Определение аминокислотной последовательности

Размещено на http://www.allbest.ru/

1

Реферат

Определение аминокислотной последовательности

схема разделение определение последовательность аминокислота

Для установления аминокислотной последовательности белков используется совокупность химических, ферментативных и физико-химических методов. Ниже будут рассмотрены те из них, которые нашли наиболее широкое применение в практике структурной химии белка.

Метод Эдмана. Основным методом определения аминокислотной последовательности является метод деградации полипептидной цепи с помощью фенилизотиоцианата (ФИТЦ), разработанный П. Эдманом в 1950 -- 1956 гг. Метод Эдмана позволяет последовательно отщеплять N-концевые аминокислотные остатки в виде фенил-тиогидантоинов (ФТГ). Каждый цикл деградации включает три стадии: 1) образование фенилтиокарбамоил (ФТК)-пептида, 2) отщепление N-концевого остатка аминокислоты в форме анили- нотиазолинона, 3) изомеризацию тиазолинона в ФТГ и идентификацию последнего.

На первой стадии происходит присоединение ФИТЦ к непротони- рованной а-аминогруппе пептида.

Реакция проводится в летучих буферных системах (рН9,0--9,5); в качестве оснований используются третичные или гетероциклические амины (триэтиламин, диметилаллиламин, пиридин). Выход на этой стадии может существенно снижаться вследствие побочных реакций. Такими реакциями являются окислительное десульфирование ФТК-группы пептида под действием кислорода воздуха, блокирование б-аминогруппы пептида за счет образования оснований Шиффа со следовыми количествами альдегидов, присутствующих в реагентах и растворителях. Поэтому все стадии деградации пептида по методу Эдмана проводятся в атмосфере инертного газа, а употребляемые реагенты предварительно тщательно очищаются. В щелочных условиях ФИТЦ гидролизуется с образованием дифенилтиомочевины и анилина.

Побочные продукты затрудняют идентификацию фенилтиогидантоинов аминокислот, поэтому после стадии присоединения производится экстракция реакционной смеси бензолом для удаления остатков ФИТЦ и побочных продуктов.

На второй стадии деградации в присутствии безводной сильной кислоты (обычно трифторуксусной) происходит отщепление N-концевой аминокислоты с образованием 2-анилино-5-тиазолинона и освобождение б-аминогруппы последующего аминокислотного остатка.

Условия реакции достаточно мягкие и обычно не вызывают неспецифического расщепления полипептидной цепи.

Однако остатки глутамина, когда они становятся 1Ч-концевыми в пептиде, могут превращаться в остатки пироглутаминовой кислоты, блокирующие дальнейшую деградацию.

Аспарагин в кислых условиях (особенно в случае последовательности Asn -- Gly) может образовывать циклический имид, также препятствующий процессу.

Рис. 15. Разделение пептидов аффинной хроматографией на иммуносорбенте.

Стадия изомеризации состоит из двух последовательных реакций -- быстрый гидролиз тиазолинона в ФТК-производное аминокислоты и циклизация последнего в З-фенил-2-тиогидантоин.

Некоторые ФТГ частично разрушаются в условиях изомеризации (1 н. HCl, 80^OС, 10 мин). Так, ФТГ серина легко отщепляет молекулу воды, в меньшей степени процесс деградации протекает и у треонина. Для предотвращения разрушения ФТГ изомеризация иногда проводится в присутствии различных тиолов (дитиоэритритол, бутандитиол и др.).

Идентификация отщепленных ФТГ является определяющей стадией в процессе деградации пептидов по методу Эдмана.

В течение длительного времени для этой цели использовалась хроматография на бумаге, однако затем она была вытеснена другими более чувствительными и скоростными методами: микротонкослойной хроматографией на силикагеле и полиамиде, жидкостной и газожидкостной хроматографией.

Для одномерной и двумерной микротонкослойной хроматографии разработан ряд систем растворителей. Способ обнаружения ФТГ основан на сильном поглощении этих производных в УФ-области спектра (л_макс = 265 -270 нм, среднее значение молярного коэффициента экстинкции равно 16000). В состав сорбента на пластинках добавляется флуоресцентный индикатор. Чувствительность метода составляет 1 нмоль вещества.

Жидкостная и газожидкостная хроматография для идентификации ФТГ обычно используется в комбинации с автоматической деградацией пептидов на секвенаторе (см. ниже).

