Производство антибиотиков и их применение в различных отраслях АПК

Размещено на http://www.allbest.ru/

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ

РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Тихоокеанский государственный экономический университет

Кафедра пищевой биотехнологии

КУРСОВАЯ РАБОТА

По дисциплине «Общая химическая технология»

ТЕМА: Производство антибиотиков и их применение в различных отраслях АПК

Студент 431 гр. Рогов А.М.

Руководитель к.т.н. доцент Фищенко Е.С.

Владивосток - 2011

СОДЕРЖАНИЕ:

ВВЕДЕНИЕ

I. ИСТОРИЯ ПРИМЕНЕНИЯ, ТЕРМИНОЛОГИЯ И КЛАССИФИКАЦИЯ АНТИБИОТИКОВ

1.1 Из истории

1.2 Терминология

1.3 Общие сведения о производстве

1.4 Причины роста числа антибиотиков

1.5 Классификация антибиотиков

II. ПРОИЗВОДСТВО АНТИБИОТИКОВ

2.1 Методы культивирования продуцентов антибиотиков

2.2 Ферментёры

2.3 Стерилизация питательных сред

2.4 Подготовка посевного материала

2.5 Развитие продуцента антибиотика в ферментёрах

2.6 Предварительная обработка культуральной жидкости, выделение и химическая очистка антибиотика

2.7 Сушка, контроль и расфасовка материала

2.8 Актинофагия и её значение в производстве антибиотиков

III. ПРИМЕНЕНИЕ АНТИБИОТИКОВ В СЕЛЬСКОМ ХОЗЯЙСТВЕ, В ПИЩЕВОЙ И КОНСЕРВНОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

3.1 Антибиотики в растениеводстве

3.2 Антибиотики в животноводстве

3.3Антибиотики в пищевой промышленности

3.4 Антибиотики в консервной промышленности

3.4 Антибиотики и сохранение молока и молочных продуктов

IV. Влияние антибиотиков на организм

4.1 Проблемы применения антибиотиков

4.2 Непосредственное действие антибиотиков на организм животного

4.3 Влияние немедицинских антибиотиков на человека

4.4 Действие антибиотиков на микрофлору кишечника животных

4.5 Последствия использования антибиотиков

Заключение

Список использованных источников

ВВЕДЕНИЕ

антибиотик культивирование посевной организм

С открытием и применением первого антибиотика началась новая эра в истории человечества. Использование антибиотиков не только спасло многие миллионы человеческих жизней, но и выявило их значительную эффективность в борьбе с заболеваниями животных и растений.

Эпоха антибиотиков рассматривается многими учёными как эпоха «демографического взрыва». Они считают, что именно антибиотики снизили смертность от инфекционных заболеваний, обеспечивая тем самым интенсивный рост народонаселения на нашей планете. Так же антибиотики приобрели социальное значение. Они увеличили среднюю продолжительность жизни, и изменили соотношение возрастных групп. Антибиотики повлияли и на экономику благодаря повышению эффективности массовых лечебных мероприятий, и на распределение сил и средств, которые были вовлечены в сеть лечебно-профилактических учреждений.

До изобретения антибиотиков любое воспаление лёгких могло привести к смерти, любое ранение могло привести к заражению крови и как следствие к гибели, а скарлатина протекала очень тяжело, часто с тяжёлыми осложнениями и даже со смертельным исходом. Процент смертности от пневмонии до 1940-х составляла 20-30%. Множество раненных солдат во Вторую мировую войну погибали не на полях сражений, а в госпиталях от гангрены и заражения крови. Различные эпидемии уносили множество голов сельскохозяйственного скота, нанося огромный ущерб сельскому хозяйству.

С открытием антибиотиков врачи получили невиданные до этого возможности. Они оказались способными лечить сифилис, гонорею, пневмонию, туберкулёз. Многие заболевания кожи стали подчиняться простому лечению. Так же изменилась ситуация в сельском хозяйстве. Ещё в 1943 году были проведены первые опыты по использованию малых доз пенициллина для ускорения роста скота и домашней птицы. Эти опыты были крайне необходимы во время войны, так как недостаток продовольствия затронул практически все страны.

Вместе с тем, нисколько не умаляя ценности применения антибиотиков, необходимо трезво учитывать нежелательные явления, возникающие в результате применения антибиотиков. К таким последствиям можно отнести выработку микроорганизмами лекарственной устойчивости, нарушение в макроорганизме эволюционно сложившихся биоценозов резидентных микроорганизмов, повреждение антибиотиками ряда систем микроорганизма и в первую очередь иммунной системы, что ведёт к снижению его защитных сил, а также появление сенсибилизации.

Цель данной курсовой работы - изучить процессы производства антибиотиков и их применение и безопасность в агропромышленном комплексе.

Для написания этой курсовой использовались данные книг по микробиологии.

I. ИСТОРИЯ ПРИМЕНЕНИЯ, ТЕРМИНОЛОГИЯ И КЛАССИФИКАЦИЯ АНТИБИОТИКОВ

1.1 Из истории

Разработка и производство антибиотиков началась в конце XIX века. Первым антибиотиком, выпущенный в промышленное производство стал сальваран в 1910 году.

До этого в 1896 году Б. Гозио из жидкости, содержащей культуру гриба Penicillium brevicompactum выделил микофеновую кислоту, подавляющий рост возбудителя сибирской язвы Bacillus anthracis.

Р. Эммерих и О. Лоу в 1899 году сообщили об антибиотическом веществе, образуемом Pseudomonas pyocyanea, и назвали его пиоцианазой. Препарат использовали как местный антисептик.

В 1910-13 годах O.Black и U. Alsherg выделили из гриба рода Penicillium пеницилловую кислоту, обладающую антимикробными свойствами.

К сожалению эти и некоторые другие наблюдения и открытия не получили дальнейшего развития, но они оказали огромное влияние на более поздние исследования в области изучения биологически активных продуктов жизнедеятельности микроорганизмов.

В 1929 году Александр Флеминг случайно открыл новый препарат пенициллин, которое смогли получить в кристаллическом виде только в 1940 году. Это новое и весьма эффективное химиотерапевтическое вещество было получено в результате жизнедеятельности микроорганизма, то есть биосинтетическим путём.

