Строение белков и пептидов

Размещено на http://www.allbest.ru/

Строение белков и пептидов

Аминокислоты и белки

Белки -- высокомолекулярные природные полимеры, построенные из остатков аминокислот, соединенных амидной (пептидной) связью (--СО--NН--). Каждый белок характеризуется специфичной аминокислотной последовательностью.

По составу белки делятся на простые, состоящие только из аминокислотных остатков, и сложные. Сложные белки могут включать ионы металла (металлопротеины, или металлопротеиды), пигмент (хромопротеины, или хромопротеиды), образовывать прочные комплексы с липидами (липопротеины), нуклеиновыми кислотами (нуклеопротеины), а также ковалентно связывать остаток фосфорной кислоты (фосфопротеины), углевода (гликопротеины) или нуклеиновой кислоты (геномы некоторых вирусов).

Роль структурных элементов в белках выполняют б-аминокислоты, отличающиеся друг от друга строением боковых групп (боковых цепей), обозначенных R; в состав белков входят, как правило, аминокислоты в L-конфигурации.

б-Аминокислоты в белках ковалентно соединены между собой пептидными связями, образованными карбоксильной группой одной аминокислоты и б-аминогруппой другой:

Белковая молекула может состоять из одной или нескольких полипептидных цепей, содержащих от 2 -- 3 десятков до нескольких сотен аминокислотных остатков каждая.

Практически все белки построены из 20 б-аминокислот, структура которых приведена в таблице 2.

В зависимости от характера боковых цепей они подразделяются на две группы: 1) аминокислоты с неполярными (гидрофобными) алифатическими или ароматическими R-группами, 2) аминокислоты с полярными (гидрофильными) R-группами.

К первой группе относятся 8 аминокислот: 6 с алифатической боковой цепью -- аланин, валин, лейцин, изолейцин, метионин, пролин и 2 с ароматической -- фенилаланин и триптофан. 7 аминокислот в боковой цепи содержат группировки, способные нести отрицательный или положительный заряд. Аспарагиновая и глутаминовая кислоты принадлежат к классу аминодикарбоновых кислот, их в- и г- карбоксильные группы при рН7,0 заряжены отрицательно. К основным аминокислотам, боковые цепи которых могут нести положительный заряд, относятся лизин, аргинин и гистидин. е-Аминогруппа лизина и гуанидиновая группировка аргинина при рН7,0 протонированы. В щелочных условиях отрицательно заряженными могут быть боковые группы тирозина и цистеина.

белок аминокислота пептид

Структура б-аминокислот, наиболее часто встречающихся в белках

При рН7,0 эти группы ионизированы частично. Характерной особенностью остатков цистеина является их способность подвергаться в составе молекулы белка самопроизвольному окислению с образованием «двойной» аминокислоты -- цистина.

Дисульфидные связи остатков цистина ковалентно связывают участки одной или нескольких полипептидных цепей, образуя между ними поперечные дисульфидные мостики.

Помимо основных 20 аминокислот, некоторые белки содержат и их производные, образующиеся в процессе посттрансляционной модификации. Так, в фибриллярном белке коллагене и в некоторых растительных белках встречаются 4-гидрокси-пролин (НуРrо) и 5-гидроксилизин (НуLys).

Фосфопротеины содержат остатки О-фосфосерина, реже - О-фосфотирозина, а в гликопротеинах ряд остатков серина, треонина или аспарагина -- ковалентно присоединенные углеводные цепи. В гистонах е-аминогруппы некоторых остатков лизина бывают моно-, ди- или триметилированы, иногда -- ацетилированы. В других белках встречаются также иодированные остатки тирозина, метилированные остатки аргинина и гистидина. Особенно часто необычные аминокислоты входят в состав пептидных антибиотиков.

