Третичная структура белков

Размещено на http://www.allbest.ru/

Третичная структура белков

Рентгеноструктурный анализ кристаллических образцов

Полипептидная цепь, содержащая определенное число участков вторичной структуры, обычно укладывается в пространстве в относительно компактную систему, в которой элементы вторичной структуры взаимодействуют между собой и с участками неупорядоченной структуры, образуя глобулу (глобулярные белки) или достаточно вытянутое волокно (фибриллярные белки). В этих случаях принято говорить о формировании третичной структуры. Для многих белков третичная структура эквивалентна полной пространственной структуре. Каждый белок обладает своей уникальной пространственной структурой.

Сверхвторичная вбвбв- структура («греческий орнамент»).

Главным методом, с помощью которого в настоящее время определяется третичная структура белка, является рентгеноструктурный анализ кристаллических образцов. Для рентгеноструктурного анализа необходимо получение монокристаллов белков. Проблема кристаллизации часто оказывается весьма сложной и требует не только соответствующего методического арсенала, но и высокого экспериментального искусства, а порой и просто везения. Для анализа кристаллов относительно простых соединений можно пользоваться так называемыми прямыми методами. В большинстве случаев, оказывается, необходимо ввести в молекулу белка тяжелый атом (например, атом ртути), причем так, чтобы пространственная структура белка существенно не искажалась -- это известная проблема изоморфного замещения. Кристалл изоморфного производного белка и служит основным объектом исследования.

Рентгеноструктурный анализ сегодня является самым точным и мощным методом расшифровки пространственного строения белков (нередко разрешение достигает 0,15 -- 0,2 нм). Основной вклад в разработку рентгеноструктурного анализа белков был внесен английской школой кристаллографов (Дж. Бернал, Д. Ходжкин, Дж. Кендрью, М. Перутц, Д. Филлипс и др.). Этим методом к настоящему времени расшифровано строение более 200 белков. Использование новейших методических подходов, наличие современной вычислительной базы позволяет резко сокращать сроки анализа и получать исчерпывающую информацию об упаковке белковой молекулы и ее динамических характеристиках.

На рисунках 49 -- 52 приведены структуры некоторых белков, детально изученных на основе рентгеноструктурного анализа. Невольно приходит мысль, что многие из этих иллюстраций могли бы заслуженно занять место в коллекциях современной абстрактной живописи.

На рисунке 49 показана молекула цитохрома с: а -- обычный ход пептидной цепи, где видны отдельные атомы (Р. Дикерсон, 1975); в -- изображение той же конформации по методу Д. Ричардсон с акцентом на участки вторичной структуры. Как видно из рисунка, цитохром с имеет высокий процент б-спирализованных областей. Напротив, для преальбумина (рис. 50) характерно очень высокое содержание структур типа «складчатого листа», которые образуют основное ядро белковой молекулы. Еще более выразительны конформации ферментов триозофосфатизомеразы (рис. 51 а, б) и лактатдегидрогеназы (рис. 52), в которых упорядоченные «сгустки» в-структур в центре молекулы обрамлены б-спиралями различной длины.

Нередко возникает вопрос -- правомочно ли оперировать структурой белка в кристалле, в то время как в реальных условиях белковая молекула находится в растворе или в среде со сложным составом и именно в таких условиях выполняет свою биологическую функцию? Хотя дискуссии не прекращаются, многочисленные экспериментальные данные позволяют утвердительно ответить на этот вопрос. Во-первых, кристаллы белков весьма своеобразны по своей природе, они содержат большое количество растворителя (воды), иногда свыше 60% общей массы кристалла, и даже в кристалле молекулы белка оказываются в «плавающем» состоянии. Во многих случаях показано, что структура белка в кристалле соответствует его предпочтительной конформации, ибо межмолекулярные взаимодействия в кристаллической решетке не вносят существенных «возмущений» в структуру.