Применение пенициллина в борьбе с различными инфекционными заболеваниями воспалительными процессами явилось мощным стимулом для поиска новых, ещё более эффективных антибиотических веществ образуемых различными группами микроорганизмов (бактериями, актиномицетами), низшими растениями (дрожжами, водорослями, плесневыми грибами, высшими грибами), высшими растениями и животными организмами.[1]

Настойчивые поиски продуцентов новых антибиотиков увенчались блестящими успехами.

В 1937 году О. Вельш описал первый антибиотик актиномицетного происхождения (актиномицин), в 1939г. Н.А. Красильниковым и А.И. Кореняко был получен линцетин и Дюбо-тиротрицин. Таким образом, к моменту получения пенициллина в очищенном виде уже было известно 5 антибиотических веществ. После этого число антибиотиков росло очень быстрыми темпами.[2]

Изучение пенициллина в Советском Союзе было начато З.В. Ермольевой.

В 1942 году под её руководством в лаборатории биохимии микробов Всесоюзного института экспериментальной медицины в Москве был получен первый отечественный пенициллин- крустозин, сыгравший огромную роль в спасении жизней воинов Советской Армии, раненных на полях сражений Великой Отечественной войны.

В январе 1944 году Москву посетила группа иностранных учёных, среди которых был профессор Г. Флори, привёзший английский штамм продуцента пенициллина. Сравнение двух штаммов показало, что советский штамм образует 28 ед/мл, а английский 20ед./мл пенициллина.

1.2 Терминология

Изначально, понятие «антибиотик» ввёл в 1942 году З. Ваксман. Он определил антибиотики как «химические вещества, образующихся микроорганизмами, которые обладают способностью подавлять рост и даже разрушать бактерии и другие микроорганизмы». Однако это понятие не совсем корректно. Оно не показывает различий между антибиотическими веществами и другими продуктами жизнедеятельности, которые обладают антимикробными действиями. Так на пример молочнокислые бактерии и Aspergillus niger выделяют молочную и лимонные кислоты, оказывающие подавляющее действие на микроорганизмы. К тому же антибиотики выделяют не только микроорганизмы, но и высшие растения (аллицин, выделенный из чеснока) и животные.[3]

Полностью синтетические препараты, не имеющие природных аналогов и оказывающие сходное с антибиотиками подавляющее влияние на рост бактерий, традиционно было принято называть не антибиотиками, а антибактериальными химиопрепаратами. В частности, когда из антибактериальных химиопрепаратов известны были только сульфаниламиды, принято было говорить обо всём классе антибактериальных химиопрепаратов как об «антибиотиках и сульфаниламидах». Однако в последние десятилетия в связи с изобретением многих весьма сильных антибактериальных химиопрепаратов, в часности фторхинолонов, приближающихся или превышающих по активности «традиционные» антибиотики, понятие «антибиотик» стало размываться и расширяться и теперь часто употребляется не только по отношению к природным и полусинтетическим соединениям, но и к многим сильным химиопрепаратам.[2],[3]

1.3 Общие сведения о производстве антибиотиков

После установления высоких лечебных свойств первого антибиотика -- пенициллина -- сразу же возникла задача организации его производства в больших количествах. На первом этапе промышленное получение этого препарата носило примитивный, экономически нерентабельный характер. Выращивание продуцента антибиотика осуществлялось на средах, находящихся в небольших сосудах (матрацы, молочные бутылки, колбы и др.), при поверхностном культивировании гриба. Процесс развития гриба продолжался 8--10суток. Такой способ культивирования гриба при, большой затрате труда давал весьма низкий выход антибиотика, и себестоимость препарата была соответственно очень высокой. Безусловно, такое получение антибиотика не могло удовлетворить возрастающие запросы медицины. В результате поисков путей наиболее рационального способа производства антибиотика был предложен метод глубинного выращивания гриба в специальных емкостях -- ферментерах или танках -- при продувании воздуха и перемешивании культуральной жидкости.

Производство антибиотиков -- хорошо развитая отрасль. В настоящее время она занимает одно из ведущих мест в производстве лекарственных препаратов. В ряде стран (США, Япония, Англия, Франция и др.) производство антибиотических веществ-- одна из прибыльных отраслей химико-фармацевтической промышленности. Так, в США ежегодно выпускается антибиотиков и их производных на сумму более 400 млн. долл.

Огромный спрос на антибиотические препараты со стороны медицины, сельского хозяйства, пищевой промышленности способствовал усиленному поиску новых антибиотиков и получению их в промышленных масштабах. Если в начале 40-х годов мировая промышленность выпускала всего лишь 2--3 антибиотика, то теперь это число превышает 200 названий.[4]

Одновременно с ростом числа новых антибиотиков быстро росло промышленное производство ценных препаратов (таблица 1) и снижалась их стоимость.

Таблица 1. Производство антибиотиков в США 1948-1961годах

Антибиотик	Производство, тонн
	1943	1950	1955	1957	1960	1961
Пенициллин	0,013	195	206	346	299	390
Стрептомицин	1,7	21	70	90	274	286
Неомицин	-	-	-	8	-	-
Антибиотики, широкого спектра действия	-	100	283	216	356	-
Антибиотики, применяемые в медицине	-	388	733	1076	1260	-
Антибиотики применяемые в ветеринарии и с кормами	-	-	236	394	544	-

При массовом промышленном выпуске пенициллина стоимость его в 1980 году снизилась в США до 0,02 долларов за 1 млн. ед. против 18 долларов в 1943 году, то есть за 37 лет снизилась в 900 раз. Аналогичные данные имеются и в отношении других антибиотиков. Так, 1 г основания стрептомицина в 1944 году в США стоил 15 долларов, а уже в 1959 году- 0,03 доллара.

Количество выпускаемого пенициллина с 13кг в 1943 году возросло в 1979 году до 14 800 тонн. В 1957 году было выпущено более 400 тонн антибиотиков широкого спектра (в основном тетрациклинов), в 1974 г. производство антибиотиков составило около 4000 тонн, а в 1977 году -5000 тонн.