б -Аминокислоты в водных растворах при нейтральных рН существуют преимущественно в виде диполярных ионов (цвиттер-ионов), у которых аминогруппы протонированы (--NH3+), а карбоксильные группы диссоциированы (--СОО-). Ионизация молекул аминокислот зависит от рН раствора:

Белки дают ряд цветных реакций, обусловленных наличием определенных аминокислотных остатков или общих химических группировок. Эти реакции широко используются для аналитических целей. Среди них широко известны нингидриновая реакция, позволяющая проводить количественное определение аминогрупп в белках, пептидах и аминокислотах, а также биуретовая реакция, применяемая для качественного и количественного определения белков и пептидов. При нагревании белка или пептида, но не аминокислоты, с CuSO4 в щелочном растворе образуется окрашенное в фиолетовый цвет комплексное соединение меди, количество которого можно определить спектрофотометрически. Цветные реакции на отдельные аминокислоты используются для обнаружения пептидов, содержащих соответствующие аминокислотные остатки. Для идентификации гуанидиновой группы аргинина применяется реакция Сакагучи -- при взаимодействии с б-нафтолом и гипохлоритом натрия гуанидины в щелочной среде дают красное окрашивание. Индольное кольцо триптофана может быть обнаружено реакцией Эрлиха -- красно-фиолетовое окрашивание при реакции с п-диметиламинобензальдегидом в Н2S04. Реакция Паули позволяет выявить остатки гистидина и тирозина, которые в щелочных растворах реагируют с диазобензолсульфокислотой, образуя производные, окрашенные в красный цвет.

По предложению К. У. Линдерстрёма-Ланга, различают четыре уровня организации белковых молекул -- первичную, вторичную, третичную и четвертичную структуры. Хотя эти категории в известной степени устарели, ими пока продолжают пользоваться. Последовательность аминокислотных остатков в полипептидной цепи называется первичной структурой. Термин «вторичная структура» относится к типу укладки полипептидных цепей. Наиболее часто встречающиеся типы -- правая б-спираль, в-структура и в-изгиб. Под третичной структурой белка понимается расположение его полипептидной цепи в пространстве. Термин «четвертичная структура» относится к белкам, в состав которых входит несколько полипептидных цепей (субъединиц), не связанных между собой ковалентно; такая структура отражает характер взаимного расположения этих субъединиц в пространстве.

Первичная структура белков и пептидов

Все белки различаются по своей первичной структуре. Потенциально возможное число таких структур практически неограниченно; так, для 15-членного пептида, состоящего из различных аминокислот, существует 2015 возможностей их взаимного расположения. Если же провести подобный расчет для среднего по величине белка с молекулярной массой 35000-- 40 000, то окажется, что в живой природе все эти возможности не реализуются: общее число различных типов белков у всех видов живых организмов составляет величину порядка 10l0 -- 1012.

Познание биологической функции и, в частности, молекулярного механизма физиологического действия белка невозможно без детального знания его строения. Установление первичной структуры белка служит основой для определения вторичной и третичной структур, выяснения расположения функциональных групп в его активном центре и открывает путь к познанию механизма его функционирования. Исследование первичной структуры «мутантных» белков позволяет на молекулярном уровне выяснить характер наследственных болезней. Данные по первичной структуре используются как один из показателей при установлении и проверке таксономических взаимоотношений между различными видами живых организмов и построении схемы биологической эволюции.

Принципиально первичную структуру белков можно определять путем непосредственного анализа аминокислотной последовательности или путем расшифровки нуклеотидной последовательности соответствующих генов с помощью генетического кода. Естественно, наибольшую надежность обеспечивает сочетание этих методов.

Исследование первичной структуры белка начинается с определения его молекулярной массы, аминокислотного состава, N- и С-концевых аминокислотных остатков. Поскольку пока не существует метода, позволяющего установить полную первичную структуру белка на целой молекуле, полипептидную цепь подвергают специфичному расщеплению химическими реагентами или протеолитическими ферментами. Смесь образовавшихся пептидных фрагментов разделяют и для каждого из них определяют аминокислотный состав и аминокислотную последовательность.

После того как структура всех фрагментов установлена, необходимо выяснить порядок их расположения в исходной полипептидной цепи. Для этого белок подвергают расщеплению при помощи другого агента и получают второй, отличный от первого набор пептидных фрагментов, которые разделяют и анализируют аналогичным образом.

