Определение содержания консервантов (бензойной и сорбиновой кислот) в пищевых продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Размещено на http://www.allbest.ru/

Введение

Преддипломная практика была пройдена на одном из молодых предприятий города Дзержинска «Химаналитсервис»

Консервирование пищевых продуктов (лат. conservaге хранить, сохранять) -- обработка пищевых продуктов, предохраняющая их от порчи и обеспечивающая длительную сохранность.

Технический прогресс в технологии консервирования позволил внедрить в практику методы, обеспечивающие высокую устойчивость продуктов питания при длительном хранении с сохранением их пищевых, вкусовых и биологических свойств.

Целью данной работы является количественное определение содержания консервантов (бензойной и сорбиновой кислот) в пищевых продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Во время прохождения практики решаются следующие задачи:

- знакомство с жидкостным хроматографом, алгоритмом работы с ним;

- знакомство алгоритмом проверки концентрации консервантов;

- ознакомление с видами консервантов;

- сбор и систематизация материалов.



1.Консервирование пищевых продуктов

1.1 Защита пищевых продуктов

В пищевом продукте могут происходить физические, химические, биохимические и микробиологические процессы, отрицательно влияющие на его качество. Мы рассмотрим только микробиологическую порчу пищевых продуктов и вещества, которые такую порчу замедляют или предотвращают.

Микробиологическая порча пищевых продуктов происходит при наличии определённых условий, необходимых для протекания биологических процессов:

1. Наличие возбудителей порчи. Микробиологическая порча пищевого продукта невозможна, если на его поверхности или внутри него отсутствуют микроорганизмы.

2. Наличие доступных для микроорганизмов питательных веществ. Если таковые отсутствуют, то микроорганизмы не могут развиваться.

3. Наличие благоприятных для жизнедеятельности микроорганизмов температуры, активности воды, концентрации кислорода, окислительно-восстановителъного потенциала, концентрации ионов водорода (рН). Если эти условия неблагоприятны, микроорганизмы или не будут развиваться вовсе, или их развитие будет замедленным.

4. Достаточно длительное время хранения пищевого продукта. Если пищевой продукт будет использован до того, как начнётся нежелательный рост микроорганизмов, мероприятия против микробиологической порчи излишни.

1.2 Способы консервирования

Под консервированием продуктов питания понимается совокупность мер, направленных против различных видов порчи. В более узком смысле под консервированием понимают действия, направленные против микробиологической порчи. Для этого издавна пользуются двумя принципиально отличающимися методами: физическим и химическим. В последнее время активно обсуждаются методы биологического консервирования пищевых продуктов

При консервировании необязательно уничтожать имеющиеся микроорганизмы. Важнее создать условия, в которых они не могли бы испортить пищевой продукт.

Физические методы консервирования заключаются в том, что пищевой продукт подвергают физическому воздействию, которое препятствует росту микробов. Самые известные из них - стерилизация и пастеризация (воздействие нагреванием), охлаждение и замораживание (воздействие холодом), сушка (удаление воды) и облучение.

Химические методы консервирования заключаются в добавлении более или менее хорошо известного химического соединения, которое подавляет развитие микроорганизмов или уничтожает их. Такие вещества называют консервантами. Различают консерванты в широком и в узком смысле этого слова. К первым относят, например, соль и уксус, ко вторым - сорбиновую и сернистую кислоты. Существенное отличие между этими группами заключается в используемых концентрациях. Первые применяются в концентрациях выше 0,5-1%, а для вторых из-за их более сильного антимикробного действия достаточно 0,5% и менее.

При биологических способах консервирования к продуктам питания добавляют очищенные культуры определенных микроорганизмов, которые оказывают тормозящее действие на возбудителей порчи. Такие культуры называют защитными.



2. Определение консервантов в продуктах питания

Как технологам, так и юристам необходима возможность обнаружить консервант в пищевом продукте и определить его количество.

2.1 Качественный анализ

Поскольку пищевые консерванты не составляют единого класса химических соединений, для них нельзя подобрать общий способ подготовки проб и общий метод анализа. Чтобы обнаружить наличие консерванта, можно использовать неспецифический микробиологический тест. Для этого в исследуемый продукт (иногда после соответствующего разбавления) вносят известные штаммы микроорганизмов, против которых активен предполагаемый консервант, и в течение определенного времени наблюдают, происходит ли размножение микроорганизмов. Многие из них (особенно дрожжи) выделяют углекислый газ, количество которого может быть измерено. Этот способ, под названием «тест на брожение», раньше имел определённое значение, однако сегодня применяется редко из-за недостаточной специфичности.