Более 92 фирм мира производят антибиотики. В последнее время ежегодно производится 25 тыс. тонн антибиотиков, в том числе: 17 тыс, тонн пенициллинов на общую сумму 350 млн, долларов 5 тыс. тонн тетрациклином на 135 млн. долл., 1,2т цефалоспоринов на 100 млн. долл., 800тонн эритромицинов и 1000 тонн других антибиотиков.

В 1960 г. более 30% всех антибиотиков, выпускаемых в США, использовалось в ветеринарии и в сельском хозяйстве в качестве добавок к корму животным.

Наша страна по производству антибиотиков занимает одно из ведущих мест в мире.[5]

1.4 Классификация антибиотиков

По различным показателям известные антибиотики классифицируются следующим образом:

По спектру действия:

-антибактериальные, губительно действующие на грамположительные (бензилпенициллин, ристомицин, новобиоцин), грамотрицательные (полимиксин) бактерии, а также антибиотики широкого спектра действия (левомицетин, канамицин, мономицин, гентамицин);

-противогрибковые (нистатин, леворин, гризеофульвин);

-противоопухолевые, включающие в себя шесть групп: актиномицины, антракциклины, оливомицины, брунеомицины, блеомицины, а также такие интерфероны, как стоталон и эленин.

По химической структуре:

-ациклические (нистатин, кандицин);

-гетероциклические (гризеофульвин);

-макроциклические (макролидазы, эритромицины);

-ароматические (гигромицин);

-аминогликозидные;

-полипептазы (грамицидин, полимиксин);

-пенициллины;

-актиномицины;

-стрептомицины.

По молекулярному механизму действия: (рисунок 1)



Рисунок 1. Механизм действия антибиотиков на бактерии

-антибиотики, действующие на синтез бактерийной клеточной оболочки (пенициллины, ристомицин);

-антибиотики, нарушающие синтез белков (тетрациклины, макролиды, левомицетин);

-антибиотики, нарушающие синтез белков и порядок генетического кода (аминогликозиды); антибиотики, нарушающие синтез нуклеиновых кислот (противоопухолевые);

-антибиотики, нарушающие целостность цитоплазматической мембраны (противогрибковые).[7],[8]

В настоящее время описано более 6000 антибиотиков. Однако только 2 -3 % известных антибиотиков применяется на практике. Остальные из-за их токсичности, инактивации в организме и других причин не используются, большую часть выпускаемых антибиотиков составляют пенициллины, цефалоспорины, тетрациклины, эритрин, стрептомицин.[9]

II. ПРОИЗВОДСТВО АНТИБИОТИКОВ

2.1 Методы культивирования продуцентов антибиотиков

В современных условиях наиболее перспективным методом выращивания микроорганизмов -- продуцентов антибиотиков или других биологически активных соединений признан метод глубинного культивирования. Метод состоит в том, что микроорганизм развивается в толще жидкой питательной среды, через которую непрерывно пропускается стерильный воздух, и среда перемешивается.

Существует четыре основные модификации глубинного способа выращивания микроорганизмов.

Периодическое культивирование. При этом способе весь процесс развития микроорганизмов полностью завершается в одном ферментере, после чего ферментер освобождается от культуральной жидкости, тщательно промывается, стерилизуется, и вновь заполняется свежей питательной средой. Среда засевается изучаемым микроорганизмом и процесс возобновляется.

Отъемный метод. Культивирование микроорганизмов осуществляется в ферментерах с периодическим отбором части объема культуральной жидкости (от 30 до 60% общего объема.). При этом объем культуральной жидкости в ферментере доводится свежей питательной средой до исходного уровня.

Батарейный способ. Микроорганизмы развиваются в ряду последовательно соединенных ферментеров. Культуральная жидкость на определенной стадии развития микроорганизма перекачивается из первого ферментера во второй, затем из второго -- в третий и т. д. Освобожденный ферментер немедленно заполняется свежей питательной средой, засеянной микроорганизмом. При этом способе выращивания микроорганизмов емкости используются более рационально.

Непрерывное культивирование. Метод принципиально отличен от указанных модификаций глубинного культивирования продуцентов антибиотиков.

В основе метода лежит принцип непрерывного протока питательной среды, что позволяет поддерживать развитие микроорганизма на определенной стадии его роста. Стадия развития микроорганизма определяется тем, что в этот период происходит максимальный биосинтез антибиотика или другого биологически активного соединения.

При обычном процессе непрерывного культивирования продуцентов антибиотиков интенсивность биосинтеза антибиотического вещества, как правило, снижается по сравнению с периодическим культивированием. Несмотря на это, исследования по применению непрерывного культивирования для производства антибиотиков продолжаются.

Установлено, что в условиях непрерывного процесса биосинтеза некоторых антибиотиков можно получить хорошие результаты, если процесс вести в две стадии: в нервом аппарате батареи поддерживают высокую скорость потока, обеспечивающую большую скорость роста продуцента антибиотика, с тем чтобы получить молодую высокоактивную биомассу, а во втором аппарате обеспечивают низкую скорость потока и соответственно небольшую скорость роста.

Процесс непрерывного культивирования -- перспективное направление современной биотехнологии.[10]

2.2 Ферментеры

Для изучения условий образования антибиотиков и их производства в промышленных масштабах применяют ферментеры- специальные герметически закрытые емкости, в которых создаются хорошие условия для глубинного развития продуцента и биосинтеза антибиотика. Ферментер снабжен приспособления ми для достаточной аэрации и перемешивания культуры, поддержания необходимой температуры, а также контрольно-измерительными приборами (рисунок 2).

Рисунок 2. Ферментёр ёмкостью 50м3. 1-корпус аппарата, 2-теплообменник, 3-гильза для термометра, 4-барботер, 5-растяжки для центровки вала, 6-вал мешалки, 7-лопасть мешалки,8-стойка ферментёре, 9-соеденительная муфта вала, 10-привод мешалки, 11-мотор

Аэрирование культуры происходит в результате подачи стерильного подогретого до необходимой температуры воздуха через специальные приспособления -- барботеры -- и перемешивания культуральной жидкости различного типа мешалками (пропеллерными, турбинными), а также использования отбойников.

Аэрация культуры повышается при использовании мешалок новых конструкций. Такие мешалки во время работы засасывают воздух, который затем струями выталкивается вместе с культуральной жидкостью на поверхность среды. При этом происходит большее растворение кислорода благодаря его лучшему диспергированию в среде.

