Размещено на http://www.allbest.ru/

Федеральное агентство по образованию

Государственное образовательное учреждение

Высшего профессионального образования

Тверской государственный технический университет

Кафедра «Биотехнологии и химии»

Современные методы секвенирования ДНК

Реферат

по биофизической химии

Тверь 2010

Содержание

Введение

1. Секвенирование ДНК методом химической деградации по Максаму-Гилберту

2. Секвенирование ДНК ферментативным методом по Сэнгеру

Заключение

Список литературы

Введение

Секвенирование ДНК - это определение ее нуклеотидной последовательности (от англ. Sequence - последовательность). Важность определения нуклеотидных последовательностей ДНК уже давно не вызывало никаких сомнений. Однако отсутствие производительных методов секвенирования ДНК делало решение этой проблемы малореальным. Главными препятствиями для определения нуклеотидных последовательностей молекул ДНК были их огромный размер и невозможность получения небольших дискретных фрагментов ДНК, пригодных для секвенирования. Однако стремительное развитие молекулярной биологии привело во второй половине 1970-х годов к долгожданной возможности определения нуклеотидных последовательностей достаточно длинных фрагментов ДНК. Очень большое значение для молекулярной биологии несло обнаружение ферментов рестрикции, позволяющих расщеплять молекулы ДНК в строго определенных местах.

Классические методы секвенирования ДНК деградацией и ферментативным построением комплементарной цепи в условиях специфической терминации, кардинально различаясь в своих подходах, требуют разделения меченых фрагментов ДНК, отличающихся по длине на один нуклеотид, в полиакриламидном гель-электрофорезе высокого разрешения. Все составляющие процесса секвенирования ДНК как тем, так и другим методами подверглись сильной модификации, и производительность сегодняшнего секвенирования просто поражает. Однако отражение только нынешнего состояния дел в этой области молекулярной биологии в отрыве от некой цепочки последовательных улучшений той или иной составляющей этих методов не способно показать тот огромный прогресс, который был достигнут усилиями очень многих ученых.

1. Секвенирование ДНК методом химической деградации по Максаму-Гилберту

Быстрый прогресс, наблюдавшийся в последние годы в различных областях молекулярной биологии, во многом обусловлен появлением эффективного метода определения первичной структуры ДНК. Этот метод, предложенный в 1977 г. Максамом и Гилбертом, основан на селективной химической модификации различных типов гетероциклических оснований в составе ДНК с последующим расщеплением межнуклеотидных связей в модифицированных звеньях. Реакции селективной модификации по каждому типу гетероциклических оснований проводятся таким образом, чтобы в каждой молекуле ДНК в среднем модифицировалось только одно звено данного типа. Поскольку все звенья данного типа в составе молекулы эквивалентны и реагируют с модифицирующим агентом с одинаковыми скоростями, то в сумме каждое звено этого типа окажется частично модифицированным. Дальнейшая обработка ДНК вторичным амином или щелочью приводит к отщеплению модифицированных гетероциклических оснований от цепи ДНК и разрыву полинуклеотидной цепи в местах отщепления гетероциклов (рис. 1).

Модификации подвергают ДНК, ³²Р-меченные по 5'-концевому нуклеотидному звену. Радиоактивная метка вводится фосфорилированием с помощью -³²Р-АТР и Т4-полинуклеотидкиназы. Таким образом, в результате химической деградации получается набор фрагментов ДНК различной длины. Длины этих фрагментов соответствуют положению мономерных звеньев того типа, который подвергался модификации. Концевая радиоактивная метка служит точкой отсчета при определении длины продуктов химической деградации ДНК (рис. 2).

Набор полученных фрагментов фракционируется электрофорезом в ПААГ, который позволяет разделять олиго (поли) нуклеотиды, отличающиеся по длине всего на одно мономерное звено. Последовательность нуклеотидов в ДНК читается непосредственно с радиоавтографа геля.