Предположим, что исследуемый белок имеет последовательность, представленную на схеме. При действии на него трипсином гидролизуются связи Lys--Val и Arg--Ser, а при обработке бромцианом (BrCN) расщепляются связи Met--Туr и Met--Ala.

Сопоставление аминокислотных последовательностей бромциановых и триптических пептидов позволяет однозначно выяснить их расположение вдоль полипептидной цепи белка. Обычно для определения полной структуры белка двух гидролизов оказывается недостаточно, причем, чем длиннее полипептидная цепь белковой молекулы, тем большее число различных типов расщеплений белка приходится использовать.

На завершающей стадии исследования первичной структуры белка проводится определение положения дисульфидных мостиков, если таковые имеются.

Определение аминокислотного состава

Анализ аминокислотного состава включает полный кислотный гидролиз исследуемого белка или пептида с помощью 5,7 н. соляной кислоты и количественное определение всех аминокислот в гидролизате. Гидролиз образца проводится в запаянных ампулах в вакууме при 110°С в течение 24 ч. При этом полностью разрушается триптофан и частично серин, треонин, цистин и цистеин, а глутамин и аспарагин превращаются соответственно в глутами новую и аспарагиновую кислоты. В то же время пептидные связи, образованные аминокислотными остатками с разветвленной боковой цепью (Val, Ile, Leu), из-за стерических препятствий гидролизуются частично. Особенно стабильны связи Val--Val, Ile--Ile, Val--Ile и Ile--Val.

С целью более надежного определения аминокислотного состава белка проводится параллельный гидролиз в течение 24, 48. 72 и 96 ч и все пробы далее количественно анализируются. Для валина, леицина и изолеицина берутся максимальные значения, а для серина и треонина полученные значения экстраполируются к нулевому времени (рис. 3).

При анализе содержания в белке триптофана вместо соляной кислоты для гидролиза используется 4 н. метансульфокислота. Триптофан можно идентифицировать спектрофотометрически или с помощью цветных реакции.

Обычно при определении аминокислотного состава белка ограничиваются анализом суммарного содержания глутамина и глутаминовой кислоты, аспарагина и аспарагиновой кислоты, а их дифференциация проводится в процессе установления первичной структуры Цистеин и цистин анализируются в виде цистеиновой кислоты или карбоксиметилцистеина.

Количественное определение аминокислот в гидролизате белка или пептида проводится с помощью аминокислотного анализатора -- прибора, разработанного в 1958 г. С. Муром и У. Стейном. Принципиальная схема анализатора приведена на рисунке 4.

Схема аминокислотного анализатора

Смесь аминокислот разделяется методом ионообменной хроматографии на колонке, заполненной сульфированной полистирольной смолой. Колонка промывается буферными растворами с последовательным повышением их рН и концентрации. Время удерживания каждой аминокислоты строго определенно и зависит от степени ее ионизации.

Выходящий из колонки элюат смешивается с раствором нингидрина и в специальной ячейке нагревается до 100 °С. Аминокислоты, реагируя с нингидрином, превращаются в аммиак, СО2 и альдегид. Освобождающийся аммиак взаимодействует с другой молекулой нингидрина и дает окрашенное в фиолетовый цвет производное, имеющее максимум поглощения при 570 нм. Пролин при реакции с нингидрином образует продукт желтого цвета (лмакс = 440 нм). Интенсивность окраски получающихся в результате реакции продуктов, пропорциональная содержанию аминокислот в исследуемом гидролизате, измеряется с помощью спектрофотометра, показания которого регистрируются самописцем и могут поступать для обработки в миниЭВМ.

В современных аминокислотных анализаторах надежно детектируется 1 нмоль аминокислоты, время анализа составляет 1,5 -- 2 ч и весь процесс автоматизирован (рис. 5).

Для повышения чувствительности вместо нингидрина в ряде анализаторов применяют флуорескамин или о-фталевый альдегид, которые при реакции с аминокислотами образуют флуоресцирующие соединения. С использованием специального детектора в этом случае удается регистрировать 10-50 пмолей аминокислоты.

Размещено на Allbest.ru