Поддержание температуры, оптимальной для хорошего роста продуцента антибиотика и проявления им повышенной физиолого-биохимической активности, обеспечивается рубашкой ферментера или системой змеевиков. Змеевики используются также для подачи пара в процессе стерилизации или воды для охлаждения.[11]

Наблюдение за основными процессами жизнедеятельности организма осуществляется контрольно-измерительной аппаратурой, позволяющей поддерживать на заданном уровне температуру внутри ферментера, рН среды, количество пропускаемого воздуха, давление внутри ферментера и другие параметры. Применяются установки, позволяющие автоматически определять содержание азота в среде в ходе развития организма. Ферментеры снабжены приспособлениями для переноса инокулята, внесения дополнительных питательных веществ, необходимых для лучшего развития продуцента, пеногасителя и устройством для взятия проб. Б современных ферментерах контрольно-измерительная аппаратура соединена с электронно-вычислительной машиной, что позволяет автоматически контролировать весь биосинтетический процесс по заданной программе.

В зависимости от характера работ используют разные типы ферментеров: лабораторные, полупроизводственные, производственные.

Лабораторные ферментеры изготовляют из стекла или нержавеющей стали и имеют, как правило, емкость не более 30 л. Обычно стерилизуют такие ферментеры в автоклавах. Питательную среду, как правило, стерилизуют отдельно, а затем переносят в стерильный ферментер.

Полупроизводственные ферментеры имеют емкость 100 л, выполнены из нержавеющей стали.[12]

Производственные ферментеры. В промышленных условиях получения антибиотиков применяют ферментеры различной емкости -- от 500 л до 50 и 100 м3.

Стерилизация полупроизводственных и производственных ферментеров, а также всех обслуживающих их коммуникаций осуществляется перегретым паром. Воздух, необходимый для аэрации, стерилизуют путем фильтрации через специальные, фильтры, заполненные стеклянной ватой или активированным древесным углем. Использование волокнистых фильтров (типа стеклянной ваты) -- широко распространенный и экономически наиболее выгодный механический способ стерилизации воздуха, причем «ем меньший диаметр имеют волокна материала, тем лучше их фильтрующая способность.

Интересно, что проникновение в фильтр бактериальных клеток или спор, перемещающихся с воздушным потоком, зависит от скорости движения воздуха. Проникновение усиливается с повышением скорости воздуха и достигает максимума в границах 10--26см/с (в зависимости от плотности упаковки фильтра); при дальнейшем увеличении скорости движения воздуха проникновение частиц уменьшается.[13]

2.3 Стерилизация питательных сред

Для каждого продуцента антибиотика разрабатывается оптимальная питательная среда. Среда должна соответствовать определенным требованиям: а) обеспечивать максимальный выход антибиотика, б) состоять из относительно дешевых компонентов, в) иметь хорошую фильтрующую способность и г) обеспечивать применение наиболее экономичных приемов выделения и очистки антибиотиков.

Стерилизация питательных сред в промышленных условиях осуществляется двумя основными методами: периодическим и непрерывным.

Периодический метод стерилизации применяется при использовании небольших объемов среды и состоит в том, что среда нагревается до температуры 120--130°С непосредственно в ферментерах или в специальных котлах-стерилизаторах, выдерживается при этой температуре в течение 30--60 минут (в зависимости от объема среды и ее состава), после чего охлаждается до 27--30 °С.

За время, затрачиваемое на нагрев среды до температуры, необходимой для стерилизации, и ее охлаждение, уничтожается значительное число микроорганизмов. Известно, что для нагревания до температуры стерилизации больших объемов среды и затем ее охлаждения требуется больше времени, чем для маленьких объемов, а поэтому время, затрачиваемое на поддержание наиболее высокой стерилизующей температуры в больших объемах, может быть меньшим, чем для небольших объемов с тем же эффектом стерилизации.

Эффект стерилизации и сохранение термолабильных веществ среды достигаются в том случае, если стерилизацию проводят при более высокой температуре и за более короткое время.

Непрерывный метод стерилизации целесообразно применять при использовании больших объемов среды. Приготовленная среда из специального сосуда с помощью насоса подается в стерилизационную колонку, через которую пропускают острый пар (давление пара около 5С5Па). Пар подают сверху по внутренней трубе, имеющей щелевидные прорези, благодаря чему он поступает в среду, быстро ее нагревая. Среда в колонку подается снизу и движется по спирали вокруг внутренней трубы.

Среда, нагретая в колонке до необходимой для стерилизации температуры (около 130°С), поступает в специальный аппарат, где она выдерживается определенное время при температуре 125--130°С. Время выдержки зависит от состава среды и длится 5--10 мин. Отсюда стерильная среда поступает в змеевиковый холодильник, охлаждается до 30--35 °С (на выходе) и поступает в ферментер.

Непрерывный метод стерилизации имеет ряд преимуществ: возможность автоматического регулирования процесса, быстрый и равномерный нагрев среды, обеспечение более полной стерильности среды и др.

При применении в качестве отдельных компонентов субстрата термолабильных веществ их, как правило, следует стерилизовать отдельно в условиях более мягкого режима.[14]

2.4 Подготовка посевного материала

Подготовка посевного материала -- одна из ответственейших операций в цикле биотехнологического метода получения антибиотиков. От количества и качества посевного материала зависит как развитие культуры в ферментере, так и биосинтез антибиотика. Продуцент антибиотика обычно выращивают на богатых по составу натуральных средах, способных обеспечить наивысшую физиологическую активность микроорганизмов. Подготовка посевного материала -- процесс многоступенчатый (рисунок 3).

Микроорганизм предварительно выращивают на агаризованной среде в пробирке (рисунок 3, 2) затем из пробирки делают высев в колбы с жидкой питательной средой и проводят две генерации при глубинном выращивании на качалках в течение 2--З суток для каждой генерации (За, 3б). Из второй генерации культуры в колбе делают посев в небольшой (10 л) инокулятор 4, после чего хорошо развившуюся культуру переносят в более крупный инокулятор 5 (100--500 л), откуда и делают посев в основной ферментер 6. Для посева в основной ферментер используют от 5-до 10об.% посевного материала (инокулята). Однако при получении пенициллина споровый материал гриба, приготовленный на отрубях, рисовых зернах или пшене, засевают в инокулятор сразу.[13]



Рисунок 3. Схема многоступенчатого приготовления посевного материала. А-выращивание во флаконах. Б- в колбах и качалках.