Метод Максама и Гилберта, разработанный для анализа первичной структуры достаточно длинных ДНК, применим и для коротких (8 - 16 звенных) оли-годезоксирибонуклеотидов.

Рис. 1 Отщепление модифицированных звеньев от цепи ДНК после обработки вторичным амином или щелочью.

Рис. 2 Химическая деградация ДНК.

Набор реакций, применяемых для расщепления ДНК по мономерным звеньям определенного типа достаточно велик и постоянно пополняется: по остаткам гуанина - обработка диметилсульфатом (рис. 3); по остаткам аденина и гуанина - апуринизация 50%-ной муравьиной кислотой (по Бартону); по остаткам аденина и цитозина - расщепление гетероциклических оснований под действием 1,2 н. гидроксида натрия и по остаткам тимидина и цитозина - обработка гидразином (рис. 4).

В настоящее время широко используются два основных варианта секвенирования по Максаму -- Гилберту. В первом из них реакции химической модификации ДНК проводят в растворе, а во втором ДНК предварительно иммобилизуют на твердой фазе (например, ДЭАЭ-целлюлозе). Первый метод более традиционен, его многочисленные модификации с успехом использовались для секвенирования фрагментов ДНК различных размеров, в том числе олигонуклеотидов. В то же время второй метод имеет ряд преимуществ. Он менее трудоемок и занимает меньше времени, проще в освоении, позволяет обойтись минимальным набором оборудования. В целом оба метода обеспечивают получение вполне приемлемых результатов, а выбор одного из них определяется конкретными условиями лаборатории.

Рис. 3 Реакция селективного расщепления по остаткам гуанина

Рис. 4 Реакция селективного расщепления по остаткам тимидина и цитозина.

2. Секвенирование ДНК ферментативным методом по Сэнгеру

Ферментативный синтез олиго(поли)дезоксирибонуклеотидов с помощью ДНК-полимераз, заключающийся в копировании матричного полинуклеотида нашел блестящее применение в качестве одного из двух наиболее эффективных методов установления первичной структуры ДНК. Метод состоит в получении блоков-копий полидезоксирибонуклеотида, структура которого изучается. При этом обязательным является выполнение двух условий. Во-первых, копирование должно проводиться, начиная с определенного мономерного звена. Во-вторых, синтез копий следует осуществлять четыре раза, каждый раз останавливая его поочередно на каком-либо одном из четырех мономёрных звеньев (A, G, С или Т), иначе говоря, стремятся получить полный набор "комплементационно отраженных" копий исследуемого полинуклеотида, образование которых прекратилось в каждом из мест расположения одного из четырех мономерных звеньев нуклеиновой кислоты. Определение длины каждой копии позволяет установить положение данного мономерного звена в цепи исследуемого полинуклеотида. Длина копии определяется фракционированием в полиакриламидном геле. Этот метод, таким образом, так же как и метод, основанный на модификации оснований позволяет получать информацию о положении определенного мономерного звена в цепи полинуклеотида прямо после фракционирования.

Для получения копии исследуемого полинуклеотида в последнем выбирают точку отсчета, что достигается введением в систему ферментативного синтеза в качестве нуклеозидного компонента олигонуклеотида-затравки. Такой олигонуклеотид во всех копиях, образующихся в результате достраивания его ферментативным путем, остается постоянным 5'-концевым фрагментом, т. е. является точкой отсчета.

Копирование с помощью ДНК-полимеразы в присутствии всех четырех дезоксирибонуклеозид-5'-пирофосфатов (один из них берется ³²Р-меченным) проводят в течение ограниченного времени. Цель этого этапа - проведение статистически ограниченного синтеза для получения всех возможных копий, начиная с затравки, достроенной на одно, два и т. д. звеньев, и включая полную копию изучаемого полинуклеотида.