В литературе описаны химические и инструментальные способы определения практически всех пищевых консервантов.

2.2 Количественный анализ

Большинство продуктов питания имеет чрезвычайно сложный состав, и отдельные их компоненты могут мешать определению консервантов. По этой причине, а иногда и для концентрирования, сначала выделяют консерванты из анализируемого продукта. Для этого используются экстракция, отгонка с водяным паром или специальные методы. Выделенную субстанцию после предварительной очистки подвергают собственно анализу. Эта последовательность действий называется подготовкой проб.

Для количественного анализа консервантов используются газовая, тонкослойная или жидкостная хроматография, химические, колориметрические, фотометрические и другие методы. Всё большее распространение получает высокоэффективная жидкостная хроматофафия (ВЭЖХ).



3. Характеристики исследуемых консервантов

В нашей работе мы будем исследовать в качестве консервантов сорбиновую и бензойную кислоты.

3.1 Сорбиновая кислота

3.1.1 Синонимы

IUPAC: гекса-2,4-диеновая кислота.

3.1.2 Историческая справка

Сорбиновая кислота впервые получена Гофманом в 1859 году из рябинового сока. Её антимикробное действие было обнаружено в 1939 году Мюллером (Германия) и независимо, несколькими месяцами позже, Гудингом (США). Промышленное производство сорбиновой кислоты началось в середине 50-х годов. С тех пор она во всё возрастающих масштабах используется для консервирования пищевых продуктов. Вследствие физиологической безопасности и органолептической нейтральности сорбиновую кислоту всё чаще предпочитают другим консервантам.

3.1.3 Товарные формы, производные

Сорбиновая кислота применяется как в свободном виде, так и в виде калиевой и кальциевой солей и поставляется в различных формах (порошок, гранулы, растворы). Эфиры сорбиновой кислоты и низших алифатических спиртов также проявляют консервирующее действие, но из-за своего интенсивного запаха в качестве консервантов пищевых продуктов не применяются.



3.1.4 Токсиколого-гигиеническая оценка

Сорбиновая кислота раздражает слизистые оболочки и неповреждённую кожу только у особо чувствительных людей. Аллергенность её чрезвычайно мала.

3.1.5 Законодательные аспекты применения в пищевых продуктах

Сорбиновая кислота, сорбаты калия и кальция разрешены во всех странах мира для консервирования многих пищевых продуктов. Разрешённые максимальные количества (за некоторым исключением) составляют от 0,1 до 0,2%. Вследствие несомненной гигиенической безопасности повсюду в мире наблюдается тенденция использования сорбиновой кислоты вместо других, менее проверенных, консервантов.

3.1.6 Области применения

Жировые продукты. Сорбиновая кислота имеет благоприятный (в сравнении с другими консервантами) коэффициент распределения между маслом и водой, в результате чего в водомасляных эмульсиях сравнительно высокая доля сорбиновой кислоты (сорбатов) остаётся в водной фазе, а именно эта фаза и подвержена микробиологической порче. При консервировании маргарина сорбиновая кислота используется в концентрации 0,05-0,1%|. Её добавляют к жировой фазе, а сорбат калия - к водной.

Сорбаты применяются в майонезах (которые представляют собой эмульсии типа «масло в воде» или обратного типа и склонны к микробиологической порче) и деликатесных продуктах, содержащих майонез. Для предотвращения развития молочнокислых бактерий в слабокислые продукты вводят смесь сорбата калия и бензоата натрия.

Молочные продукты. Сыры всех сортов - главная область использования сорбиновой кислоты. Её применяют в качестве консерванта вследствие эффективности при высоких значениях рН и специфического действия на плесневые грибы . Сорбиновую кислоту и сорбаты применяют для твёрдых сыров как во время созревания, так и при хранении в потребительской упаковке. При этом особую роль играет действие сорбиновой кислоты против микотоксинобразующих микроорганизмов .