1-закончервированный исходный материал, 2- споровая генерация на косом агаре в пробирке, 3-II споровая генерация на твёрдой среде в сосуде, 3а, 3б-I и III генерации на жидкой среде в колбе, 4- ферментёр предварительного иннкулирования, 5- ферментёр инокулирования, 6- основной ферментёр.

2.5 Развитие продуцента антибиотика в ферментерах

Развитие микроорганизма в ферментерах проходит при строгом контроле всех его стадий и очень точном выполнении регламента условий развития. Большое внимание уделяют поддержанию заданной температуры культивирования, активной кислотности среды (рН), степени аэрации и скорости работы мешалки. В процессе развития организма осуществляют биологический контроль, учитывают потребление организмом основных питательных компонентов субстрата (источника углерода, азота, фосфора), внимательно следят за образованием антибиотика. В последнее время все чаще биологический контроль проводят с помощью ЭВМ.

Большое внимание при развитии продуцента в ферментерах обращают на процесс пеногашения. При продувании воздуха через культуру микроорганизма образуется обильная пена, которая существенно нарушает процесс развития продуцента антибиотика в ферментере. Появление большого количества пены обусловлено-белковыми веществами, находящимися в среде, и ее высокой вязкостью, что связано с обильным накоплением биомассы.

Для борьбы с пеной в ферментерах используют поверхностно-активные вещества: растительные масла (соевое, подсолнечное), животный жир (лярд, кашалотовый жир), а иногда минеральные масла (вазелиновое, парафиновое), спирты и высшие жирные кислоты. Нередко в качестве пеногасителей используют специально синтезированные вещества (силиконы, диазобутанкарбамил и другие соединения).

Многие вещества (масла, жиры, спирты и др.), используемые в качестве пеногасителей, потребляются продуцентами антибиотиков как дополнительные источники углеродного питания. При этом часто наблюдается повышение выхода антибиотика. Однако внесение пеногасителя может снижать скорость растворения кислорода, что, в свою очередь, отрицательно сказывается на развитии микроорганизма и его биосинтетической активности.

Иногда используются механические способы пеногашения (отсасывание пены через специальные трубы, разрушение пузырьков пены сильными струями жидкости, пара или газа).

Общая схема производства антибиотиков до стадии выделения и химической очистки представлена на рисунке 4.[14]



Рисунок 4. Схема производства антибиотиков

Схема производства антибиотиков: I - приготовление посевного материала, II - ннокуляторы для наращивания посевного материала; III - стерилизатор среды для большого ферментера, IV -- установка для биосинтеза антибиотика, а - стерилизация среды в колбах, б - охлаждение и посев культуры продуцента в колбу, в - рост культуры в покое, г - рост культуры в качалке, д - инокулятор со стерильной средой, е - инокулятор со средой, засеянной культурой продуцента, ж - фильтры и компрессор, з - резервуар со сжатым воздухом, и - нагрев воздуха, к- ферментер, л-рубашка для охлаждения ферментера

2.6 Предварительная обработка культуральной жидкости, выделение и химическая очистка антибиотика

В процессе развития микроорганизмов образуемые ими антибиотики в большинстве случаев почти полностью выделяются из клеток в окружающую среду. Однако в ряде случаев в культуральную жидкость попадает лишь часть антибиотика, а другая часть сохраняется внутри клеток.

У ряда продуцентов антибиотик почти полностью содержится в клетках организма.

В зависимости от того, где антибиотическое вещество сосредоточено, применяют соответствующие методы его извлечения. Так, если антибиотик находится в культуральной жидкости, его выделяют методами экстракции, используя для этого растворители, не смешивающиеся с жидкой фазой, осаждают в виде нерастворимого соединения или сорбируют ионообменными смолами. Выделяют антибиотик из клеток микроорганизмов с помощью экстракции органическими растворителями. Если антибиотик содержится в культуральной жидкости и в клетках продуцента, то сначала антибиотик переводят в фазу, из которой наиболее целесообразно его изолировать. Например, антибиотик, содержащийся в культуральной жидкости, и клетки с антибиотическим веществом переводят в осадок, из которого антибиотик экстрагируют.

Отделение нативного раствора от биомассы и взвешенных частиц проводят методами фильтрации или центрифугирования. Для фильтрации применяют фильтр-пресс, нутч-фильтр, друк-фильтр, центрифуги, сепараторы. Фильтр-прессы употребляют для обработки больших объемов культуральной жидкости. Аппараты состоят из ряда чередующихся плит и рам и фильтрующих перегородок между ними. Процесс фильтрации осуществляется под давлением.

Для фильтрации небольших объемов культуральной жидкости обычно используют нутч-фильтры или друк-фильтры. Первый аппарат работает под вакуумом, а во втором процесс фильтрации осуществляется благодаря поддержанию давления над фильтрующей жидкостью.[15]

Широко распространен и способ центрифугирования. Хорошие результаты получают в том случае, если при правильном выборе скорости подачи жидкости скорость вращения центрифуги достигает 15 000 об/мин. Отделять мицелий или другие взвешенные частицы можно также в сепараторах. При скорости вращения барабана сепаратора 7000--7500 об/мин благодаря центробежной силе твердые частицы устремляются к стенкам барабана и осаждаются там, а отсепарированная жидкость стремится к центру барабана и поднимается вверх в специальную камеру.

Цель химической очистки -- извлечение антибиотика из нативиой жидкости или из клеток продуцента, его концентрация и освобождение (собственно очистка) от сопутствующих примесей и в конечном счете получение высокоочищенного препарата, пригодного для соответствующего применения.

В ряде случаев антибиотические вещества под влиянием жестких внешних факторов (повышенная температура, высокая кислотность или щелочность и др.) теряют свои свойства, инактивируются. Поэтому при их выделении и очистке необходимо соблюдать .максимум осторожности.