При газожидкостной хроматографии ФТГ после перевода в летучее состояние разделяются на специальных колонках, наполненных жидкой фазой (обычно смесь силиконовых фаз). Некоторые ФТГ перед хроматографированием необходимо силилировать, чтобы повысить их летучесть (Asp, Glu, CMCys, CysS0₃H) или улучшить разделение (Ser, Thr, Lys). Поэтому анализ обычно проводится в два приема (до и после силилирования).

В последние годы наиболее широкое применение для идентификации ФТГ находит жидкостная хроматография высокого разрешения на колонках с обращенной фазой. Хроматография проводится либо в градиенте концентрации ацетонитрила или метанола (рис. 16), либо в изократных условиях (в отсутствие градиента).

Достоинствами метода являются: высокая чувствительность (30 -- 50 пмоль), скорость (на один анализ требуется менее 10 мин), хорошая разрешающая способность и возможность количественного определения ФТГ. Часто для идентификации аминокислот, отщепляемых при деградации пептидов по методу Эдмана, используются также масс-спектрометрия и аминокислотный анализ. В последнем случае анализируемый ФТГ вначале гидролизуется с помощью НI до свободной аминокислоты.

Рис. 16. Разделение ФТГ-аминокислот (50 пмоль) методом ВЭЖХ на колонке с обращенной фазой («Ультрасфер ODS») в градиенте ацетонитрил > три-фторацетат натрия.

Среди модификаций метода Эдмана широкое применение нашел метод, сочетающий последовательную деградацию пептида с анализом N-концевых аминокислотных остатков в виде их дансильных производных (ДНС-Эдман). По этому методу перед каждым циклом деградации отбирается определенная аликвотная часть пептида для анализа N-концевой аминокислоты (рис. 17). Достоинства метода -- более высокая чувствительность определения ДНС- аминокислот и меньшие потери материала на каждой стадии деградации за счет исключения экстракции бензолом ФТК-производных пептидов. Ограниченная доступность биологического материала вызывает необходимость работы с субмикроколичествами белков и побуждает к поиску новых методов структурного анализа. Существует большое число аналогов ФИТЦ, которые образуют тиогидантоины, обладающие рядом преимуществ по сравнению с ФТГ. Наибольшее распространение в практике лабораторных исследований получил 4-N,N-диметиламиноазобензол-4'-изотиоцианат (ДАБИТЦ).

Образующиеся при деградации пептида с ДАБИТЦ ярко-розовые 4-N,N-диметиламиноазобензол-4'-тиогидантоины (ДАБТГ) имеют коэффициент экстинкции (е₄₃₆ = 34 ООО) примерно в два раза более высокий, чем у ФТГ. Чувствительность идентификации ДАБТГ при тонкослойной хроматографии на полиамиде составляет 0,01 -- 0,05 нмоль (рис. 18).

Чтобы избежать необходимости использования высоких температур (75° С) для количественного связывания ДАБИТЦ с N-концевой аминогруппой, применяется двойное карбамоилирование (сначала с ДАБИТЦ, а затем с ФИТЦ) при обычной температуре (45°С). Метод дает хорошие результаты особенно при анализе труднорастворимых гидрофобных пептидов. К его недостаткам следует отнести затруднения с идентификацией неустойчивых ДАБТГ серина, треонина и лизина.

Рис. 18. Разделение ДАБТГ-аминокислот двумерной тонкослойной хроматографией на полиамиде.

Автоматическое определение аминокислотной последовательности. Крупным достижением в области структурных исследований белков явилось создание в 1967 г. П. Эдманом и Дж. Бэггом секвенатора -- прибора, который с высокой эффективностью осуществляет последовательное автоматическое отщепление N-концевых аминокислотных остатков по методу Эдмана. В секвенаторе все реакции проводятся в цилиндрическом стеклянном стаканчике СН₃ СН₃ (рис. 19), вращающемся с постоянной скоростью в атмосфере инертного газа. Исследуемый образец белка наносится в виде тонкой пленки на стенки стаканчика, а реактивы и растворители по шлангу подаются на его дно. За счет центробежной силы они поднимаются по стенкам, соприкасаются с пленкой белка, затем собираются в специальной канавке в верхней части стаканчика и удаляются по отводному шлангу. Большая поверхность соприкосновения между двумя фазами способствует легкому проникновению реагентов сквозь пленку белка, быстрому протеканию реакций и беспрепятственной экстракции продуктов реакции.

