Спектральные свойства новых флуоресцентных зондов красной области свечения

На сегодняшний день известно большое количество органических соединений, способных люминесцировать под действием различного вида излучения. Данные вещества называют люминофорами. Особенности химической структуры этих соединений обуславливают их люминесцентные свойства и поведение молекул конкретного люминофора в том или ином окружении.

Обладая рядом спектральных свойств, люминофоры широко применяются во многих сферах деятельности человека. Немаловажное значение играет использование их в биологии и медицине. Число новых методик биологических исследований, разработанных на основе люминесцентных красителей, растет очень быстро. Это объясняет потребность в синтезе новых люминесцентных красителей. Яркие и водорастворимые ФК, например, важны для чувствительного обнаружения ДНК флуоресцирующими зондами. Группа таких зондов, которые испускают в различных областях спектра, может быть независимо обнаружена, что обеспечивает мощный инструмент для соотнесения многих генетических или антигенетических параметров в индивидуальных клетках и тканях [6].

Люминофоры, в большинстве случаев представители класса органических соединений, помогают расширить границы видимости биологических объектов в световом микроскопе, что позволяет обнаруживать вещества, содержащиеся в организме в очень низкой концентрации. Помимо увеличения чувствительности обнаружения веществ люминесцентными методами, люминофоры успешно используются для изучения структуры различных биологических молекул и их конгломератов, содержащихся в компартментах клеток.

По характеру флуоресценции коньюгатов красителей с различными клеточными структурами можно судить о функциональной активности последних и жизнеспособности клетки в целом. Однако не любой люминесцентный краситель подходит для такого взаимодействия, что влечет ряд трудностей, связанных с изменениями спектральных свойств люминофора. Поэтому современные исследования сосредоточены на стремлении учесть возможные варианты влияния отдельных компонентов клеточных структур на спектральные свойства связываемого флуоресцентного красителя, такие как квантовый выход, спектр флуоресценции, коэффициент поглощения, поляризацию и др. Следует также учитывать возможную токсичность этих соединений по отношению к изучаемому биологическому образцу, если в эксперименте важна функциональная сохранность последнего.

Расширение области применения флуоресцентных зондов (ФЗ) является причиной возрастающей потребности в синтезе новых ФЗ с определенными спектральными свойствами. Учитывая это обстоятельство, а также невозможность точного теоретического расчета флуоресценции вновь синтезированных молекул красителя, считается уместным провести экспериментальное определение их спектральных характеристик.

Целью данной работы явилось исследование спектральных свойств новых флуоресцентных зондов красной области свечения при различном влиянии микроокружения

В соответствии с поставленной целью предполагалось решить следующие задачи:

Исследовать поведение нового ФК Sq1 в универсальном буферном растворе при различном значении pH.

Исследовать спектр флуоресценции новых ФЗ в различных растворителях.

Провести разделение смеси коньюгата BSA - Alexa-647 и чистого красителя на хроматографической колонке.

Исследовать спектр испускания коньюгата BSA - Alexa-647, сопоставить его с эталонным красителем Cy5 и флуоресценцией свободного ФК Alexa-647.

Определить зависимость квантового выхода Alexa-647 от Dye-to-protein ratio.

Раздел 1. Литературный обзор

1.1 Применение флуоресцентных красителей в биологии и медицине

Флуоресцентные красители (ФК) являются одними из многочисленных представителей класса органических соединений, дающих широкий спектр цветов, не редко превосходящих обыкновенные отражающие краски по яркости и насыщенности [1]. Из большого числа биологических веществ многие являются природными флуорофорами. Часто естественные флуоресцентные свойства макромолекул не позволяют получить из эксперимента желаемую информацию. Так, например, липиды обычно не флуоресцируют, а флуоресценция белка не отражает явления, которые необходимо охарактеризовать количественно. В связи с этим применяют посторонние по отношению к исследуемой системе соединения, имеющие лучшие спектральные свойства [2]. Этими соединениями окрашивают необходимую часть образца, добиваясь тем самым яркой флуоресценции, регистрация которой не составляет труда.

По характеру связывания принято различать флуоресцентные метчики и флуоресцентные зонды (ФЗ). Последние представляют собой соединения, связываемые нековалентно с исследуемым биологическим объектом, в отличие от метчиков, которые образуют ковалентные связи. Спектральные характеристики ФК достигаются путем целенаправленного изменения их химического строения. К факторам, благоприятствующим появлению люминесценции и смещению ее в длинноволновую область спектра, следует, прежде всего, отнести развитую систему сопряженных связей. Удлинение цепи сопряжения, внедрение структурных фрагментов молекул также влияет на повышение интенсивности и изменение цвета свечения [1].

