Анализ биологических тканей и жидкостей

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Реферат

«Анализ биологических тканей и жидкостей»

Пермь 2010

Введение

Химия всегда была связана с медициной, а в XVI-XVII в.в. практически целиком «работала» на нее (период ятрохимии). Многие химики тех времен были по образованию, а иногда и по роду занятий, врачами - Парацельс, Я.Б. Ван Гельмонт, Г.Э. Шталь, К.Л. Бертолле, А.П. Бородин и прочие. В первую очередь химию использовали для получения лекарств, но химические подходы со временем все больше применяли и в целях диагностики, а это уже ближе к химическому анализу.

Постепенно сложились следующие направления анализа медицинских объектов:

- клинический анализ - исследование состава крови, мочи и др.;

- фармацевтический анализ - анализ лекарственных объектов.

К менее распространенным медицинским исследованиям можно отнести поиск и определение новых маркеров заболеваний, фармакокинетику (изучение миграции и изменений лекарственных веществ в организме), допинг-контроль спортсменов, ДНК-анализы и др.

Целью данной работы является обобщение имеющихся данных об анализе биологических тканей и жидкостей, применяемом в медицине, а также выявление основных направлений развития этой области аналитической химии.

1. Клинический анализ

Аналитическая химия довольно длительное время не уделяла внимания медицинским и биологическим объектам. Методический уровень медико-биологических исследований, которыми занимались врачи или биологи, с точки зрения профессионала-аналитика был (а иногда и остается) довольно низким. В конце XX века в исследования медицинского назначения включается все больше аналитических лабораторий. Этот процесс особенно характерен для США, где на биомедицинские исследования выделяются огромные средства. За это время были разработаны новые методы, прежде всего, метод иммуноанализа. В журналах по аналитической химии постоянно растет число публикаций, посвященных исследованию медицинских объектов.

В медико-биологических исследованиях методы локального анализа не менее важны, чем определение валовых показателей химического состава.

Отдельное направление клинического анализа - токсикологические исследования. В области обнаружения ядов эти исследования смыкаются с криминалистическими. Необходимость обнаружения ядов (например, соединений мышьяка и ртути) с древних времен способствовало развитию аналитических методов. Крупными достижениями стали, например, методики обнаружения следов мышьяка, связанные с образованием и разложением арсина (реакция Марша). В руководствах по токсикологии и судебной химии всегда приводились (обычно без теоретического обоснования) методики обнаружения ядовитых веществ. Еще больше писалось об этом в газетных репортажах и детективных романах.

Обнаружение и определение веществ, являющихся маркерами заболеваний или индикаторами состояния органов человека, создание для этого новых приемов и устройств - очень интересная для аналитика область. На определении химических маркеров (точнее сказать, показателей, характеризующих химический состав) в значительной степени и основывается клинический анализ. Исследования здесь осуществляются в двух направлениях: первое - отыскание новых маркеров и создание методов их регистрации, второе - разработка новых методик обнаружения и определения веществ, биологическая роль которых уже известна. Аналитики больше занимаются работами по второму направлению. Биологические и биомедицинские исследования требуют нестандартных аналитических решений. Это, в частности, диагностика заболеваний путем обнаружения и определения их биомаркеров в моче, крови, потовых выделениях, в тканях. Так, немало эффективных инструментальных методов разработано для определения глюкозы в крови диабетиков. Эти анализы теперь делают не только в лаборатории, но и в любых удобных для больного условиях. Созданы средства, требующие для этой цели всего несколько микролитров крови. Однако повышение концентрации глюкозы может быть выяснено и косвенно - по повышенному содержанию ацетона в выдыхаемом воздухе.

Клиническим анализом заняты тысячи сотрудников контрольно - аналитических лабораторий медицинского профиля. Так, в каждой крупной клинической лаборатории ежедневно анализируют несколько десятков однотипных проб крови и мочи на сахар. Обычно они выполняются строго по стандартной методике, предусматривающей введение в пробу ряда реагентов и измерение оптической плотности полученного раствора (спектрофотометрия). Проводить сотни подобных анализов вручную - утомительный, нетворческий труд, да и не всегда лаборант, работая вручную, может обеспечить необходимую точность результатов. В последние десятилетия появились автоматические устройства для ускорения и повышения точности массовых лабораторных анализов.