Мясопродукты. Обработка 10-20%-м раствором сорбата калия подавляет рост плесневых грибов на твёрдых колбасах и сардельках . Предпринимались попытки защитить от возбудителей порчи и токсинобразующих микроорганизмов говядину и мясо птицы погружением их в 5-10%-й раствор сорбата калия. Вместе с разумным охлаждением и вакуумной упаковкой такой способ позволяет значительно увеличить срок годности.

Рыбопродукты. В сочетании с посолом, охлаждением и вакуумной упаковкой сорбиновая кислота оказывает антибактериальное действие на свежую рыбу и тем самым уменьшает образование триметиламина и других нежелательных пахучих веществ и подавляет рост патогенных микроорганизмов . Из-за достаточно высокой активности против плесневых грибов она применяется для консервирования склонной к плесневению сушёной рыбы, например трески. Большое практическое значение имеет использование сорбиновой кислоты в восточноазиатских рыбопродуктах слабого посола.

Овощные продукты. Сорбиновая кислота в виде водорастворимых сорбатов используется для консервирования ферментированных (квашеных) и маринованных овощей. Преимущество сорбатов в этом случае - относительно слабое действие сорбиновой кислоты против молочнокислых бактерий. Если к заложенным на квашение овощам добавляют 0,05-0,15% (в зависимости от содержания в них соли) сорбата калия, то желательное молочнокислое брожение почти не угнетается; напротив, сорбиновая кислота подавляет развитие вредных дрожжей и плесневых грибов и тем самым способствует брожению. Выход готовых огурцов при использовании сорбиновой кислоты был на 20% выше, чем бет неё . К содержащим уксус маринадам для огурцов и маслин добавляют 0,1-0,2% сорбата калия, чтобы предохранить их от дрожжей и плесневых грибов. Широко используется сорбат калия для консервирования восточноазиатской ферментированной овощной продукции и пряных соусов|. При консервировании томатопродуктов сорбиновую кислоту часто применяют в сочетании с поваренной солью и(или) уксусом.

Фруктовые продукты. Сорбиновая кислота в концентрации 0,05% используется для консервирования готового к употреблению чернослива, который производят замачиванием сильно высушенных плодов. В джемы, варенья и желе из-за высокого содержания сахара достаточно добавить 0,05% сорбиновой кислоты. Часто ограничиваются поверхностной обработкой расфасованной продукции. В некоторых странах сорбиновая кислота применяется в качестве консерванта при домашнем изготовлении такого рода продуктов.

Во всех винодельческих странах сорбиновая кислота имеет очень большое значение для стабилизации вина с остаточным сахаром. Содержащийся в вине в своей обычной концентрации диоксид серы из-за низкой эффективности против дрожжей не защищает вино от перебраживания. Сочетание 200 мг сорбиновой кислоты (или 270 мг сорбата калия) и 20-40 мг свободного SО2 в 1 л вина обеспечивает ему надёжную защиту.

Хлебобулочные изделия. Сорбиновая кислота имеет общее свойство с пропионовой кислотой (широко используемой в консервировании хлебобулочных изделий) - она сохраняет эффективность в области высоких значений рН. По сравнению с пропионатами сорбиновая кислота проявляет значительно более сильное антимикробное действие , особенно в отношении меловой плесени (Trichosporon variabile), появляющейся иногда на ржаном хлебе. Сорбиновая кислота в количестве 0,1-0,2% к массе муки добавляется во время замеса теста.

Кондитерские изделия. Сорбиновая кислота вследствие нейтрального вкуса, эффективности в области высоких рН и действенности против осмофильных дрожжей применяется для консервирования наполнителей шоколада и пралине. Используются концентрации от 0,05 до 0,2%, в зависимости от содержания в продукте сахара, кислот и от других влияющих на консервирующее действие факторов.

3.2 Бензойная кислота

3.2.1 Историческая справка

Консервирующее действие бензойной кислоты впервые было описано в 1875 году Флеком , который искал заменитель уже известной к тому времени салициловой кислоте. Он проводил аналогию между действием обеих кислот и фенола. Бензойную кислоту, в отличие от салициловой, тогда ещё не могли получать в промышленных масштабах. Она стала использоваться в консервировании пищевых продуктов лишь к началу XX столетия. С тех пор бензойная кислота во всех странах широко применяется как консервант, прежде всего из-за своей низкой цены, но в последнее время её всё чаще заменяют другими, менее токсичными консервантами.

