Фрагментация полипептидной цепи

Необходимый этап в определении первичной структуры белка - расщепление белковой молекулы на пептидные фрагменты. Структурная химия белка располагает широким арсеналом химических и ферментативных методов фрагментации полипептидной цепи. Выбор того или иного метода определяется конкретными физико-химическими свойствами изучаемого белка и общим стратегическим планом проведения исследования. Химические методы обладают высокой селективностью, однако процесс расщепления протекает, как правило, с выходом, не превышающим 50%. Эти методы целесообразно использовать для получения крупных фрагментов. Возможности ферментативных методов гидролиза значительно шире, они дают как крупные, так и мелкие пептиды.

Ферментативные методы гидролиза

Наиболее широко используемым ферментом при установлении первичной структуры белков является трипсин. Коммерческий бычий трипсин получают активацией его предшественника - трипсиногена, выделяемого из секрета поджелудочной железы. Трипсин относится к классу сериновых протеиназ и проявляет наибольшую активность в диапазоне рН7,0-9,0. Фермент обладает уникальной субстратной специфичностью, катализируя гидролиз связей, образованных карбоксильными группами только основных аминокислот - лизина и аргинина.

Гидролиз трипсином в оптимальных условиях происходит, как правило, с выходом, близким к 100%. Однако в ряде случаев на полноту и скорость протекания процесса оказывают влияние положение гидролизуемой связи в цепи и химическая природа боковых групп соседних аминокислотных остатков. Пептидные связи, рядом с которыми находятся свободные ?-амино- или ?-карбоксильные группы, гидролизуются сравнительно медленно. Так, лизин, занимающий N-концевое положение в рибонуклеазе и лизоциме, практически не отщепляется при гидролизе трипсином, а в B-цепи инсулина происходит только частичное расщепление связи лизина с С-концевым аланином. Как правило, соседство дикарбоновых аминокислот (Asp и Glu) и особенно цистеиновой кислоты или карбоксиметилцистеина затрудняет гидролиз пептидной связи трипсином. Однако практически во всех перечисленных случаях удается добиться достаточно полного гидролиза путем увеличения соотношения трипсин - субстрат или времени инкубации. Исключение составляют связи, образованные остатками лизина и аргинина с пролнном (Lys - Pro и Arg - Pro), абсолютно устойчивые к действию фермента.

Трипсин обладает высокой избирательностью действия, и все же при достаточно большом времени инкубации и избытке фермента в ряде случаев наблюдается расщепление связей, включающих остатки ароматических аминокислот: тирозина, фенилаланина и триптофана. Коммерческие препараты трипсина могут содержать 0,05% примесей химотрипсина, поэтому во избежание аномальных разрывов пептидных связей применяют различные ингибиторы химотрипсина. Лучший из них - L - (l-тoзилaмидo-2-фeнилэтил) xлopмeтилкeтoн (ТФХК) является аналогом ацилированного фенилаланина. Однако даже обработанный ТФХК трипсин иногда гидролизует типичные субстраты химотрипсина.

По-видимому, проявление в некоторых случаях химотрипсиноподобной активности объясняется структурной и функциональной особенностью самого трипсина. Не исключено, что другим фактором вызывающим неспецифичность действия фермента, является повышенная чувствительность некоторых пептидных связей, определяемая пространственной структурой субстрата.

Введение заместителей в боковые цепи лизина или аргинина препятствует гидролизу трипсином по остаткам модифицированных аминокислот и позволяет расщеплять белки избирательно только по остаткам аргинина или лизина соответственно. Особенно часто используется модификация остатков лизина с последующим гидролизом белка по остаткам аргинина. В качестве модифицирующих агентов применяются ангидриды дикарбоновых кислот. В результате реакции ацилирования происходит замена положительного заряда остатка лизина на отрицательный заряд полуамида дикарбоновой кислоты:

В зависимости от природы используемого реагента модификация остатков лизина может быть как обратимой, так и необратимой. Обратимое блокирование ?-аминогрупп позволяет осуществлять последовательное расщепление белковой молекулы трипсином: вначале только по остаткам аргинина, а затем, после разделения образовавшихся пептидов и удаления защитных групп, и по остаткам лизина.