На сегодняшний день наиболее распространенными методами в клиническом анализе являются иммунохимические, электроаналитические, ЯМР, хроматомасс-спектрометрические. Ниже некоторые из них рассмотрены подробнее.

2. Фармацевтический анализ

Анализ лекарственных веществ в ходе их производства, хранения, распространения - это, строго говоря, не собственно медицинский, а либо способ контроля технологических процессов, либо сертификационный анализ. Но все-таки лекарства - средства лечения, поэтому уместно будет рассмотреть его в этой работе.

История анализа лекарственных средств, сначала природного происхождения, а затем и синтетических начинается много веков назад. В аптеках работали К. Шееле, К.М. Клапрот, Т.Е. Ловиц, Ю. Либих, Ф. Мор и многие другие крупные химики. Любой провизор наряду с изготовлением лекарственных препаратов занимался проведением анализов: исследовал состав сырья, проверял качества готовых лекарств и т.д.). Для этой цели в аптеках использовали всевозможные химические, а затем и инструментальные методы.

Наиболее распространенным методом в анализе лекарств сегодня стала высокоэффективная жидкостная (отчасти - тонкослойная) хроматография.

Многие лекарственные вещества (а также пищевые добавки) используют в форме рацематов, между тем разные их составляющие (энантиомеры) могут проявлять различные полезные или вредные свойства. Уже давно стоит задача использовать, по возможности, наиболее действенную форму, что стимулировало разработку методов стереоселективного синтеза, эффективных приемов разделения рацематов и методик определения отдельных энантиомеров.

Классическим методом обнаружения и определения оптических изомеров является поляриметрия. Удобна фарадеевская поляриметрия, когда «анализатор» в поляриметре вращается не механически, а электрическим полем.

Главным методом разделения смесей и определения энантиомеров является хроматография, особенно жидкостная. Разделение в этом случае основано на использовании энантиоспецифичных неподвижных фаз.

В СССР сложились крупные фармацевтические центры, где анализ лекарственных средств занимал значительное место. Одним из таких центров был Всесоюзный научно-исследовательский химико-фармацевтический институт им. С. Орджоникидзе (Москва). В конце XX века на базе этого института был создан специализированный центр по исследованию лекарств. Серьезные исследования в области фармацевтического анализа с применением спектрофотометрии выполнялись на Украине и на Северном Кавказе, в Пятигорской государственной фармацевтической академии.

3. Анализ биоматериалов с помощью ЯМР

Метод ЯМР позволяет обнаруживать и одновременно количественно определять в биологических жидкостях тысячи компонентов, в том числе метаболиты и биомаркеры, и тем самым проводить достаточно полную диагностику организма, обнаруживать на ранних стадиях различные патологии, в том числе генетически обусловленные заболевания, формировать группы риска пациентов, предрасположенность к сердечнососудистым заболеваниям, отслеживать реакции организма на воздействие патогенов, токсических веществ и лекарственных препаратов в динамике.

Основным преимуществом ЯМР является минимальная пробоподготовка. Кроме того, метод позволяет многократно использовать одну и ту же пробу.

Основной недостаток - по чувствительности этот метод уступает хроматомасс-спектрометрии и методам оптической спектрометрии. Но он устраняется с помощью наполнения спектра - суммирование результатов увеличивает соотношение сигнал\шум пропорционально корню квадратному из числа измерений.

Помимо ЯМР 1Н все шире используется ЯМР 13С, а также ЯМР 31Р. Но, из-за небольшой концентрации этих изотопов в организме, применение этих методов ограничено.

При количественном анализе спектра возникают определенные трудности вследствие перекрывания резонансных сигналов различных соединений. Но обычно один и тот же компонент дает сигнал в различных областях, поэтому почти всегда удается найти такую область, в которой один из сигналов достаточно хорошо отделен и пригоден для интегрирования.

Особая сложность количественного анализа биологических жидкостей и тканей, которые могут содержать сотни компонентов в очень большом интервале концентраций, в том, что обычно заранее не известно, до какой глубины необходимо проводить анализ и каким минимальным уровнем содержания компонентов следует ограничиться.

