титриметрического анализа, при котором в качестве реактива для титрования используется раствор натрия нитрита.

Применяется для количественного определения соединений, содержащих первичную или вторичную ароматическую аминогруппу, для определения гидразидов, а также ароматических нитросоединений после предварительного восстановления нитрогруппы до аминогруппы.

Методика. Если не указано иначе, точную навеску образца лекарственного средства, указанную в частной фармакопейной статье, растворяют в смеси 10 мл воды и 10 мл хлористоводородной кислоты разведенной 8,3 %. Прибавляют воду до общего объема 80 мл, 1 г калия бромида и при постоянном перемешивании титруют 0,1 М раствором натрия нитрита. В начале титрования прибавляют раствор натрия нитрита со скоростью 2 мл/мин, а в конце (за 0,5 мл до эквивалентного количества) - 0,05 мл/мин.

Титрование проводят при температуре раствора 15-20 °С, однако в некоторых случаях требуется охлаждение до 0-5 °С.

Точку эквивалентности определяют электрометрическими методами (потен-циометрическое титрование, амперометрическое титрование) или с помощью внутренних индикаторов.

При потенциометрическом титровании в качестве индикаторного применяют платиновый электрод, при этом в качестве электродов сравнения используют хлорсеребряный или насыщенный каломельный электрод.

На электроды накладывают разность потенциалов 0,3-0,4 В, если не указано иначе в частной фармакопейной статье.

В качестве внутренних индикаторов используют тропеолин 00 (4 капли раствора), тропеолин 00 в смеси с метиленовым синим (4 капли раствора тропео-лина 00 и 2 капли раствора метиленового синего), нейтральный красный (2 капли в начале и 2 капли в конце титрования).

Титрование с тропеолином 00 проводят до перехода окраски от красной к желтой, со смесью тропеолина 00 с метиленовым синим - от красно-фиолетовой к голубой, с нейтральным красным - от красно-фиолетовой к синей. Выдержку в конце титрования с нейтральным красным увеличивают до 2 мин.

Параллельно проводят контрольный опыт.

ЛИТЕРАТУРА

1. Фармацевтический анализ лекарственных средств/ Под ред. В.А. Шаповаловой. - М.: Медицина, 1978.

2. Аксенова Э.Н., Андрианова О.П., Арзамасцев А.П. Руководство к лабораторным заняться по фармацевтической химии. - М.: Медицина, 1987.

3. Беликов В. Г. Фармацевтическая химия. -М.: МЕДпресс-информ, 2007.

4. Фармацевтическая химия. / Под ред. А.П. Арзамасцева. -М.: ГЕОТАР-Медиа, 2006.

5. Государственная фармакопея СССР, XI издание. Выпуск I - М.: Медицина, 1987.

6. Государственная фармакопея СССР, X издание. - М.: Медицина, 1968.

7. Государственная фармакопея СССР, XI издание. Выпуск II - М.: Медицина, 1990.

8. Государственная фармакопея Российской Федерации, XII издание. Часть I- М.: Научный центр экспертизы средств медицинского применения, 2007.

9. Стандартизация и контроль качества лекарственных средств/ Под ред. Н.А. Тюкавкина. - М.: Медицинское информационное агентство, 2008.

Учебно-практическое издание

Ерёмкин Алексей Владимирович

Каюков Яков Сергеевич

Ершов Олег Вячеславович

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ТЕТРАЦИАНОЭТИЛЕНА С КАРБОНИЛЬНЫМИ СОЕДИНЕНИЯМИ. СИНТЕЗ 4-ОКСОАЛКАН-1,1,2,2-ТЕТРАКАРБОНИТРИЛОВ.

Учебное пособие

Редактор Л.Г. Григорьева

Подписано в печать 2.05.2006 Формат 6084/16.

Бумага газетная. Офсетная печать. Гарнитура Таймс. Усл. печ. л. Уч.-изд. л.

Тираж экз. Заказ №

Чувашский государственный университет

Типография университета

428015 Чебоксары, Московский просп.,

Размещено на Allbest.ru