В секвенаторе исключен контакт анализируемого образца белка с кислородом воздуха и стандартизованы условия проведения всех стадий реакции. Наряду с тщательной очисткой используемых реагентов и растворителей, это позволяет проводить автоматическое отщепление аминокислотных остатков с выходом 95% и выше. Для предотвращения испарения реагентов в большой объем реакционного стаканчика в качестве основания в реакции присоединения применяют квадрол -- (N,N,N^',N'-тетракис-2-гидроксипропил)-этилендиамин, а в реакции отщепления -- гептафтормасляную кислоту, обладающие пониженной летучестью.

В секвенаторе проводятся только первые две стадии реакции Эдмана -- присоединение и отщепление. Образовавшиеся в результате анилинотиазолиноны экстрагируются и собираются в коллекторе фракций. Их превращение в ФТГ осуществляется вручную или с помощью автоматической приставки -- конвертера.

Наилучшими объектами для жидкофазного секвенатора являются белки и пептиды, содержащие в своем составе от 60 до 200 аминокислотных остатков. Для них обычно удается определять последовательность 30 -- 50 остатков. При исследовании более крупных белков в процессе деградации наблюдается значительный гидролиз лабильных пептидных связей внутри полипептидных цепей. С другой стороны, короткие пептиды, особенно пептиды, содержащие в своем составе гидрофобные аминокислотные остатки, интенсивно вымываются из стаканчика секвенатора. Для предотвращения такого рода потерь пептидов разработан ряд методических приемов. Один из них предусматривает добавление в реакционную камеру специальных носителей, препятствующих механическому удалению пептида.

Рис. 19. Схема реакционной камеры жидкостного секвенатора.

В качестве носителей используются белки, не содержащие свободной б-аминогруппы (например, цитохром с), или синтетические полимеры: полиорнитин и полибрен.

Растворимость пептида в органических растворителях резко уменьшается при увеличении его гидрофильности. Для повышения гидрофильности можно использовать так называемые реагенты Брауницера, являющиеся высокополярными аналогами фенилизо-тиоцианата.

Если на первой стадии деградации по методу Эдмана вместо ФИТЦ добавить реагент Брауницера, то за счет модификации е-аминогрупп значительно повысится гидрофильность лизинсодержащих пептидов, в результате чего они могут успешно анализироваться с помощью секвенатора.

Другой вариант автоматического определения аминокислотной последовательности коротких пептидов, основанный на ковалентном присоединении их к нерастворимому носителю, предложен Р. Ларсеном. Реакционным сосудом в твердофазном секвенаторе служит хроматографическая колонка, с носителем которой кова- лентно связан исследуемый пептид. Через колонку последовательно пропускаются необходимые реагенты и растворители. Присоединение пептида к носителю является определяющей стадией в процессе. Для этой цели широко применяются матрицы на основеполистирола и пористого стекла. В качестве функциональной группы, реагирующей с пептидом, обычно используется алифатическая (ароматическая) аминогруппа, связанная с носителем «ножкой» различной длины.

Легко могут быть иммобилизованы бромциановые пептиды, содержащие в качестве С-концевого остатка реакционноспособный лактон гомосерина; для полного превращения остатка гомосерина в лактон они предварительно обрабатываются трифторуксусной кислотой.

Конденсация лактона гомосерина с аминогруппами носителя обычно проходит с выходом 60 -- 100% и не сопровождается побочными реакциями. Аналогичным образом для ковалентного присоединения пептидов используется лактон, образующийся при расщеплении пептидных связей по остаткам триптофана с помощью N-бромсукцинимида или ВNРS-скатола.

Лизинсодержащие пептиды присоединяются к носителю по е-аминогруппам путем конденсации с п-фенилендиизотиоцианатом. При этом связанной с носителем оказывается также и б-аминогруппа N-концевого остатка пептида. Однако после первого цикла деградации освобождается б-аминогруппа второго аминокислотного остатка, и процесс может быть продолжен обычным образом. Метод применим также для пептидов, содержащих остатки аминоэтилцистеина и аргинина. Последние предварительно превращаются в остатки орнитина с помощью гидразинолиза.

Условия гидразинолиза являются достаточно жесткими (80°С, 64%-ный гидразин, 10 мин), что приводит к частичному расщеплению пептидных связей, а общий выход реакции присоединения не превышает 30 -- 55%.