При исследовании тканей методом ЯМР их используют как в набивном, так и в экстрагированном состоянии. Но отбор биожидкостей проще осуществить, поэтому они используются чаще.

При анализе спектров любых биоматериалов возникает ряд общих проблем, решение которых требует специальных методов.

1. Подавление сигнала воды

Вода - это основа любой биожидкости. Ее сигналы всегда интенсивнее сигналов растворенных веществ. Для подавления сигнала воды можно использовать лиофилизацию, а затем растворить осадок в D₂O. Но во время лиофилизации теряются летучие и нестабильные компоненты. Вследствие этого анализ теряет точность.

Чаще для подавления сигнала воды используют специальные импульсные последовательности. Одна из них - метод селективного предварительного насыщения. - на пробу воздействуют радиочастотными импульсами большой длительности, селективно натроенными на частоту сигнала воды. Разработаны и более сложные последовательности.

2. Пробоподготовка

К точно фиксированному объему биожидкости (обычно около 500 мкл) добавляют отмеренное (около 10% по объему) количество раствора образца сравнения в D₂O известной концентрации. Чаще всего в качестве такого образца используют 3-триметил - [2,2,3,3-²Н₄] - пропионат натрия.

На основе интенсивностей по стандартной методике рассчитываются концентрации всех соединений.

Положение сигналов основных компонентов сильно зависит от pH образца и температуры регистрации Поэтому, чтоб такие измерения можно было сравнивать между собой, оба эти параметра должны быть строго стандартизированы. В вязи с этим перед регистрацией к образцу добавляют стандартное количество фосфатного буферного раствора.

Для большинства измерений используют частоту ЯМР 500-700 МГц.

3. Методы обработки и интерпретации спектров

Спектр ЯМР любой биологической жидкости - это суперпозиция спектров огромного числа соединений, среди которых лишь несколько десятков представляют реальный интерес, так как только их присутствие или изменение и концентрации несет информацию, важную с точки зрения медицинской диагностики.

Полный анализ занимает много времени, не целесообразен, так как не выполняет основную задачу - быстро обнаружить аномалию и определить ее природу.

Для анализа спектров используется подход, основанный на свертке информации. Сначала отбирают группу «здоровых» людей (от нескольких десятков до нескольких сотен человек) и измеряют спектры взятых у них биологических жидкостей в строго стандартных условиях. Затем каждый спектр преобразуют в гистограмму. При этом количество данных значительно сокращается без существенной потери информации. Затем интегральные интенсивности сводят из гистограммы в таблицу по спектрам для всех измеренных образцов. Полученную матрицу данных обрабатывают с помощью стандартных методов статистического анализа. При анализе биологических жидкостей пациента достаточно определить, вписывается ли значение интенсивностей в средние показатели для здоровых людей.

Идентификация каждого компонента может оказаться достаточно важной, особенно в случае, если его можно использовать в качестве биомаркера патологии.

В особых случаях может потребоваться предварительное разделение компонентов образца. Для этого чаще всего используют высокоэффективную жидкостную хроматографию или твердофазную экстракцию.

Для ЯМР анализа в основном используют плазму крови, мочу, цереброспинальную жидкость. Ниже приведена таблица, в которой перечислены патологии, которые можно определить при анализе той или иной жидкости.

Патологии, определяемые с помощью ЯМР

Кроме перечисленных патологий возможно определение профилей метаболических заболеваний еще до того, как возникнут соответствующие симптомы, возможно выбрать диету и подходящий режим тренировок.

Главной проблемой в медицинском ЯМР анализе является интерпретация огромного количества получаемых данных, а также выявление взаимосвязи между патологией и изменением состава той или иной биологической жидкости.

4. Масс-спектрометрические методы в биомедицинских исследованиях

Масс-спектрометрия представляет собой метод исследования веществ, основанный на определении массы и относительного количества ионов, образованных из молекул, подвергнутых ионизации. Приборы, позволяющие получить масс-спектры, называются масс-спектрометрами.

Каждый масс-спектрометр независимо от деталей конструкции состоит из следующих основных элементов:

1) системы введения вещества в прибор;

2) источника ионов, предназначенного для получения ионов из анализируемых веществ;

3) масс-анализатора, предназначенного для разделения ионов по массам (вернее, по отношению массы к заряду);

4) детектора и регистрирующего устройства, предназначенного для регистрации количества образующихся ионов различной массы;

5) вакуумной системы, обеспечивающей необходимый вакуум в приборе.