3.2.2 Товарные формы

Применение находит как сама бензойная кислота, так и её натриевая соль (бензоат натрия), лучше растворимая в воде. Бензоат калия используется редко.

3.2.3 Токсиколого-гигиеническая оценка

Бензойная кислота, наряду с эфирами п-оксибензойной кислоты и некоторыми азокрасителями, обладает значительным сенсибилизирующим потенциалом. Как при оральном введении, так и при нанесении на кожу бензойная кислота может вызывать реакции непереносимости - крапивницу, астму, анафилактический шок. В качестве возможной причины такого действия предполагают усиленное выделение гистамина, индуцируемое бензоатом .

3.2.4 Законодательные аспекты применения в пищевых продуктах

Бензойная кислота и бензоат натрия давно разрешены в большинстве стран Для консервирования многих пищевых продуктов.

Предельно допустимые концентрации составляют от 0,15 до 0,25%, хотя бывают и исключения.

3.2.5 Области применения

Жировые продукты. Бензойная кислота несколько десятков лет используется в качестве консерванта для маргаринов, в которых её концентрация составляет 0,08-0,15%. В жировую фазу маргарина добавляют кислоту, а в водную - бензоат натрия, причём они могут применяться как вместе, так и по отдельности. Бензойная кислота не идеальный консервант для маргаринов, так как относительно высокое значение рН маргарина лежит на границе области, оптимальной для действия бензойной кислоты. Этот факт, а также не очень благоприятный коэффициент распределения между жировой и водной фазой ограничивают применение бензойной кислоты в предохранении маргаринов от порчи.

Бензойная кислота и бензоат натрия применяются как консерванты для майонезов и деликатесных продуктов, содержащих майонез.

Фруктовая и овощная продукция. Ранее бензойная кислота (в виде 0,1-0,2% бензоата натрия) широко использовалась для консервирования маринованных овощей. Она хорошо подходит для таких продуктов вследствие их высокой кислотности. По этой же причине, а также из-за высокого содержания приправ отрицательное влияние добавки бензоата на вкус малозаметно. Сейчас бензоаты в маринадах почти не используются; вследствие изменения запросов потребителей чаще применяют пастеризацию и сорбиновую кислоту.

Бензойная кислота и её соли в консервирующих концентрациях могут вызывать в пищевых продуктах небольшое изменение вкуса.



Практическая часть

Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии позволяет определять содержание сорбиновой и бензойной кислот в майонезах, соусах, маргаринах в диапазоне от 1·10 -3 до 130·10 -3 %.

Метод анализа основан на экстракции сорбиновой и бензойной кислот из пробы в виде солей раствором аммиака. Избыток аммиака удаляется нагреванием. Соли сорбиновой и бензойной кислот переводятся в кислоты непосредственно на колонке при использовании кислой подвижной фазы.Необходимое разделение достигается на колонке с обращенной фазой с применением кислого ацетатного буферного раствора в составе подвижной фазы. Детектирование осуществляется спектрофотометрическим детектором в ультрафиолетовой области спектра.

Условия проведения анализа

Хроматограф жидкостный «Хромос ЖХ-301» со спектрофотометрическим детектором

Колонка аналитическая Eurospher-100-5 C18 4x150мм

Длина волны детектора -235нм

Объем петли -- 20мкл

Подвижная фаза: ацетонитрил-- 25ммоль/дм3 раствор натрия уксуснокислого (рН=4,5, доведен добавлением уксусной кислоты) в объемном соотношении 20:80

Скорость потока подвижной фазы -- 0,4см3/мин

Порядок подготовки к выполнению измерений

Приготовление экстрагирующего раствора.

В качестве экстрагирующего раствора используется раствор аммиака с концентрацией 10ммоль/дм3. В мерную колбу вместимостью 1000см3 добавляют 3,5 см3 раствора аммиака с массовой долей 10% медицинского и доливают до метки дистиллированной водой.Раствор перемешивают.

Приготовление подвижной фазы для жидкостной хроматографии

Для приготовления подвижной фазы в круглодонную колбу вместимостью 1000см3 помещают 3,4г натрия уксуснокислого 3-водного и 1000см3 воды. Раствор перемешивают.