В идеале смесь должна включать все возможные полинуклеотиды (рис. 5), синтез которых статистически прекращается где-то в середине матричного полинуклеотида в районе ATGCTG матричной последовательности. На практике различные компоненты смеси присутствуют в разных количествах. Если такую смесь далее подвергнуть электрофорезу в полиакриламидном геле в определенных условиях, когда скорость движения пропорциональна длине цепи, на электрофореграмме обнаруживается серия полос, представляющих различные олигонуклеотиды. Такое фракционирование обычно не проводят, хотя оно может использоваться для контроля на завершающем этапе анализа. Инкубационную смесь ³²Р-меченных олигонуклеотидов различной длины в виде комплексов с матричным полинуклеотидом подвергают гель-фильтрации для удаления дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфатов и аликвоты реакционной смеси реинкубируют с ДНК-полимеразой в различных условиях. В случае "минус-системы" реинкубацию проводят в присутствии только трех дезоксирибонуклеозид-5'-три-фосфатов. Например, в «- А-системе» отсутствует dATP и каждая копия в смеси достраивается с помощью ДНК-полимеразы до места, в котором следующим мономерным звеном должен быть остаток pdA (т.е. Т в матричном полинуклеотиде). Образующуюся смесь фракционируют с помощью электрофореза и обнаруживают (ауторадиографически) ограниченное количество полос (их количество равно количеству Т в матричном полинуклеотиде). Аналогично проводят копирование в отсутствие других субстратов: - dGTP, - dCTP или - dTTP (- G-,- С- и - Т-системы соответственно). Все четыре ионофореза проводят в полиакриламидном геле параллельно.

Полученные ауторадиограммы позволяют сразу написать нуклеотидную последовательность, причем чтение цепи снизу вверх соответствует 5'3'-полярности цепи копии. Например, положение самого короткого олигонуклеотида (в " - Т-системе") указывает на то, что следующий за ним по длине олигонуклеотид заканчивается на Т, т. е. что против полосы, расположенной выше (это полоса в - А-системе), следует записать букву Т.

Рис. 5 Использование ферментативного синтеза олиго(поли)дезоксирибонуклеотидов для определения первичной структуры ДНК.

Таким же образом записывают далее в последовательности букву А (на основании положения следующего по длине олигонуклеотида, который оказался в "- А-системе") и т. д. Соответствующий участок цепи в матрице читается с учетом принципа комплементарности и антипараллельности цепей в комплексе матрица - затравка. Для проверки этих данных используют результаты анализа с помощью "плюс-системы". В этом случае дополнительное копирование (после первого этапа) проводят в присутствии ДНК-полимеразы, выделенной из бактериофага Т4, которая в отсутствие субстратов (нуклеозид-5'-трифосфатов) проявляет 3'-экзонуклеазную активность (аналогичную действию ФДЭ змеиного яда), т. е. отщепляет мононуклеотиды один за другим с 3'-конца. В то же время в присутствии субстратов ее полимеразная активность во много раз превосходит экзонуклеазную. Так, если в реакционной смеси присутствует хотя бы один дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфат (dATP в " +А-системе"), деградация каждой копии, образовавшейся на первой стадии анализа, будет проходить вплоть до места положения А (Т в матрице). В этом случае pdA включается много быстрее, чем удаляется, и, таким образом, накапливаются фрагменты, содержащие на 3'-конце цепи А. Аналогично проводят копирование в присутствии только dGTP, dCTP или dTTP. Смеси параллельно подвергают электрофорезу, как и в предыдущем случае, и получают ауторадиограммы, из которых сразу считывается последовательность 5'3'-направление, считывается также снизу вверх). Из сравнения фореграмм "плюс-" и "минус-систем" делается однозначный вывод о нуклеотидной последовательности в копиях и, следовательно, в матричном полинуклеотиде.

В настоящее время выделение фрагментов ДНК, создание рекомбинантных генов, а так же прямое секвенирование ДНК и кДНК становятся общедоступными методами благодаря широкому внедрению ПЦР (полимеразной цепной реакции).