Для обратимой модификации чаще всего используется реакция с малеиновым или цитраконовым ангидридами. Реакция ацилирования проводится при рН8,5 -9,0 и температуре 0-2^СС в присутствии 20-кратного избытка реагента. Малеильные производные лизина стабильны при нейтральных и щелочных значениях рН, а в кислой среде (рН 3,5; 40 °С; 40 ч) гидролизуются, регенерируя свободную ?-аминогруппу. В этих условиях может происходить частичное дезамидирование белков, а также разрыв некоторых кислотолабильных связей, в частности между остатками аспарагиновой кислоты и пролина. Цитраконильная группа удаляется в более мягких условиях (рН 3,5; 20 °С; 4 ч), однако ее недостаток - пониженная устойчивость при щелочных значениях рН. Для необратимой модификации остатков лизина наилучшим агентом является янтарный ангидрид.

Методы модификации остатков аргинина в белках основаны на конденсации гуанидиновой группы с различными дикетонами и диальдегидами. Наибольшее применение среди них находит реакция с 1,2 - циклогександионом, предложенная в 1975 г. Л. Патти и Э. Смитом. Модификация протекает в мягких условиях (рН 8,0 - 9,0; 25 - 40 °С) в натрий-боратном буфере с образованием стабильного комплекса производного аргинина с боратом.

Модифицирующая группировка удаляется путем обработки 0,5 М гидроксиламином при рН 7,0, 37 °С, что дает возможность проводить последующее расщепление трипсином по освобождающимся остаткам аргинина.

С помощью химической модификации можно также увеличивать число гидролизуемых трипсином связей. Для этой цели, в частности, используется аминоэтилирование остатков цистеина этиленимином (Л. Линдлей, 1956):

Пептидные связи, образованные карбоксильной группой S - (?-аминоэтил) цистеина, являющегося структурным аналогом лизина, способны расщепляться под действием трипсина, однако

с меньшей скоростью, чем связи, образованные остатками лизина и аргинина. Более полного расщепления можно достичь увеличением концентрации фермента и продолжительности гидролиза.

Наряду с трипсином из поджелудочной железы выделяют другую сериновую протеиназу - химотрипсин. Используемый для структурных исследований ?-химотрипсин А проявляет максимальную активность в диапазоне рН 7,8 - 9,0. Химотрипсин обладает гораздо более широкой специфичностью, чем трипсин. Фермент преимущественно катализирует гидролиз пептидных связей, образованных карбоксильными группами ароматических аминокислот - тирозина, фенилаланина и триптофана. С меньшей скоростью гидролизуются пептидные связи лейцина, метионина, гистидина. Скорость расщепления отдельных связей в белках и пептидах зависит от характера соседних аминокислотных остатков.

Аналогично трипсину химотрипсин обычно медленно гидролизует связи, расположенные в непосредственной близости от свободных ?-амино- и ?-карбоксильных групп. Наличие рядом с атакуемой химотрипсином связью отрицательного заряда (GIu, Asp, CMCys (карбоксиметилцистеин), CysS0₃H (цистеиновая кислота) существенно снижает скорость гидролиза, а присутствие основных аминокислот (Lys и Arg) увеличивает степень расщепления. Чрезвычайно затруднен гидролиз пептидных связей, образованных иминогруппой пролина.

В последнее время при исследовании первичной структуры белков широкое применение находит протеиназа из Staphylococcus aureus, выделенная в 1972 г. Г.Р. Драпю, которая также относится к классу сериновых протеиназ. Фермент имеет два максимума протеолитической активности - при рН 4,0 и 7,8. Протеиназа из S.aureus с высоким выходом расщепляет пептидные связи, образованные карбоксильной группой глутаминовой кислоты.