Пептиды, содержащие цистеин, могут быть ковалентно присоединены к специальному носителю с помощью реакции тиол-дисульфидного обмена (см. выше).

Наиболее общий вариант иммобилизации пептида -- присоединение по С-концевой карбоксильной группе. В качестве конденсирующих агентов используются водорастворимые карбодиимиды (например, N-этил-N'-диметиламинопропилкарбодиимид). Как правило, б-аминогруппа пептида предварительно защищается с помощью легко удаляемой трет-бутоксикарбонильной группы или ФТК-группы, образующейся при реакции с ФИТЦ. В отличие от перечисленных выше методов, выходы при конденсации с помощью карбодиимида непредсказуемы и колеблются в диапазоне 0 -- 90%. Легче других присоединяются к носителю короткие аргининсодержащие пептиды.

Твердофазный секвенатор позволяет получать наилучшие результаты при анализе пептидов, содержащих от 5 до 40 аминокислотных остатков. Иногда он применяется и для изучения структуры более крупных пептидов и белков, особенно гидрофобных, легко вымываемых из реакторов жидкофазного прибора. С помощью этого метода удается определять последовательность 20 -- 25 аминокислотных остатков.

В 1981 г. Л. Худ и М. Ханкепиллер сконструировали новую модель секвенатора -- газофазный секвенатор, предназначенный для анализа микроколичеств белков и пептидов. В приборе (рис. 20) исследуемый образец наносится на небольшой (диаметр 10 мм) диск из пористого стеклянного волокна, пропитанный полибреном. После высушивания диск зажимается между двумя стеклянными цилиндрами, образующими миниатюрную реакционную камеру (внутренний объем 0,05 мл) (рис. 21). Через капилляр в центре верхнего цилиндра (диаметр 0,5 мм) в реакционную

камеру подаются необходимые реагенты (летучие -- в газообразном состоянии), которые, проходя через поры диска, взаимодействуют с адсорбированным на нем белком или пептидом и далее выводятся через капилляр в нижнем цилиндре.

Ферментативные методы. Для определения структуры пептидов и белков можно применять ферменты, катализирующие отщепление N- и С-концевых аминокислотных остатков полипептидной цепи (аминопептидазы и карбоксипептидазы). Гидролиз пептидов с помощью карбоксипептидаз является основным способом определения С-концевого остатка и С-концевой аминокислотной последовательности.

При исследовании структуры пептидов и белков используются карбоксипептидазы А, В, С и Y. Карбоксипептидазы A (CPA) и В (СРВ) выделяют из поджелудочной железы крупного рогатого скота, карбоксипептидазу С (СРС) -- из кожуры и листьев цитрусовых, карбоксипептидазу Y (CPY) -- из пекарских дрожжей.

Общим требованием к субстрату для всех карбоксипептидаз является наличие б-карбоксильной группы у С-концевой аминокислоты. Природа боковой цепи у отщепляемого аминокислотного остатка -- основной фактор, определяющий скорость гидролиза пептидной связи.

На скорость отщепления С-концевой аминокислоты в большой степени влияет также природа соседнего с ней остатка.

Расположенные в соседнем положении аминокислотные остатки с ароматической или алифатической боковой цепью, а также остатки дикарбоновых аминокислот значительно ускоряют отщепление С-концевой аминокислоты. Напротив, если в соседнем положении находятся глицин и пролин, скорость гидролиза снижается.

Скорости отщепления аминокислот карбоксипептидазами A и С

Все аминокислоты по скорости отщепления их карбоксипептидазами А и С могут быть разделены на 4 группы (табл. 3).

Оптимальное значение рН для пептидазной активности составляет 7,0 -- 9,0, оно меняется в зависимости от субстрата. Так, скорость отщепления С-концевых дикарбоновых аминокислот возрастает при снижении рН, тогда как скорость отщепления лизина возрастает при увеличении рН свыше 9,0.

Карбоксипептидаза В катализирует отщепление основных аминокислот (лизина и аргинина). Пептидная связь, образованная остатком аргинина, гидролизуется быстрее, чем связь, образованная остатком лизина. Для пептидазной активности оптимальное значение рН равно 8,0 -- 9,0.

Карбоксипептидаза У отщепляет практически все аминокислоты, включая пролин, и ее специфичность аналогична специфичности СРС. Гидролиз проходит наиболее эффективно при рН 5,5 -- 6,5. Оптимальное значение рН для отщепления лизина и аргинина -- 7,0.