Схематическое изображение укладки полипептидной цепи в цитохроме

третичный белок денатурация ренатурация полипептидный

Схема укладки полипептидной цепи в преальбумине

Схема укладки полипептидной цепи в триозофосфатизомеразе: а -- вид сбоку, б -- вид сверху

Во-вторых, многие белки даже в кристалле сохраняют и проявляют биологическую активность, что подтверждается прямыми опытами с монокристаллами некоторых ферментов. Так, в ряде случаев удается внедрять непосредственно в кристалл фермента соответствующий субстрат (путем выдерживания кристалла в концентрированном растворе субстрата) и наблюдать расщепление субстрата, протекающее с достаточно высокой скоростью. Сопоставление рентгеноструктурных данных для свободных ферментов и их комплексов с ингибиторами (или псевдосубстратами) дает ценную информацию о конформационных превращениях и механизме функционирования белковых молекул.

Следует отметить, что все выводы о зависимости между строением и биологической функцией многих белков, сделанные на основании рентгеноструктурных данных, до настоящего времени полностью оправдываются. Таким образом, можно утверждать, что белки, как правило, обладают достаточно устойчивой пространственной структурой, которая в кристалле или в растворе с определенными параметрами среды сохраняет свою компактность и, следовательно, «нативность» в биологическом смысле.

Своеобразная ситуация сложилась с исследованием третичной структуры мембранных белков. В силу гидрофобной природы они нерастворимы в воде, трудно поддаются выделению в индивидуальном состоянии и кристаллизации. Для определения пространственной структуры мембранных белков Р. Хендерсон предложил использовать анализ двумерных кристаллов с помощью электронной микроскопии. Двумерный кристалл -- это, по существу, тонкая пленка, представляющая собой липидную мембрану с включенными в нее белками; такая пленка, получаемая с помощью особой техники, характеризуется упорядоченностью входящих в нее молекул. Получить трехмерную картину удается в результате анализа образца при различных углах наклона по отношению к направлению пучка электронов.

Схема укладки полипептидной цепи в домене I лактатдегидрогеназы

Точность собираемой таким путем информации зависит, прежде всего, от качества кристаллов; в большинстве случаев достигается разрешение не выше 1,5 -- 2 нм. Тем не менее, метод позволяет делать выводы о пространственной организации молекулы, особенно для больших белков, состоящих из нескольких субъединиц. Так, например, в ходе исследования трехмерной структуры цитохром-с-редуктазы -- фермента системы окислительного фосфорилирования в митохондриях -- удалось установить общую форму молекулы и взаимное расположение ее субъединиц (рис. 53). Размер молекулы фермента в перпендикулярном к плоскости мембраны направлении составляет около 15 нм. Центральная часть молекулы, толщиной около 5 нм, погружена в липидный бислой и составляет около 30% всего белка. С одной стороны мембраны участок молекулы фермента 50% всего белка) выступает над плоскостью бислоя на 7 нм, с противоположной стороны 20% белка) -- на 3 нм. Фермент присутствует в кристалле в виде димеров; наиболее сильный контакт между мономерами наблюдается в центре мембраны.

Аналогичным путем определены также структуры таких мембранных белков, как цитохромоксидаза, К+, Na+-аденозинтрифосфатаза, белок межклеточных контактов, рецептор ацетилхолина и др.

Денатурация и ренатурация белков

До настоящего времени в белковой химии сохранился термин «неупорядоченная структура» или «неупорядоченный (статистический) клубок». Так называют любые пространственные формы полипептидной цепи, которые не охватываются каноническими конформациями. Принято говорить о переходах б-спираль > клубок, в-структура > клубок и т. п. Такого рода рассмотрение постепенно утрачивает свое значение, ибо неупорядоченная структура, если она входит в состав биологически активного белка, должна описываться в точных терминах (углы ц, ш, ч координаты атомов). Однако не канонические формы труднее поддаются характеристике с помощью физико-химических методов, что, по-видимому, и обусловило появление не очень точного термина «неупорядоченная структура».

Сложный процесс наблюдается при денатурации белка: специфическая пространственная структура (четвертичная, третичная и вторичная) разрушается, и с точки зрения конформационных характеристик денатурированный белок представляет собой «полный хаос». Денатурация -- это такое изменение нативной конформации белковой молекулы, которое происходит при достаточно резком изменении внешних условий и сопровождается заметным изменением физико-химических свойств белка и полной потерей биологической активности.