В ряде случаев гидролизу подвергаются также связи, образованные остатком аспарагиновой кислоты. Остатки гидрофобных аминокислот (особенно лейцин), следующие за остатками аспарагиновой кислоты, благоприятствуют такому гидролизу. Как и в случае трипсина и химотрипсина, связи, в образовании которых участвует иминогруппа пролина, не расщепляются протеиназой из S.aureus. Свободная карбоксильная группа С-концевого аминокислотного остатка глутаминовой, аспарагиновой кислот и карбоксиметилцистеина, а также свободная ?-аминогруппа значительно снижают скорость гидролиза, когда они располагаются рядом с атакуемой ферментом связью или даже отстоят от нее на один аминокислотный остаток.

Термолизин, выделяемый из культуральной среды термофильной бактерии Bacillus thermoproteolyticus, относится к классу нейтральных протеиназ, содержащих цинк в качестве кофактора. Термолизин необычайно термостабилен: в течение часа он полностью сохраняет свою активность при 60 °С (pH 7,0) и теряет менее 50% активности при 80 °С. Фермент устойчив в 8 M растворе мочевины, 20%-ном растворе этанола или метанола. Максимальную активность он проявляет в диапазоне pH 7,0 - 9,0. В отличие от большинства протеолитических ферментов, специфичность термолизина определяется природой остатка, которому принадлежит аминогруппа гидролизуемой связи. Термолизин преимущественно расщепляет пептидные связи, включающие аминокислотные остатки с гидрофобной боковой цепью (Ile, Leu, Val, Phe, Туг, Trp).

С меньшей скоростью гидролизуются связи, в образовании которых участвуют остатки аланина и метионина. Присутствие свободных карбоксильных и ?-аминогрупп рядом с остатком гидрофобной аминокислоты несколько замедляет скорость гидролиза, а остаток пролина, следующий за остатком гидрофобной аминокислоты, препятствует гидролизу.

Трипсин, протеиназа из S.aureus, химотрипсин и термолизин являются ферментами, наиболее часто используемыми в настоящее время при установлении первичной структуры белков. Первые два из них, обладающие наиболее высокой специфичностью, применяются главным образом для первичного расщепления белковой молекулы. Термолизин и химотрипсин обычно служат инструментом для дополнительной фрагментации крупных пептидов - продуктов химического или ферментативного гидролиза белка. В то же время довольно часто они применяются и для первичного расщепления белков небольшой и средней молекулярной массы с целью получения «перекрывающихся» фрагментов.

Для избирательного расщепления молекулы белка по остаткам лизина или аргинина в последние годы довольно широко используются новые ферменты. Среди них так называемая лизин-специфичная протеиназа, выделяемая из грибов Armilaria mellea, и клострипаин из Clostridium histolyticum.

Лизин-специфичная протеиназа в основном катализирует расщепление пептидных связей, образованных ?-аминогруппой лизина, а клострипаин предпочтительно гидролизует связи, образованные карбоксильной группой остатков аргинина.

В распоряжении исследователей имеется также большой набор менее специфичных протеолитических ферментов (пепсин, эластаза, субтилизин, папаин, проназа и др.). Эти ферменты используются в основном при дополнительной фрагментации пептидов. Их субстратная специфичность определяется природой аминокислотных остатков, не только образующих гидролизуемую связь, но и более удаленных по цепи.

Для исчерпывающего ферментативного гидролиза необходимо, чтобы белковая глобула находилась в денатурированном состоянии, т.е. все пептидные связи должны быть максимально доступными для атаки ферментом. В белке же, находящемся в нативной конформации, как правило, гидролизу подвергается только ограниченное число связей, расположенных на поверхности белковой молекулы, что приводит к образованию небольшого числа фрагментов. Этот процесс известен под названием ограниченного протеолиза. Реакции ограниченного протеолиза широко распространены в биологических системах, и с ними связано осуществление целого ряда физиологических процессов. В частности, к ним относятся процессы активации зимогенов протеиназ желудочно-кишечного тракта и сыворотки крови, процессинг многих гормонов и т.п.

Метод ограниченного протеолиза получил широкое распространение в структурно-функциональных исследованиях белков большой молекулярной массы. С помощью ограниченного протеолиза часто удается расщепить молекулу белка на небольшое число фрагментов и проводить дальнейшее исследование их строения, сводя таким образом одну сложную задачу к нескольким более простым.