Сущность ПЦР заключается в использовании двух олигонуклеотидов-праймеров, способных специфически гибридизоваться с последовательностями нуклеотидов на противоположных концах двух цепей участка ДНК, в качестве затравки для одновременного синтеза комплементарных цепей с противоположных концов матрицы с помощью термостабильной ДНК-полимеразы.

В ходе повторяющихся циклов (температурной денатурации ДНК, отжига и энзиматической достройки праймеров) экспоненциально увеличивается количество дискретного фрагмента, фланкированного последовательностями нуклеотидов, соответсвующих первичной структуре праймеров.

Применимость метода Сэнгера зависит от возможности получения одноцепочечных копий клонированных ДНК. Для этой цели можно использовать векторы на основе бактериофага М13. Двухцепочечную чужеродную ДНК можно клонировать в двухцепочечной репликативной форме (РФ) фаговой ДНК, при этом после трансформации в белковую оболочку будет упаковываться только одна из цепей ДНК. Во всех векторах типа М13тр используются сходные полилинкерные последовательности, поэтому для инициации полимеразных реакций пригоден один и тот же универсальный праймер. При амплификации смеси генов (например, семейства генов) необходимо провести клонирование ПЦР-продуктов в векторах типа М13, в результате каждый фаг будет содержать только одну вставку. При прямом секвенировании смеси генов наблюдается несколько одинаково расположенных полос в разных дорожках геля. При амплификации же одного гена можно проводить прямое секвенирование, не прибегая к промежуточному субклонированию.

Выбор оптимального праймера для ПЦР зависит от 5 '- и 3 '-концевых последовательностей амплифицируемого фрагмента ДНК. Кроме того, для встраивания ПЦР-продукта в полилинкерный сайт вектора М13 в 5'-конец праймеров должны быть включены подходящие рестрикционные сайты. В этом случае ПЦР-амплификация с последующей рестрикцией продукта позволит провести его встраивание в ДНК М13, рестрицированную тем же ферментом. В разные концы амплифицируемого фрагмента лучше включать сайты для разных рестриктаз, поскольку это позволит избежать отжига векторной ДНК самой на себя и обеспечит положение клонированной вставки в определенной ориентации (так называемое направленное клонирование).

При подборе праймеров необходимо учитывать следующие факторы:

а) следует убедиться в том, что амплифицируемое семейство генов не содержит консервативного внутреннего рестрикционного сайта, идентичного сайту, включенному в праймер.

б) после включения рестрикционного сайта 5' - конец праймера нужно удлинить, в противном случае рестриктаза не будет расщеплять праймер.

Перед секвенированием двухцепочечную рекомбинантную ДНК М13 необходимо перевести в одноцепочечную форму. Для этого ее вводят путем трансформации в компетентные клетки E. сoli. Бляшки, содержащие одноцепочечные рекомбинантные фаги, необходимо выколоть, нарастить в бактериальной культуре и депротеинизировать.

Затем переносят культуру в микроцентрифужную пробирку на 1,5 мл и центрифугируют в микроцентрифуге при 12 000 g в течение 5 минут. Переносят 1 мл супернатанта (содержащего чистый фаг) во вторую пробирку на 1,5 мл, добавляют 200 мкл полиэтиленгликоля и инкубируют при комнатной температуре как минимум 15 минут. Собирают фаг центрифугированием в течении 5 минут при 12 000 g и отбирают супернатант. Быстро повторяют центрифугирование и полностью удаляют все следы супернатанта.

Затем осаждают ДНК ацетатом натрия, промывают ее 70%-ным этанолом и высушивают под вакуумом. Растворяют ДНК в 30 мкл воды. Полученная ДНК представляет собой одноцепочечную матрицу для секвенирования.