РН раствора доводят до 4,4-4,5 путем добавления по каплям уксусной кислоты ( 2,5 см3 уксусной кислоты).Полученный раствор смешивают с ацетонитрилом в объемном соотношении 80:20.Полученную подвижную фазу профильтровать через мембранный фильтр и дегазировать под вакуумом.

Приготовление стандартного раствора бензойной и сорбиновой кислот

Навески стандартных веществ массой по 25,0 мг растворяют дистиллированной воде в мерной колбе вместимостью 100см3 .Содержимое колбы перемешивают до полного растворения.

Массовые концентрации бензойной и сорбиновой кислот в стандартном растворе, приготовленном из кислот, составляют 250мг/дм3.

Из стандартного раствора готовят рабочие растворы в диапазоне массовых концентраций каждой кислоты 1-25 мг/дм3 путем точного разбавления.

Выполнение измерений

Экстракция сорбиновой и бензойной кислот.

В мерную колбу вместимостью 25см3 помещают 0,3-0,5г пробы и добавляют 15см3 экстрагирующего раствора..Колбу, не закрывая пробкой, нагревают на кипящей водяной бане в течение 30мин, переодически перемешивая.По охлаждении до комнатной температуры колбу доливают водой до метки и тщательно перемешивают. Аликвоту смеси центрифугируют при 3000об/мин в течение 15мин., водную фазу фильтруют через капроновый фильтр 0,45мкм, собирая 0,5-1 см3 фильтрата.

Хроматографический анализ

Качественное обнаружение бензойной и сорбиновой кислот.

Проводят хроматографический анализ раствора бензойной и сорбиновой кислот массовой концентрации каждой кислоты около 10мг/дм3. Идентификация бензойной и сорбиновой кислот проводится по временам удерживания.

Количественное определение бензойной и сорбиновой кислот

Градуировка хроматографа

Проводят хроматографический анализ всех рабочих растворов, полностью заполняя петлю инжектора. Регистрируют площадь пиков бензойной и сорбиновой кислот.

Площадь пика бензойной или сорбиновой кислоты S, усл.ед. прямопропорциональна концентрации анализируемого компонента в рабочем растворе c, мкг/смі.

C = K · S, (1)

Где К - градуировочный коэффициент, на мкг/смі.

Градуировочные коэффициенты К в формуле (1) для бензойной и сорбиновой кислот рассчитывают по результатам анализа рабочих растворов с помощью системы автоматизированной обработки данных или, при её отсутсвии в составе хроматографа по методу наименьших квадратов, принимая свободный член в уравнении регрессии равным нулю, по формуле:

K = ? (Si ·Ci)/ ?(Si)І (2)

Где:

Si - площадь пика бензойной или сорбиновой кислоты при анализе i-го рабочего раствора, усл.ед.;

Ci - массовая концентрация бензойной или сорбиновой кислоты в i-ом рабочем растворе, мкг/смі.

Анализ экстракта из пробы.

Значения площади пика бензойной и сорбиновой кислот на хроматограмме экстракта из пробы, полученной по градуировке, используют для расчета массовых долей сорбиновой и бензойной кислот при условии, что они не выходят за верхнюю границу диапазона градуировки хроматографа. В противном случае экстракт из пробы, полученный по градуировке разбавляют вдвое и проводят его повторный хроматографический анализ.

Обработка и оформление результатов измерения

Массовую долю бензойной (сорбиновой) кислоты X(%) рассчитывают по формуле:

X = (Cx·0,001·25·100)/(M·1000)

Где:

X - массовая доля бензойной(сорбиновой) кислоты , %;

25 - объем мерной колбы, смі;

M - масса навески пробы, г;

Cx - концентрация кислоты, найденная из хроматограммы, мкг/смі;

100 - коэффициент пересчета на содержание в 100 г;

1000 - коэффициент пересчета мкг в мг

При необходимости содержание сорбиновой и бензойной кислот Xґ (в мг/100г продукта) пересчитывают по формуле

Xґ = X · 1000

Вычисления проводят до третьей значащей цифры.

Хроматограммы

Казанский Жиркомбинат

Красная цена

Ряба Оливковый



Ряба с лимонным вкусом

Сдобри, Могилев

Сдобри, Н.Новгород

Селяночка

Слобода

Хорошка Оливковый

1. Размещено на www.allbest.ru