Ярким примером вышесказанного являются цианиновые красители, дающие перспективные возможности проектирования мультицветных зондов, благодаря тому, что они могут быть настроены на желаемую длину волны, путем изменения гетероциклического ядра и числа двойных связей в полиметиновой цепочке. [6]

Однако в настоящее время еще не достаточно систематизированных данных, позволяющих с уверенностью формулировать общие закономерности, связывающие строение молекул с определенными флуоресцентными свойствами. Поэтому спектральные свойства каждого нового ФК определяют экспериментально. К ним относят такие важнейшие факторы, определяющие флуоресценцию, как квантовый выход - отношение числа испущенных фотонов к числу поглощенных, анизотропию или поляризацию флуоресценции, молярный коэффициент поглощения (экстинкции).

Благодаря наличию тех или иных функциональных групп в структуре красителя можно судить о месте его возможной локализации на исследуемом биологическом объекте, а значит и о физических свойствах непосредственного микроокружения молекулы красителя. Приняв во внимание такую возможность, уже на протяжении многих лет ведутся работы по исследованию биологических мембран с использованием всякого рода ФК [3-5]

Так, например, в исследованиях транспорта ионов через мембрану и электрического потенциала на мембране применяются зонды, которые можно поделить на четыре основные группы [3]:

1) заряженные зонды, плохо флуоресцирующие в воде, типа АНС или ТНС;

2) заряженные зонды, плохо флуоресцирующие при высоких концентрациях из-за образования агрегатов, к ним относятся мероцианины, оксонолы и цианины;

3) зонды, способные к диффузии через мембраны в незаряженной форме, например, производные акридина;

4) зонды-комплексоны, у которых параметры флуоресценции резко изменяются при образовании комплекса с ионами, транспорт которых изучается. Сюда относятся производные антибиотика тетрациклина, ярко флуоресцирующие в комплексе с Mg2+ или Ca2+ в гидрофобной среде.

1.2 Влияние микроокружения на флуоресценцию красителя

1.3 Использование сквараиновых красителей в биологических приложениях

Сквараиновые красители принадлежат семейству красителей цианина. Возможность поглощать в широком диапазоне длин волн достигается путем изменения гетероциклических концевых групп и заменой кислорода, например, дицианометиленовой группой или серой. Наличие хромофорных группировок, а также сопряженная система двойных связей обуславливает достаточно высокую интенсивность флуоресценции. Введение реактивных групп в молекулу дает возможность ковалентно связывать краситель с разнообразными биомолекулами. Группы сульфокислоты усиливают водорастворимость, что обеспечивает их использование в биологических приложениях в качестве зондов. Кроме того, квантовые выходы свободных красителей при связывании их с биомолекулами в большинстве случаев увеличиваются.

Электронная симметрия молекулы позволяет сквараинам с высокими коэффициентами ослабления поглощать в красном свете и в ближней инфракрасной области (600-750 нм). Известно, что автофлуоресценция большинства биологических образцов уменьшается с увеличением длины волны, особенно после 600 нм [17]. Это послужило причиной синтеза флуоресцентных красителей, которые могли бы быть использованы в качестве метчиков и зондов красной области свечения.

Светостойкость этих красителей очень высока [18, 19]. Интересной особенностью сквараинов является их очень сильная флуоресценция в растворе в виде мономеров и контрастирующее отсутствие таковой в связанном или твердом состоянии [20]. Данное свойство позволяет достаточно долго хранить красители в виде порошка.

Нельзя не отметить важность использования сквараинов в медицине. Так, фотодинамическая терапия стала жизнеспособным метод лечения рака, который заключается в инактивации живых клеток опухоли совместным действием видимого света и фотосенсибилизатора. Который выборочно накапливается в тканях опухоли. Далее при облучении видимым светом, сенсибилизатор оказывает цитотоксическое действие на клетку, что приводит к гибели последней, а часто и некроз всей опухоли [21].

Раздел 2. Материалы и методы исследований

2.1 Разделение коньюгата белка с красителем

В работе использовался метод гельпроникающей хроматографии, с помощью которого отделяли коньюгат белок - краситель от чистого ФК. В качестве белка использовали бычий сывороточный альбумин (BSA). Разделение проводилось на хроматографической колонке, заполненной декстрановым гелем сефадексом G-50 в фосфатном буферном растворе pH=7,4. Собранные таким образом фракции коньюгата далее исследовали спектроскопическим методом.