Основные методы очистки антибиотиков следующие

Метод экстракции. Нередко для очистки антибиотика от различных примесей его многократно переводят из одного растворителя в другой с предварительным осаждением (кристаллизацией). Такой прием носит название перекристаллизации.

Ионообменная сорбция. Метод состоит в том, что при пропускании водных растворов антибиотиков, являющихся по химической природе кислотами, основаниями или амфотерными соединениями, через колонки с соответствующими ионообменными смолами они сорбируются на них, а раствор с частью примесей, имеющих противоположный антибиотику заряд, проходит через колонку. Смолы в зависимости от положительного или отрицательного заряда их ионов называют катеонитами или аиионитами. Антибиотик (как отрицательно заряженный ион) будет сорбироваться на катионитной смоле и наоборот. Адсорбированный на смоле антибиотик элюируют (десорбируют), в результате чего получают значительно очищенный и концентрированный препарат. Затем раствор этого препарата можно вновь пропустить через ионообменную смолу, но имеющую противоположный заряд. При этом на смоле осядут примеси, а раствор более очищенного антибиотика пройдет через колонку.

Метод осаждения. Антибиотик связывают с органическими или неорганическими веществами для получения соединения, выпадающего в осадок; последний с помощью фильтров или центрифугирования отделяют от нативного раствора, промывают и в ряде случаев высушивают. Образовавшееся соединение растворяют, антибиотик экстрагируют или вновь осаждают (кристаллизуют).

Одна из стадий химической очистки антибиотиков -- концентрирование полученных растворов; достигается отгонкой большей части растворителя, как правило, в высоком вакууме.

Применяемые методы выделения и химической очистки, а также качество оборудования и используемых реактивов имеют большое значение прежде всего для улучшения качества получаемого антибиотика и увеличения выхода препарата.[16]

2.7 Сушка, контроль и расфасовка материала

После выделения и химической очистки антибиотика его необходимо высушить, т. е. удалить из препарата свободную и связанную воду. Поскольку большинство антибиотиков в той или иной степени термолабильны, для их высушивания применяют методы не приводящие к потере биологической активности, не изменяющие цвета препарата. На современном этапе промышленного получения антибиотиков используют следующие методы обезвоживания.

Лиофильная сушка антибиотиков -- широко распространенный прием; проводится при сравнительно низких температурах (--8--12 °С).

Высушивание с применением распылительной сушилки -- прогрессивный метод при работе с большими количествами антибиотика; раствор антибиотика пневматически распыляется до мельчайших капель в камере с потоком нагретого воздуха. Процесс высушивания антибиотиков занимает несколько секунд. При этом даже термолабильные препараты не меняют свойств.

Метод взвешенного слоя или сушка в вакуум-сушильных шкафах применяется для высушивания зернистых и пастообразных антибиотических препаратов.

Контроль препарата. Готовый антибиотик подвергается тщательному контролю: биологическому и фармакологическому.

При биологическом контроле ставится задача выяснения стерильности готового препарата. Для этого обычно используют два метода.

Первый связан с инактивацией антибиотика и высевом его в соответствующую питательную среду. Например, биологически контроль бензилпенициллина и полусинтетических препаратов, полученных на его основе, проводится следующим образом. В пробирки, содержащие тиогликолевую среду, вносят фермент пенициллиназу в количестве, способном полностью инактивировать пенициллин. Пробирки с пенициллиназой выдерживают 2--3 суток при температуре 37°С для контроля стерильности фермента, затем в них вносят раствор пенициллина. Пробирки разделяют на две группы: одну выдерживают при 37 0С, а другую -- при 24°С в течение 5 суток. Ведут ежедневное наблюдение за возможным развитием микроорганизмов.[17]

Второй метод выяснения стерильности антибиотиков определяется тем, что для большинства этих соединений не имеется инактиватеров их биологической активности. Поэтому у изучаемых препаратов выявляют устойчивые к ним формы микроорганизмов, а также определяют возможное присутствие чувствительной микрофлоры. Для определения возможного присутствия в таких препаратах чувствительной к ним микрофлоры раствор антибиотиков, пропускают через мембранные фильтры с диаметром пор не более 0,75 мк.

Необходимо подчеркнуть, что стерильность готового антибиотика обеспечивается соблюдением стерильных условий работы на всех стадиях процесса развития продуцента, выделения и очистки препарата.

Фармакологический контроль. К антибиотическим веществам, используемым в медицинской практике, в соответствии с Государственной фармакопеей предъявляются очень строгие требования. Каждый новый лекарственный препарат, прежде чем он будет разрешен к практическому применению, должен пройти всесторонние испытания на токсичность, пирогенность и другие свойства, жизненно важные для организма. Препарат изучают на разных видах животных в отношении его острой и хронической токсичности (влияние на кровь, центральную нервную систему, дыхание и т. д.). Показатели острой токсичности -- один из критериев качества антибиотического вещества. Устанавливают максимально переносимую дозу (МПД) антибиотика, дозу, вызывающую гибель 50% подопытных животных (LD50), и смертельную дозу (LD100). Только после всестороннего и тщательного изучения препарата он может быть рекомендован к практическому применению.

Расфасовка и упаковка антибиотика -- завершающий этап работы. Расфасованный и упакованный антибиотик с указанием показателя биологической активности, даты выпуска и срока годности поступает в продажу.

Обобщая весь многостадийный и многоступенчатый процесс получения антибиотика, можно отметить, что он включает в себя четыре основные стадии.

I стадия. Получение соответствующего штамма -- продуцента антибиотика, пригодного для промышленного производства.

II стадия непосредственно связана с процессом биосинтеза ан тибиотика.

III стадия -- это процессы выделения и очистки образовавшегося в ходе биосинтеза антибиотика.

IV стадия включает в себя операции, связанные с концентрацией антибиотика, его стабилизацией и получением готового продукта.

Важно подчеркнуть, что на всех стадиях получения антибиотика должна строго соблюдаться технологическая дисциплина, все процессы должны осуществляться только в стерильных условиях.

Строгое соблюдение технологического процесса на II стадии обеспечивает возможность максимального выхода антибиотика и конечного продукта. Особое внимание должно быть обращено на III стадию, связанную с выделением и очисткой антибиотика. При нарушении технологической дисциплины и использовании не соответствующего тем или иным операциям оборудования или его неисправности происходят большие потери антибиотика, которые могут нанести предприятию существенный экономический урон.