Как и другие карбоксипептидазы, СРУ наряду с пептидазной обладает и эстеразной активностью. Кроме того, СРУ присуща также амидазная активность, т. е. фермент может быть использован и для анализа пептидов, концевая карбоксильная группа которых амидирована.

С-Концевая аминокислотная последовательность определяется следующим образом: субстрат инкубируется с ферментом при 25 -- 37°С и через определенные интервалы времени из реакционной смеси отбираются аликвотные части, реакция останавливается подкислением и количество отщепленных аминокислот определяется на аминокислотном анализаторе. Построив график зависимости количества отщепленных аминокислот от времени (рис. 22), можно определить С-концевую последовательность. Таким образом удается установить последовательность до 5 аминокислотных остатков.

Успешное определение структуры С-концевых участков пептидов и белков в значительной степени зависит от рационального выбора фермента и условий проведения процесса. Выбор карбоксипептидазы обусловливается природой исследуемого пептида. Очевидно, что при анализе триптических пептидов, содержащих основные аминокислоты в качестве С-концевых остатков, целесообразно применять СРВ или смесь CPA и СРВ. Для идентификации С-концевых остатков химотриптических пептидов используют, как правило, CPA. Установление С-концевой последовательности фрагментов, полученных в результате гидролиза белка протеиназой из St.aureus, предпочтительнее проводить с помощью CPY.

Пептидгидродазы, отщепляющие N-концевые аминокислотные остатки пептидов и белков, составляют группу аминопептидаз. Необходимым условием для действия аминопептидаз является наличие у субстрата свободной б-аминогруппы. Ферменты этой группы гидролизуют и дипептиды. В структурных исследованиях белков наибольшее применение нашли лейцинаминопептидаза (ЛАП) и аминопептидаза M (АПМ), выделяемые из почек свиньи.

Существует группа ферментов, которые при гидролизе пептидов и белков отщепляют К- или С-концевые дипептидные фрагменты. К ним относятся катепсин С, или дипептидиламинопептидаза 1 (ДАП 1), и катепсин В, или дипептидилкарбоксипептидаза. Процесс определения аминокислотной последовательности с помощью зтих ферментов состоит из нескольких стадий: 1) гидролиз исследуемого соединения соответствующей дипептидазой, 2) разделение и идентификация отщепленных пептидов, 3) определение порядка расположения дипептидов в полипептидной цепи исследуемой молекулы.

Рис. 22. Определение С-концевой последовательности пептида с помощью карбоксипептидаз.

Расположение дипептидов в полипептидной цепи определяют либо путем изучения кинетики отщепления дипептидов, либо с помощью, так называемого метода «домино», принцип которого (рис. 23) заключается в том, что гидролиз с ДАП 1 проводят на исходном и укороченном (с помощью метода Эдмана) на один аминокислотный остаток пептиде. При этом получают дипептиды с перекрывающимися последовательностями аминокислот.

Рис. 23. Определение аминокислотной последовательности пептидов с помощью дипептидиламинопептидазы I (принцип «домино»).

Масс-спектрометрический метод. Наряду с химическими и ферментативными методами для определения аминокислотной последовательности пептидов находят применение физико-химические методы, в частности масс-спектрометрия.

Рис. 24. Ионизация молекул электронным ударом.

Процесс съемки масс-спектра соединения состоит из нескольких стадий: переведение исследуемого образца в газообразное состояние; ионизация его, при которой происходит распад большинства Строение белков и пептидов образующихся молекулярных ионов; ускорение полученных ионов в электрическом поле, последующее их разделение (в зависимости от отношения массы к заряду) в магнитном поле; и наконец регистрация масс-спектра. Вследствие цвиттер-ионного характера пептиды с большим трудом подвергаются испарению. Летучесть их может быть повышена путем ацилирования и этерификации. Для ацилирования обычно используют трифторуксусный ангидрид или N-гидроксисукцинимидный эфир жирной кислоты, например декановой. Этерификацию можно осуществить метанолом в присутствии каталитических количеств хлористого сульфурила. В ряде случаев прибегают также к переметилированию атомов азота в пептидных связях путем обработки ацилированного пептида иодистым метилом и гидридом натрия в диметилсульфоксиде.