Ниже приведена конкретная методика секвенирования:

Материалы

* 5 х реакционный буфер: 200 мМ трис-HCl, рН 7,5, 100 мМ MgCl₂, 250 мМ NaCl

* Буфер для разведения фермента: 10 мМ трис-HCl, рН 7,5, 5 мМ ДТТ, 0,5 мг/мл БСА

* 5 х смесь для мечения: по 7,5 мкМ dGTP, dCTP, dTTP

* Смесь для ddG-терминации: по 80 мкМ dGTP, dATP, dCTP, dTTP, 8 мкМ ddGTP, 50 мМ NaCl

* Смесь для ddA-терминации: по 80 мкМ dGTP, dATP, dCTP, dTTP, 8 мкМ ddATP, 50 мМ NaCl

* Смесь для ddC-терминации: по 80 мкМ dGTP, dATP, dCTP, dTTP, 8 мкМ ddCTP, 50 мМ NaCl

* Смесь для ddT-терминации: по 80 мкМ dGTP, dATP, dCTP, dTTP, 8 мкМ ddTTP, 50 мМ NaCl

* Стоп-раствор: 90% формамид, 20 мМ ЭДТА, 0,05% бромфеноловый синий, 0,05% ксилолцианол

* Универсальный праймер для секвенирования - 40 (0,5 пмоль/ мкл)

* [³⁵S]dATPS (1 мКи/37 МБк в 100 мкл) (Amersham, UK; в состав набора не входит)

* 0,1 М ДТТ

Методика

Все реактивы добавляют с помощью диспенсера на 2 мкл Hamilton (PB600), соединенного с адаптером и шприцом 1710 с газовым затвором. Смесь для мечения предварительно разбавляют в пять раз.

1. Для каждой секвенируемой матрицы смешивают в микроцен-трифужной пробирке на 1,5 мл для получения праймерной смеси 6 мкл воды, 1 мкл универсального праймера и 2 мкл реакционного буфера.

2. Размечают микроплашку Falcon 3911. В верхней ее части наносят номера клонов, а слева, сверху вниз, -- буквы TCGA.

3. На дно каждой ячейки наносят 2 мкл праймерной смеси, на боковые стенки -- по 2 мкл раствора секвенируемой матрицы и центрифугируют плашку. Накрывают ее пленкой Saran® и крышкой и помещают в водяную баню с температурой 70°С на 5 мин. Охлаждают плашку на столе (за это время происходит отжиг праймера и ДНК М13).

4. Пока плашка охлаждается, готовят смесь для мечения. Для этого в микроцентрифужную пробирку на 1,5 мл вносят 0,5 мкл ³⁵S-dATP, 1 мкл 0,1 М ДТТ, 2 мкл разведенной смеси для мечения и 3,5 мкл воды.

5. Размечают поликарбонатную микроплашку Techne 96® так же, как первую плашку, и в ячейки в ряду "Т" вносят по 2 мкл смеси для ddT-терминации. Аналогичным образом вносят смесь для терминации в ячейки остальных рядов и помещают плашку в термостат для микроплашек с температурой 42°С.

6. После охлаждения плашки (п. 3) в течение 30 мин добавляют к смеси для мечения (для каждой матрицы) последовательно 1,77 мкл буфера для разведения фермента и 0,22 мкл фермента Sequenase® II. (Это позволяет держать фермент Sequenase® II вне холодильника минимальное время.)

7. По 2 мкл этой смеси наносят на боковую стенку ячеек, содержащих праймерную смесь, и центрифугируют плашку для перемешивания компонентов. Включают секундомер.

8. Через 2 мин начинают переносить раствор из ячеек первой плашки в соответствующие ячейки предварительно нагретой и помещенной в термостат поликарбонатной плашки. Для этого используют обычную микропипетку, быстро меняя наконечники после каждой ячейки (помните, что использованные наконечники радиоактивны).

9. После того как перенесен раствор из последней ячейки, включают секундомер и в наконечник на шприце Hamilton набирают стоп-раствор.

10. Через 5 мин наносят по 5 мкл стоп-раствора на боковую стенку каждой ячейки и центрифугируют плашку. После центрифугирования плашку, закрытую крышкой, можно хранить в морозильнике до использования (при - 20°С ³⁵S-продукты можно хранить в течение недели).