Большие принципиальные возможности масс-спектрометрии появляются при сочетании её с другими методами. Сочетание методов значительно расширяет возможности каждого из них, позволяя получать больше информации об объекте исследования.

Весьма эффективными, как для хроматографии, так и для масс-спектрометрии, оказались хроматомасс-спектрометры - одни из наиболее распространенных современных аналитических приборов. В них различные типы газовых, жидкостных или ионных хроматографов (электрофореза) обеспечивают предварительное разделение вещества, а индикацию разделенных веществ и измерение их содержаний осуществляет масс-спектрометр. Поэтому масс-спектрометры в хроматомасс-спектрометрах большей частью имеют дело не со смесью соединений, а с индивидуальными соединениями, на короткое время поступающими в источник ионов.

Рассмотрим наиболее распространенные масс-спектрометрические методы.

1. Хромат - масс-спектрометрия с индуктивно связанной плазмой

В индуктивно-связанной плазме ионы генерируются при атмосферном давлении, в то время как масс-спектрометр работает при давлении меньше чем 10^-5 мБар. Между ИСП и МС используется интерфейс в виде «узкого горла», с помощью которого вытягиваются ионы из плазмы и осуществляется перепад давлений.

Этот метод позволяет определить элементный состав биоматериала.

Преимуществами этого метода являются:

· Многоэлементность

· Низкие пределы обнаружения

· Малое время анализа

· Малый объем анализируемой пробы

Недостатком является то, что спектральные и матричные влияния существенно повышают нижнюю границу определения содержания.

Метод используется для выявления нарушений микроэлементного статуса пациента путем анализа крови, мочи или волос и позволяет разработать дополнительные пути коррекции различных патологий, а также прогнозировать и предотвращать ряд осложнений.

2. Газовая хроматография-сжигание-масс-спектрометрия

Позволяет определить соотношение изотопов 13С\12С. Метод широко используется в спортивном допинг-контроле. Соотношение этих изотопов в организме человека лежит в пределах от -17 ‰ до -27 ‰. При употреблении допинг-препаратов, которые изготавливаются обычно из растительного сырья, соотношение меняется до -30‰.

Перед определением изотопного соотношения хроматографически отделяют гормоны и вещества, аналогичные гормонам. Затем проводят определение соотношения изотопов.

Основная проблема этого анализа - сложность матрицы и существенная разница концентраций целевых соединений.

Так как пробоподготовка в масс-спектрометрических методах сложная и многоэтапная, каждая проба сопровождается двумя контрольными: заведомо положительной и заведомо отрицательной.

5. Иммунохимические методы

иммунохимический ткань жидкость спектрометрический

В основе иммунохимических методов анализа лежит высокоспецифичная и высокочувствительная иммунная реакция антигена с антителами. Антитела - это белки класса иммуноглобулинов, которые вырабатываются в иммунной системе в результате проявления защитной функции (иммунитета) при попадании в организм чужеродного вещества - антигена.

Антиген - это вещество, которое индуцирует выработку антител.

Достоинства метода:

· Быстрота и простота определения;

· Возможность автоматизации и использования для массовых анализов в полевых условиях;

· Не сложная пробоподготовка;

· Высокая точность;

· Не требуется дорогостоящей аппаратуры.

Недостатками можно назвать узкую специфичность и влияние компонентов матрицы.

Метод применяется для обнаружения вирусов, гормонов, лекарственных препаратов, определения биологически активных веществ.

Для определения моновалентных антигенов используется конкурентная схема - в систему водятся меченые ферментом вещества, которые конкурируют с антигеном при взаимодействии с ограниченным числом центров связывания специфичных антител. Существует два способа реализации иммунохимического анализа - прямой и непрямой.