Для реализации такого подхода необходимо выбрать протеолитический фермент и подобрать условия, при которых полипептидная цепь исследуемого белка будет гидролизоваться только по наиболее доступным пептидным связям. Важным условием ограниченного протеолиза является сохранение нативной конформации белка. Поэтому при выделении белка следует избегать действия денатурирующих агентов. Во многих случаях удается расщепить молекулу белка на небольшое число фрагментов, если проводить гидролиз в условиях, которые снижают активность используемого протеолитического фермента. Обычно такими условиями являются небольшое фермент-субстратное соотношение, пониженная температура, а также значение рН, не соответствующее оптимуму действия фермента.

белковый расщепление ферментативный протелиоз

Так, при гидролизе основного белка миелина пепсином при рН 3,0, 37 °С и фермент-субстратном соотношении 1:50 наблюдается образование 17 фрагментов; при рН 3,0, 24 °С и фермент-субстратном соотношении 1:500 расщепление проходит главным образом по трем связям, а при рН 6,0, 24 °С и фермент-субстратном соотношении 1:500 расщепляется единственная связь Рhе-Рhе. Молекулу мембранного белка можно расщепить на небольшое число фрагментов, если подвергать протеолизу нативную мембрану со встроенным в нее белком. При этом под действием фермента способны расщепляться только пептидные связи, находящиеся на поверхности мембраны.

Химические методы расщепления

Среди химических методов фрагментации белков наиболее специфичным и чаще всего применяемым является расщепление бромцианом по остаткам метионина. Метод разработан в 1961 г. Э. Гроссом и Б. Виткопом и по избирательности действия не имеет себе равных.

Реакция с бромцианом проходит с образованием промежуточного циансульфониевого производного метионина, спонтанно превращающегося в кислых условиях в иминолактон гомосерина, который, в свою очередь, быстро гидролизуется с разрывом иминной связи. Получающийся на С-конце пептидов лактон гомосерина далее частично гидролизуется до гомосерина (НSеr), в результате чего каждый пептидный фрагмент, за исключением С-концевого, существует в двух формах - гомосериновой и гомосеринлактоновой. Реакцию обычно проводят при комнатной температуре в течение 15-30 ч в сильнокислой среде (чаще всего в 70%-ной муравьиной кислоте) при 100-кратном избытке бромциана на каждый остаток метионина. В этих условиях связи, образованные остатками метионина, обычно расщепляются на 90-100%. Исключение составляют связи метионина с серином и треонином, расщепляющиеся лишь частично. В условиях обработки белка бромцианом может иметь место частичный гидролиз связи Asp-Pro, неустойчивой в кислой среде.

Большое число методов предложено для расщепления белка по карбонильной группе остатка триптофана. Одним из используемых для этой цели реагентов является N-бромсукцинимид:

Под влиянием электрофильного агента карбонильная группа остатка триптофана способна вступать в 1,5 - взаимодействие с двойной связью индольного кольца, при этом происходит окисление индола до гидроксииндолина, сопровождающееся разрывом пептидной цепи. Реакция проводится при 2 - 3-кратном избытке реагента (рН 4,0; 20^СС; 2 ч). Расщепление триптофансодержащих пептидов N-бромсукцинимидом происходит с выходом 50 - 90%, а белков - лишь 10 - 60%. N-Бром - сукцинимид способен расщеплять также связи, образованные карбонильными группами остатков тирозина и гистидина, однако в более жестких условиях (увеличение избытка реагента, повышение температуры и понижение рН).

Более селективным реагентом является 2 - (2-нитрофенилсульфенил) - З-метил-З-броминдол (ВИРБ-скатол), получаемый обработкой 2 - (2-нитрофенил) сульфенилскатола N-бромсукцинимидом (А. Фонтана, 1972)

При действии на белки BNPS-скатола происходит специфичное расщепление пептидной цепи только по остаткам триптофана. Остатки метионина при этом окисляются до метионинсульфона. Оптимальные условия проведения реакции: 50%-ная уксусная кислота, 37 °С, 24 ч, 10-кратный избыток BNPS-скатола, выход составляет 30 - 70%. Реакция протекает по механизму, аналогичному механизму расщепления N-бромсукцинимидом.