В большинстве случаев белки денатурируют при 50 -- 60°С, а термостабильные белки -- при температурах около 100 °С. Температура, при которой 50% нативного белка подвергается денатурации, называется температурой перехода. Наглядным примером такого рода тепловой денатурации является свертывание белка при варке яиц.

В некоторых случаях денатурацию вызывает весьма незначительное изменение рН среды. Одни белки стабильны при кислых значениях рН (например, пепсин), другие -- при щелочных (щелочные протеиназы), третьи -- при нейтральных. Часто для денатурации белков используют 8М раствор мочевины или 6М раствор гидрохлорида гуанидина.

Нередко денатурация белка проводится с помощью детергентов. Существует четыре класса детергентов. Наиболее часто используемыми анионными детергентами являются додецилсульфат натрия, холат и дезоксихолат натрия. Анионные детергенты действуют при значениях рН ниже изоэлектрической точки белка. Катионные детергенты в основном представлены алкильными производными триметиламмонийбромидов или хлоридов (например, тетрадецил-, тридецил- и додециламмонийбромиды), которые вызывают осаждение белка при щелочных значениях рН. В настоящее время часто используются цвиттер-ионные детергенты (цвиттергенты), позволяющие работать в широких диапазонах рН. Сравнительно недавно вошел в практику 3-(3-холамидопропил)диметиламмоний-3-пропансульфонат (ЧАПС -- фирменное название по первым буквам английского названия детергента) -- цвиттер-ионное производное холевой кислоты. Наконец, широко применяются неионные детергенты, такие, как тритон Х-100, твин-20, твин-60, твин-80, эмуль-фоген, дигитонин, алкиловые эфиры сахарозы (например, в-октил- гликозид).

Такие реагенты, как в-меркаптоэтанол и дитиотреитол, восстанавливающие дисульфидные связи, обычно облегчают денатурацию белков. В ряде случаев денатурации могут способствовать хелатирующие агенты (например, этилендиаминтетрауксусная кислота), которые связывают двухвалентные катионы (Ca, Mg и др.), играющие роль кофакторов ферментов. Напротив, добавление кофакторов или субстратов делает ферменты более устойчивыми к денатурации. В случае мембранных белков стабилизирующий эффект оказывает добавление липидов.

Важной является проблема обратимости денатурации, т. е. возможность вновь получить белок с исходной пространственной структурой и биологическими свойствами. Такой процесс называется ренатурацией. Впервые полную ренатурацию белка удалось осуществить на примере рибонуклеазы (К. Анфинсен, 1961).

Если полностью «развернуть» молекулу рибонуклеазы путем восстановления четырех ее дисульфидных мостиков при действии меркаптоэтанола в 8М растворе мочевины, а затем провести окисление в контролируемых условиях, то молекула вновь приобретает нативную конформацию и полностью восстанавливает ферментативную активность (рис. 54).

Эти опыты показывают, что программа «самосборки» белка закодирована в его первичной структуре. По всей вероятности, важное значение при ренатурации белка имеет образование «ядер», т. е. небольших участков упорядоченной вторичной структуры (стадия нуклеации). За этим сравнительно медленным процессом следует быстрое сворачивание цепи в нативную структуру. На первых этапах ренатурации белков, в поддержании нативной конформации которых участвуют дисульфидные мостики, образуются промежуточные производные с «правильными» и «неправильными» дисульфидными связями. В ряде случаев удавалось останавливать процесс ренатурации на определенных стадиях и выделять такие частично свернутые формы. Поскольку в целом сборка белка является достаточно быстрым процессом, можно сделать вывод о том, что природа не перебирает все возможные комбинации в очередности замыкания дисульфидных мостиков (при 4 8--8-связях их 105, а при 5 -- уже 945), а сворачивание полипептидной цепи идет по ограниченному числу направлений и приводит к конформации, характеризующейся минимальной свободной энергией.

Изучение процессов денатурации и ренатурации, которое проводится с помощью разнообразных физико-химических методов (седиментация, оптические методы, метод ядерного магнитного резонанса, электрофорез, хроматография и др.), позволяет лучше понять конформационные особенности белков, устойчивость их пространственной структуры и природу взаимодействий, важных для стабилизации нативной конформации и проявления биологической активности.

Денатурация и ренатурация рибонуклеазы А

Размещено на Allbest.ru