Прямой способ. Антитела нанесены на твердую фазу, ферментная метка вводится в антиген. Преимущества - небольшое число стадий и, соответственно, возможность автоматизации определения. Недостатки - сложность и неуниверсальность методов синтеза ферментных коньюгатов (промежуточная стадия иммунной реакции), а также возможное влияние компонентов образца на активность фермента Непрямой способ. Антиген наносится на твердую фазу, ферментной меткой отмечаются вторичные антитела, полученные против иммуноглобулинов соответствующего типа. Достоинством этого способа является возможность устранения влияний различных эффектов на каталитические свойства ферментов. На основе иммуннохимического метода создано множество тест-систем. Они реализуются обычно на микропланшетах или в пробирках. С помощью тест-систем определяются гормоны и лекарства в сыворотке крови. Кроме того, на основе иммунной реакции создаются биосенсоры.

6. Электроаналитические методы в биомедицинских исследованиях

Еще на заре развития электрохимических методов анализа (ЭМА) объекты биологии, медицины и фармации привлекали внимание исследователей. Это прежде всего относится к классической полярографии, в меньшей мере к потенциометрии и вольтамперометрии. В 30-х годах XX века чешский исследователь Бричка обнаружил каталитические волны белков в аммонийно-аммиачных буферных растворах в присутствии солей кобальта. Впоследствии этот метод был применен в медицине для диагностики рака, а затем и для других заболеваний. Он известен как серологическая реакция Брдички. Достижения классической полярографии в биологии, медицине и фармации обобщены в монографии М. Бржезины и П. Зумана, которая оказала самое плодотворное влияние на развитие этой области ЭМА. Большая часть пионерских работ в этой области анализа были выполнены исследователями, которые имели базовое образование фармацевта, что не могло не сказаться на применении этого метода в биомедицинских исследованиях. С помощью методов ВА определяли различные метаболиты, белки, идентифицировали ферменты, оценивали их активность по продуктам ферментативных реакций, исследовали процессы в микроорганизмах, субклеточных культурах, в тканях по продуктам их жизнедеятельности. Кроме того, эти методы применяли для получения электрохимических характеристик веществ, участвующих в переносе электронов в процессе дыхания и фотосинтеза, при моделировании окислительно-восстановительных процессов в живой клетке, а также для исследования структурных особенностей биологических макромолекул и биомембран и т.д. В 60-х годах с появлением ионселективных электродов (ИСЭ) стало возможным потенциометрическое определение катионов и анионов как in vitro, так и in vivoв растворах, включая цельную кровь.

Прогресс в области ионометрии и разработки новых ИСЭ с улучшенными характеристиками, в частности, на основе полевых транзисторов привел к появлению разнообразных потенциометрических сенсоров, устройств и приборов для определения органических и неорганических, в том числе и лекарственных, соединений в различных условиях (в потоке жидкости, в очень малых объемах растворов и т.д.). Современная биохимическая лаборатория возможность использовать ионометрические установки как для прямого определения, так и для потенциометрического титрования в водных и неводных средах.

Достигнутые успехи не означали отсутствие проблем, обусловленных перманентными требованиями к необходимой воспроизводимости, надежности, чувствительности, а также селективности определений, особенно для электродов-сенсоров с амперометрическим откликом, которые порой трудно достигались, поскольку компоненты, определялись в сложных по составу матрицах. Потенциометрические сенсоры на основе мембран с включенными в них электроактивными органическими соединениями показали достаточно высокую селективность при определении этих же соединений в испытуемом растворе. Их используют при анализе порошков, суппозиторий, таблеток и других лекарственных форм; при этом не требуется сложная пробоподготовка.

Новый этап развития ЭМА применительно к обсуждаемым объектам связан с применением биоматериалов как реагентов нового поколения для модифицирования электродов и создания на их основе биосенсоров.

Функционально биосенсоры сопоставимы с датчиками живого организма - биорецепторами, способными преобразовывать все типы сигналов, поступающие из окружающей среды, в электрические, которые легко измерить.

Биосенсоры, с одной стороны, можно рассматривать как устройства, работающие на принципах биологического распознавания определяемых молекул или других частиц. Поэтому их можно отнести к категориям биологических и биохимических методов анализа.

С другой стороны, биосенсоры - это биоэлектронное устройство, включающее чувствительный элемент, тесно связанный с физическим преобразователем либо интегрированный с ним, чаще всего с электродом. Интерес к биосенсорам обусловлен их широким потенциальным применением в контроле состояния окружающей среды и охране здоровья человека.