В 1979 г. М. Хермодсон предложил новый метод расщепления пептидных связей, образованных остатками триптофана, с помощью о-иодозобензойной кислоты. Реагент селективно разрывает связи Trp-X, не модифицируя остатки тирозина и гистидина; метионин может окисляться до сульфоксида. Остатки цистеина и цистина необходимо предварительно защищать путем S-алкилирования. Реакция проводится в 80%-ной уксусной кислоте в присутствии 2-кратного избытка о-иодозобензойной кислоты в течение 24 ч при 20 °С, выход достигает 70 - 100%.

В структурных исследованиях нашел применение метод расщепления полипептидной цепи гидроксиламином по связи аспарагинил-глицил. Как показали исследования механизма реакции, с гидроксиламином взаимодействует циклический имид ангидрида аспартил-глицила, образующийся из аспарагинил-глицила. Этому превращению способствует предварительное выдерживание белка в кислой среде.

При реакции ангидроаспартил-глицила с гидроксиламином в щелочной среде (pH 10,5) и при температуре 35-60 °С происходит расщепление пептидной цепи с образованием смеси ?- и ?-аспартилгидроксаматов. У большинства изученных белков при действии гидроксиламина в указанных условиях проходило специфичное расщепление связей Asn-Gly на 50 - 70%. Незначительный разрыв других пептидных связей, например Asn-Leu, наблюдался редко.

В ряде случаев для расщепления белковых молекул используется метод частичного кислотного гидролиза. Наиболее чувствительными к действию кислот являются аспартильные пептидные связи. Механизм реакции гидролиза, вероятно, включает в себя замещение карбоксильным анионом протонированного атома азота пептидной связи:

Наименее устойчивы в кислых условиях связи Asp-Pro. Повышенная их лабильность обусловлена тем, что атом азота остатка пролина в пептидных связях имеет наибольшую основность по сравнению с остатками других аминокислот и легче протонируется. Подобраны условия (10%-ная уксусная кислота - пиридин, рН 2,5, 7М гуанидин * НС1, 40 °С, 4 суток), при которых связи Asp-Pro расщепляются достаточно селективно и с большим выходом (до 90%).

В 1974 г. А. Патчорник предложил метод расщепления пептидных связей, образованных остатком цистеина, с помощью 2-нитро-5-тиоцианатобензойной кислоты (НТЦБ):

НТЦБ цианирует остаток цистеина, превращая его в остаток ?-тиоцианатоаланина, который в мягких условиях (рН 8,0 - 9,0; 37° С; 12-16 ч) циклизуется в 2-иминотиазолидинкарбоновую кислоту с разрывом пептидной связи. Расщепление полипептидной цепи по остаткам цистеина в указанных условиях специфично и обычно проходит с выходом 80 - 90%.

Существенным недостатком метода является то, что полученные при расщеплении фрагменты, за исключением N-концевого, не содержат свободной ?-амино - группы и поэтому не могут подвергаться деградации по методу Эдмана. С помощью восстановительного десульфирования на никелевом катализаторе удается превращать иминотиазолидинкарбоновую кислоту в аланин. Однако при этом наблюдается частичное расщепление некоторых пептидных связей.

Среди описанных методов химического расщепления наибольшее применение при исследовании первичной структуры белков находит деградация бромцианом по остаткам метионина. Относительно широко используется расщепление по остаткам триптофана кислотный гидролиз по связи Asp-Pro и расщепление по остаткам цистеина и тирозина. При расщеплении белков по остаткам метионина, триптофана и цистеина обычно образуются крупные пептидные фрагменты, содержащие в среднем 40 - 80 аминокислотных остатков, что связано с низким содержанием этих аминокислот в белках. Более крупные пептиды могут быть получены при расщеплении связей Asn-Gly и Asp-Pro.

Размещено на Allbest.ru