Амплифицированные последовательности нуклеотидов можно увидеть в УФ-свете после фракционирования продуктов ПЦР с помощью гель-электрофореза вприсутствии бромистого этидия. В большинстве случаев после ПЦР при наличии 1 - 10 нг ДНК-матрицы выявляется только одна полоса ДНК ожидаемой электрофоретической подвижности.

Чувствительность и специфичность детекции продуктов амплификации значительной увеличиваются при использовании различных вариантов ДНК--ДНК-гибридизации с олигонуклеотидами-зондами, имеющими радиоактивную биотиновую, флюоресцентную или хемолюминесцентную метку. Это сделало возможным проведение работ с минимально возможным количеством материала, (например, с одной клеткой, одной копией гена) без предварительной его очистки.

В качестве исходной матрицы для ПЦР может быть использована ДНК (или кДНК, полученная с помощью предварительной обратной транскрипции РНК), выделенная как из свежеполученных клеток и тканей, так и из замороженных, высушенных или фиксированных препаратов, имеющих частично деградированные нуклеиновые кислоты, т. е. объекты, ранее недоступные для анализа.

Так, с помощью методов ПЦР была амплифицирована, клонирована и секвенирована ДНК египетской мумии, продемонстрирована возможность анализа специфических участков ДНК при наличии одного волоса, клетки, в целях идентификации личности и пола хозяина.

Серповидно-клеточная анемия, -талассемия, диабет, ревматоидный артрит, мышечная дистрофия, фенилкетонурия, гемофилия, дефицит -антитрипсина - вот далеко не полный список генетических заболеваний, которые могут быть выявлены на ранних стадиях развития эмбриона с помощью ПЦР Разработаны также подходы к раннему выявлению и прогнозированию онкологических заболеваний.

Заключение

Метод Максама-Гилберта и метод Сэнгера основаны на одном принципе. В первом используется специфическое расщепление ДНК, обусловленное природой оснований, во втором - статистический синтез ДНК, заканчивающийся на каком-либо одном из 4 нуклеотидов. Таким образом, основой обоих методов является получение полного (статистического) набора фрагментов ДНК, оканчивающихся на каждом из четырёх нуклеотидов.

Химический метод (метод Максама-Гилберта) проще использовать в том случае, когда исследуемая ДНК не слишком велика (200-500 звеньев). В том случае, если речь идет о секвенировании высокомолекулярной ДНК, лучше применять метод полимеразного копирования (метод Сэнгера), чтобы не вводить процедуру рестриктазного расщепления с выделением индивидуальных фрагментов. При ферментативном секвенировании протяженных одноцепочечных ДНК (например, бактериофагов) можно применять набор олигонуклеотидов-затравок, синтез которых в настоящее время не требует больших затрат времени и труда. Для двутяжевых высокополимерных ДНК наиболее удобен метод слепого энзиматического секвенирования с применением универсальной затравки (их выпускают многие фирмы) и обработки данных с помощью ЭВМ. Химический метод также может быть применен, но в этом случае необходимо вырезать из вектора исследуемые фрагменты ДНК, и это усложняет всю процедуру.

секвенирование дезоксирибонуклеиновая полимеразная реакция

Список литературы

1. Шабарова З.А., Богданов А.А., Золотухин А.С. Химические основы генной инженерии: Учебное пособие. - М.: Изд-во МГУ, 1994.

2. Шабарова З.А., Богданов А.А. Химия нуклеиновых кислот и их компанентов. - М.: Химия, 1978.

3. Молекулярная клиническая диагностика. Методы: Пер. С англ. / Под ред. С.Херрингтона, Дж.Макги. - М.: Мир, 1999.

4. Методы молекулярной генетики и генной инженерии. Отв. ред. Р.И.Салганник.-Новосибирск: Наука. Сиб. отд-ние, 1990.

Размещено на Allbest.ru