Биотехнологический процесс получения антибиотиков можно представить в виде следующей обобщенной схемы (рисунок 5).

Анализируя схему биотехнологического процесса получения антибиотиков, можно заметить, что все четыре основные стадии сохранились с конца 40-х годов, когда было начато промышленное производство этих биологически активных веществ, до настоящего времени.

Безусловно, на всех этапах производства антибиотиков введены операции и процессы, соответствующие современным достижениям научно-технического прогресса. Так, существенно дополнена I стадия, связанная с получением высокопродуктивных штаммов-продуцентов. Если метод индуцированного мутагенеза со ступенчатым отбором начиная с 50-х годов и до настоящего времени остался основным методом повышения антибиотической активности промышленных штаммов микроорганизмов, то индуцированного мутагенеза со ступенчатым отбором начиная с 50-х годов и до настоящего времени остался основным методом повышения антибиотической активности промышленных штаммов микроорганизмов, то в современных условиях благодаря успехам молекулярной биологии для этих целей стали шире использоваться другие методы, в том числе метод слияния протопластов и метод конструирования микроорганизмов е помощью генно-инженерных манипуляций.

Рисунок 5. Схема производства антибиотиков в процессе микробного синтеза

Многие параметры процесса культивирования продуцентов антибиотиков в ферментерах больших объемов контролируются автоматически с выводом показателей на компьютеры.

Совершенствуются методы выделения и очистки антибиотиков.[18]

2.8 Актинофагия и её значение в производстве антибиотиков

В природе широко распространены фаги, вызывающие лизис актиномицетов, или актинофаги. Они довольно легко обнаруживаются в разных типах почв. Наибольшее количество актинофагов выделяется из черноземной, перегнойной и подзолистой почв.

Впервые явление лизиса актиномицета под действием фагов было обнаружено С. Ф. Дмитриевым в 1934 году исследователь наблюдал лизис мицелия Streptomyces bovis при выращивании его в жидких средах. При дальнейшем изучении этого явления было установлено, что лизис в культурах актиномицетов могут вызывать не только фаги, но и другие причины, например автолиз, или самопереваривание, клеток.

Интенсивное изучение актинофагии началось в связи с промышленным получением антибиотиков, образуемых актиномицетами. В 1947 году Ц.3.Рогинская и В.И. Любимов доложили в Академии наук СССР об обнаружении фага, лизирующего культуру продуцента стрептомицина. Было показано, что фаг, выделенный из культуры S. griseus, обладает высокой специфичностью и поражает только продуцент стрептомицина, не лизируя другие штаммы S. griseus.

Фаг, вызывающий лизис культуры актиномицета-- продуцента стрептомицина, не инактивируется при содержании его в течение часа при температуре 75°С, но полностью теряет активность а течение 10 мин при нагревании до 100 °С.

Актинофаги, как и бактериофаги, способны лизировать только молодую, активно развивающуюся культуру микроорганизма. Технологический процесс получения антибиотиков весьма благоприятен для развития фагов в случае попадания их в ферментеры. При заражении культуры актинофагом происходит почти полный лизис мицелия актиномицета и резкое снижение биосинтеза стрептомицина. Лизис культур актиномицетов под действием фагов в заводских условиях причиняет значительный материальный ущерб антибиотической промышленности. Фаголизис актиномицетов-- продуцентов антибиотиков наблюдается при промышленном получении стрептомицина, тетрациклинов, эритромицина, новобиоцина. Он может иметь место и при производстве других антибиотических веществ.

Активность фага зависит от особенностей культуры, состава среды культивирования актиномицета и стадии процесса развития организма.

Относительно источников попадания фага в ферментеры при развитии актиномицета существуют различные взгляды. Одни авторы считают, что фаг не может попасть в ферментер с культурой актиномицета, так как ни одна из изученных культур S.griseus не содержала фаг. По их мнению, заражение фагом происходит на каком-то этапе производства, в частности фаги проникают с загрязненным воздухом. Однако данные других исследователей указывают на возможность выделения фага из музейных культур актиномицетов -- продуцентов стрептомицина.

Среди разнообразных видов актиномицетов, выделенных из почв, встречаются культуры, содержащие в себе фаг, то есть лизогенные. Один из возможных путей попадания фага при производстве антибиотика,-- занос его самой культурой актиномицета. Лизогенная культура устойчива к носимому ею фагу, поэтому освобождаемый культурой фаг обычно не находит условий для массового размножения. Однако в отдельных случаях из лизогенных культур актиномицетов выделяются актинофаги, способные лизировать культуру хозяина. По-видимому, это следствие того, что некоторые симбиотические фаги сравнительно легко изменяют свой литические свойства и становятся вирулентными по отношению к культуре хозяина. Следовательно, создаются условия для массового размножения видоизмененного фага, а это, в свою очередь, способствует накоплению фага в воздухе и на предметах оборудования производственных помещений, что может приводить к заражению фагом ферментеров.

Таким образом, инфицирование фагом может происходить как путем внесения фага одновременно с культурой актиномицета (при наличии лизогенных форм), так и на определенных этапах производственного процесса получения антибиотика.

Исходя из изложенного меры борьбы с фаговой инфекцией должны осуществляться путем комплекса мероприятий.

1. Выведение высокоактивных фагоустойчивых культур актиномицетов.

2. Борьба с распространением фага в производственных цехах и лабораториях.

3. Защита производственной культуры от фаговой инфекции.

Селекция фагоустойчивых культур актиномицетов основана на том, что под влиянием фагов у актиномицета может возникнуть множество вариантов с различными свойствами, в том числе и. варианты, обладающие фагоустойчивостью.

Метод получения фагоустойчивых культур актиномицетов состоит в следующем. На поверхность агаровой пластинки, содержащей фаг, высевают актиномицет. В этих условиях вырастут лишь отдельные фагоустойчивые колонии актиномицета. При отборе фагоустойчивых вариантов необходимо иметь в виду, что отдельные формы могут быть лизогенными, т. е. содержать фаг. Такие варианты при всех остальных положительных оценках не могут быть рекомендованы для производственных целей.