Для ионизации исследуемых молекул в масс-спектрометре используется несколько способов. Традиционным методом ионизации является бомбардировка электронами с энергией порядка 70 зВ (рис. 24). Применяется также ионизация ультрафиолетовыми лучами (фотоионизация) или положительно заряженными ионами (химическая ионизация).

Рис. 25. Ионизация молекул ускоренными атомами Хе (или Аr).

В последнее время разработаны новые методы -- ионизация в сильных электрических полях (полевая ионизация или полевая десорбция), а также ионизация бомбардировкой ускоренными атомами (атомы Аr и Хе с большой кинетической энергией) (рис. 25). При использовании последних двух методов отпадает необходимость предварительного испарения исследуемого вещества, оно происходит одновременно с ионизацией.

В большинстве случаев в процессе ионизации происходит «выбивание» электронов из молекул испаренного вещества, в результате чего последние превращаются в положительно заряженные ионы. В молекулах пептидов легче всего ионизируются карбонильные атомы кислорода и атомы азота пептидной связи. При распаде образующихся ионов преимущественно расщепляются связи, находящиеся в в-положении к положительному заряду. В результате такого распада из молекулярных ионов производных пептидов образуются аминокислотные (А) и альдиминные (а) фрагменты.

Поскольку в процессе первоначальной ионизации в молекулах исследуемого пептида положительный заряд оказывается локализованным на разных атомах кислорода или азота, при их дальнейшем распаде образуется набор всех возможных фрагментов аминокислотного и альдиминного типа фрагментации (А и а).

Идентификация пиков аминокислотных и альдиминных фрагментов в масс-спектре дает основную информацию о строении пептида (рис. 26).

Аминокислотный тип фрагментации, конечно, не является единственным путем распада молекулярных ионов пептидов. Боковые цепи каждого аминокислотного остатка вносят свои специфические особенности в общую картину масс-спектра. Ионы фрагментов, образующихся в результате специфического распада боковых цепей, дают дополнительную информацию о структуре пептидов.

Одно из преимуществ масс-спектрометрического метода заключается в возможности анализировать пептиды, не содержащие свободной б-аминогруппы, и устанавливать химическую природу блокирующего остатка. При использовании электронной ионизации метод пригоден для анализа сравнительно коротких (4 -- 6 остатков) пептидов.

Границы возможностей масс-спектрометрии в изучении структуры пептидов резко расширились с введением более современных методов ионизации. Применив для этой цели бомбардировку ускоренными атомами, Г. Моррис показал, что можно получать масс-спектры пептидов, молекулярная масса которых достигает 3000, причем для определения структуры достаточно 1 -- 5 нмоль вещества, т. е. в таком случае по чувствительности масс-спектрометрический метод не уступает другим методам.

Одним из достоинств бомбардировки ускоренными атомами, так же как и полевой десорбции, является исключение стадии предварительной модификации пептида. В настоящее время масс- спектрометрия с ионизацией бомбардировкой ускоренными атомами является одним из наиболее прогрессивных методов анализа структуры пептидов средней молекулярной массы (15 -- 40 аминокислотных остатков). Особенно эффективно использование метода на завершающих стадиях анализа в сочетании с предварительным исследованием структуры пептида на секвенаторе.

При ионизации полевой десорбцией масс-спектры пептидов состоят практически из одних молекулярных ионов. На этой основе Я. Шимониши был разработан метод исследования структуры белка путем непосредственного анализа смеси пептидов, получаемых после ферментативного гидролиза.

Смесь пептидов подвергается деградации по методу Эдмана, и после каждого этапа, наряду с идентификацией отщепленных аминокислот, масс-спектрометрически по молекулярным ионам определяются молекулярные массы

Рис. 26. Принцип масс-спектрометрического метода определения аминокислотной последовательности пептидов.

Рис. 27. Комбинация метода Эдмана и масс-спектрометрии в анализе структуры белка.

пептидов (рис. 27). Обработка полученных данных на ЭВМ позволяет в большинстве случаев однозначно устанавливать аминокислотную последовательность пептидов гидролизата. Метод особенно эффективен при сравнительном изучении структуры мутантных белков.

Хорошие результаты удается также получить при использовании масс-спектрометрии с ионизацией полевой десорбцией или бомбардировкой ускоренными атомами для анализа С-концевой последовательности пептидов в сочетании с ферментативным гидролизом с помощью карбоксипептидаз.

Размещено на Allbest.ru