Оценка флуоресценции красителей и коньюгата BSA - краситель осуществлялась путем вычисления квантового выхода согласно следующей формуле:

,

флуоресцентный краситель белок коньюгат

где:

QYet - квантовый выход эталонного красителя;

Sdye - площадь под кривой спектра испускания исследуемого красителя;

Set - площадь под кривой спектра испускания эталонного красителя;

Аet - поглощение эталонного красителя на длине волны возбуждения;

Adye - поглощение исследуемого красителя на длине волны возбуждения;

net - показатель преломления среды эталонного красителя;

ndye - показатель преломления среды исследуемого красителя;

Степень связывания оценивалась отношением количества красителя к белку (D/p Ratio) и вычислялась по формуле:

,

где:

Аdye - поглощение исследуемого флуоресцентного красителя на длине волны, соответствующей максимуму поглощения;

А278 - поглощение исследуемого красителя на длине волны л=278 нм;

Eprot - молярный коэффициент экстинкции белка;

Edye - молярный коэффициент экстинкции исследуемого красителя;

Х - коэффициент, определяющий поглощение красителя на длине волны л=278 нм, который является процентом от поглощения красителя на длине волны, соответствующей максимуму поглощения (Adye).

Раздел 3. Результаты исследований

3.1 Зависимость квантового выхода Sq1 от pH среды

Рис. 1 - Изменение интенсивности флуоресценции Sq1 в универсальной буферном растворе при различном значении pH

1. Красовицкий Б.М., Болотин Б.М. Органические люминофоры. - 2-е изд. перераб. - М.: Химия, 1984. - с.183 - 192.

2. Лакович Дж. Основы флуоресцентной спектроскопии. Пер. с англ. - М.: Мир, 1986. - 496 с.

3. Владимиров Ю.А., Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран. М.: Наука, 1980. 320 с.

4. Деев А.И. Применение флуоресцентных зондов для изучения структурных изменений поверхности фосфолипидных мембран: Канд. дис. М., 1975.

5. Коркина Л.Г. Исследование активного транспорта Са2+ в изолированных митохондриях и срезах печени крыс при аноксии с помощью флуоресцентного зонда: Канд. дис. М., 1974.

6. Bioconjugate Chem., Vol. 7, No. 3, 1996, p.356-362.

7. Richard P. Handbook of Fluorescent Probes and Research Products - ninth edition . - Haugland.: Molecular probes, inc. 2002 - p.276.

8. Паркер С. Фотолюминисценция растворов. Пер. с англ. - М.: Мир, 1972. - 510 с.

9. Nagakura S., Baba H., J. Am. Chem. Soc., 74, 5693 (1952).

10. Weller A., in «Progress in Reaction Kinetics», ed. by Porter G. and Stevens B., Vol. 1,Pergamon Press, London, 1961.

11. Bredereck K., Forster Th., Oesterlin H. G., in «Luminescence of Organic and Inorganic Materials», ed. by Kallman H. P. and Spruch G. M., John Wiley and Sons, New York, 1962.

12. Turner G. K., Science, 146, 183 (1964).

13. Welder F., Beverly P., Nakazumi H., Yagi S., Christa L., Colyer. - «Symmetric and asymmetric squarylium dyes as noncovalent protein labels: a study by fluorimetry and capillary electrophoresis», Journal of Chromatography B, 793 (2003) 93-105.

14. Alkis J., Sophianopooulos, Jacek L., Narasimhachari Narayanan and Gabor Patona - «Association of Near-Infrared Dyes with Bovine Serum Albumin». - Appl. Spectroscopy, 1997, V51, 1511-1515.

15. Weber G., Farris F. J., Synthesis and spectral properties of a hydrophobic fluorescence probe: 6-propionyl-2-(dimetylamino)naphthalene, Biochemistry, 18, 3075 (1979).

16. Лурье Ю.Ю. «Справочник по аналитической химии». - Госхимиздат, М., 1962.

17. Synthesis, Spectral Properties, and Detection Limits of Reactive Squaraine Dyes, a New Class of Diode Laser Compatible Fluorescent Protein Labels// B. Oswald, L. Patsenker, J. Duschl, H. Szmacinski, Otto S. Wolfbeis and E. Terpetschnig. University of Regensburg, Institute of Analytical Chemistry, Chemo- and Biosensors, 93040 Regensburg, Germany, and FluorRx Inc., 979 Keystone Way, Carmel, Indiana 46032. Bioconjugate Chem. 1999, 10, 925-931.

18. Appl. Spectrosc// A. J. Sophianopoulos, J. Lipowski, N. Narayanan, G. Patonay. 51, 1997, 1511 - 1515.

19. M. Brinkley, Bioconjugate Chem. 3, 1992, 2 - 13.

20. Aggregation Behavior of Halogenated Squaraine Dyes in Buffer, Electrolytes, Organized Media, and DNA// Kalliat T. Arun, Bernd Epe and Danaboyina Ramaiah. Photochemistry Research Unit, Regional Research Laboratory (CSIR), TriVandrum 695 019, India, and Institute of Pharmacy, UniVersity of Mainz, D 55099 Mainz, Germany. J. Phys. Chem. B 2002, 106, 11622-11627.

Размещено на Allbest.ru