Актиномицеты, устойчивые к одному фагу, часто приобретают устойчивость и к другим фагам. Вместе с тем фаги, лизирующие S. griseus, обладают литической активностью и в отношении других видов актиномицетов (S. viridis, S. olivaceus, S. griseolis).

Большинство фагов, выделенных из почвы, -- полифаги, то есть способны лизировать от 45 до 90% культур актиномицетов разных видов.

Для борьбы с распространением фага в производственных помещениях рекомендуется систематическая обработка стен, оборудования и пола заводских помещений дезинфицирующими средствами, убивающими фаг (гипохлориды, соли хлорноватистой кислоты и др.). Лизис культуры S.griseus под действием фага при выращивании актиномицета в ферментерах можно предотвратить добавлением к среде цитратов оксалатов. Защита производственной культуры от фаговой инфекции осуществляется путем тщательной стерилизации сред, аппаратуры, оборудования и коммуникаций, строгого соблюдения стерильности на всех производственных этапах. [19]

III. ПРИМЕНЕНИЕ АНТИБИОТИКОВ В СЕЛЬСКОМ ХОЗЯЙСТВЕ И В ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

Антибиотики нашли применение не только в медицинской практике, но и в сельском хозяйстве, в пищевой и консервной промышленности. Что касается использования антибиотических веществ в медицине, то об этом говорилось при рассмотрении отдельных антибиотиков. В настоящей главе я кратко рассмотрю вопрос о применении этих физиологически активных веществ в растениеводстве, животноводстве, в пищевой и консервной промышленности.[20]

3.1 Антибиотики в растениводстве

За последние 80 лет проведено много исследований, посвященных использованию антибиотиков в борьбе с фитопатогенными организмами, наносящими ущерб сельскому хозяйству.

Известно, что заболевания растений вызываются разными группами фитопатогенных организмов: вирусами, бактериями, грибами, простейшими и др. Поражение растений происходит как при развитии в полевых условиях, в садах, так и в теплицах и оранжереях.

Источниками заражения растений фитопатогенными организмами могут быть семена (с наружной и внутренней инфекцией), растительные остатки, посадочный материал (черенки, саженцы, клубни, корнеплоды) и сама почва.

Биологические средства защиты растений по сравнению с химически синтезированными препаратами (пестицидами) экологически более чистые и безвредные. Поэтому им в последнее время отдается предпочтение.

При выборе антибиотика для борьбы с возбудителем заболевания и очагом его распространения, а также способа применения препарата основное внимание обращают не только на биологический эффект, но и на экономическую сторону, и на экологические аспекты. Назначение препарата и метод его применения должны быть экономически выгодными и экологически безвредны.

Основные требования, предъявляемые к антибиотикам, используемым в борьбе с фитопатогенными организмами, сводятся к следующему: 1) антибиотик должен быть активным против возбудителя заболевания, обладать специфичностью биологического действия; 2) легко проникать в ткани растений; 3) лечебные дозы должны быть безвредными для растения; 4) антибиотик на поверхности и внутри растения не должен быстро инактивнроваться, но, попадая в почву, легко разлагаться там; 5) обладать биологическим действием внутри тканей растения; 6) не наносить ущерба окружающей среде.

Одно из существенных требований к антибиотикам, применяемым в сельском хозяйстве, то, что они не должны использоваться в медицинской практике.[20],[21]

Методы использования антибиотиков выбирают в зависимости от вида заболевания (сосудистый вилт, поражение листьев и др.), стадии развития растения, размеров растения, места произрастания и способа посадки. Наиболее широкое применение имеют непосредственная обработка почвы, обрызгивание или опыливание антибиотиком наземных частей растений, смачивание семян, корней или других органов растворами антибиотиков и др.

Все приемы использования антибиотиков основаны на том, что препарат, нанесенный на поверхность листьев, ствола (стебля), семян или же внесенный в почву, задерживает рост или убивает фитопатогенные организмы, находящиеся как на поверхности так и внутри органов и тканей растения.

Антибиотики, нанесенные на наземные части растений или внесенные в почву, проникают в растение через корневую систему, стебель или листья и довольно быстро расходятся по растению. Однако такие антибиотики, как глобиспорин и гризеофульвин, распространяются по тканям и органам растения очень медленно.

Попав в растение, антибиотики сохраняются в его тканях сравнительно долго -- от 5 до 20 суток.

Внесение антибиотиков в почву. Растворы антибиотиков, внесенные в почву, поглощаются корневой системой растений и через некоторое время в зависимости от вида растения и свойств антибиотика обнаруживаются как в тканях корней, так и в наземных частях (таблица 2).

Таблица 2 Поступление из почвы в растениях антибиотиков, внесённых извне

Данные таблицы 6 свидетельствуют о том, что ткани растений могут содержать значительные концентрации антибиотика, поступившего через корневую систему. Такого количества вполне достаточно для задержки роста или подавления развития патогенных форм микробов.

При погружении корневых систем в растворы антибиотиков уже через 10--20 минут препараты обнаруживаются в различных органах растений. Установлено, что пенициллин накапливается в листьях избирательно. При обработке семян антибиотиками последние быстро проникают в оболочку и зародыш и сохраняются там продолжительное время.

При внесении антибиотиков в почву с целью борьбы с фитопатогенными организмами встречается ряд серьезных препятствий. Прежде всего в почве антибиотики быстро разрушаются под влиянием продуктов жизнедеятельности почвенных микробов и по другим причинам. Кроме того, антибиотики потребляются почвенными организмами в качестве питательных веществ. Многие антибиотики основной природы необратимо адсорбируются коллоидами почвы, поэтому внесение их непосредственно в почву в ряде случаев может оказаться нерентабельным мероприятием.

Опрыскивание пораженных растений растворами антибиотиков. Метод мол-сет быть использован на протяжении всего периода вегетации таких растений, как фруктовые деревья, овощи и другие сельскохозяйственные культуры. Опрыскивание растений антибиотиками оказывает защитное действие против мучнистой росы огурцов, а также его применяют в борьбе с Xamthomonas juglahdis, вызывающим заболевание грецкого ореха, и с X. vesicatoria, поражающим томаты и перец.[21]