Многообразие биосенсоров объясняется различной природой биоматериала, типом физического преобразователя, способами регистрации электрического сигнала. Сама их конструкция может быть тесно связана с применением.

Что касается метода регистрации, то при интегральной оценке развития ЭМА периода последних 5-15 лет в аспектах биологии и медицины, можно увидеть возрастание удельного веса ВА и родственных методов среди других.

Сейчас наблюдается заметное проникновение идей супрамолекулярной химии в область ЭМА. Молекулярный дизайн и нанотехнология в создании новых электродов и на их основе микроаналитических систем для целей медицинской диагностики теперь рассматривают как еще один путь развития электроанализа и расширения сфер его применения. Самоорганизующиеся монослои (СОМС) на поверхности электродов - это частный случай высокоупорядоченных слоев с точно контролируемой толщиной и направленной ориентацией молекул - представляют уникальную возможность для изучения фундаментальных аспектов электроаналитической химии, включая процессы накопления определяемого компонента, селективность СОМС, факторы, влияющие на величину сигнала.

С помощью субстратных биосенсоров определяют широкий круг различных физиологически важных соединений или их метаболитов в растворе или непосредственно в организме человека: глюкозу, мочевину, спирты, органические кислоты и т.д., и решают проблему диагностики заболеваний.

Интерес представляет амперометрический сенсор на гемоглобин в цельной крови. Его быстрый отклик стабилен и воспроизводим и обусловлен окислением гемоглобина при фиксированном потенциале на стеклоуглеродном электроде, покрытом слоем полимера на основе метиловой сини. Этот полимер образуется на поверхности электрода при циклическом изменении потенциала в некотором диапазоне, зхависящем от состава раствора.

Из последних достижений в конструировании электрохимических сенсоров можно отметить создание с использованием планарной технологии микросенсорных батарей на основе ИСЭ для определения концентраций ионов водорода и калия в кровотоке работающего сердца. Такие устройства могут найти применение в медицине, в частности при хирургическом вмешательстве в области миокарда.

В таблице в качестве примера дан перечень основных компонентов, определяемых методами электроанализа в объектах биомедицинского назначения и фармации, который в целом отражает структуру области биоэлектроники.

ДНК-сенсор конструируют и на основе двухнитивой ДНК. В этом случае возможно определение тех компонентов, которые нарушают структуру ДНК как интеркаляторы. Возможны и другие прощессы, нарушающие структуру ДНК, что отражается на электрохимических свойствах этого типа биослоя.

Большинство рассмотренных биосенсоров дают устойчивый отклик не только в условиях стационарной жидкости, но и в потоке.

Сейчас в ряде областей аналитической химии, биологии и медицины ощущается потребность в миниатюрных сенсорах на основе электрохимических микропреобразователей, созданных по технологии интегральных схем. Миниатюризация сенсоров в сочетании в их высокой селективностью и чувствительностью, достигаемых за счет использования биоматериалов, позволит решать важные задачи биологии и медицины, в том числе и определение отдельных крупных молекул.

Заключение

Развитие методов аналитической химии в биомедицинских исследованиях ускоряется с каждым годом. При этом основными задачами остаются экспрессность и точность метода, возможность проведения анализа в полевых условиях, снижение его стоимости. Кроме того, разработка новых методов невозможна без тесного сотрудничества аналитиков и медиков. К сожалению, на сегодняшний день эти две группы специалистов развиваются параллельно, не взаимодействуя. Но без сомнения можно сказать, что, объединившись, исследователи поднимут биомедицинский анализ на качественно новый уровень, на котором будут учитываться в полной мере и биологические закономерности организмов, и химические закономерности.

Список литературы

1. Золотов Ю.А. История и методология аналитической химии. «Академия», 2008. С. 212-218

2. Журнал аналитической химии. 2000 г. - №2 с. 208-211, №11 с. 1133-1143; 2001 г. - №10 с. 1015-1031; 2003 г. - №7 с. 722-723; 2005 г. - №3 с. 230-246; 2007 г. - №1 с. 71-75, с. 76-84; 2008 г. - №2 с. 118-136; 2010 г. - №8 с. 843-850, №10 с. 968-994.

Размещено на Allbest.ru