Синтез та властивості біологічно активних поліуретансечовин з фолієвою кислотою

Размещено на http://www.allbest.ru/

5

Размещено на http://www.allbest.ru/

Синтез та властивості біологічно активних поліуретансечовин з фолієвою кислотою

Біологічно активні полімерні матеріали, в яких іммобілізація лікарської речовини здійснюється за рахунок ковалентного зв'язку з полімерним носієм [3, 5, с. 790-795; 10, с. 120-167] привертають велику увагу дослідників, як імплантаційні матеріали з власною біологічною активністю. Фолієва кислота (N-птероіл-L-глутамінова кислота, ФК) відома як вітамін, здатний стимулювати регенераторні процеси [7]. Авторами [11, с. 50-57] ФК була використана для того, щоб покращити внутріклітинне групування при лікуванні онкологічних захворювань. Відомо [3] використання сполук ФК як аффінних носіїв для виділення різноманітних ферментів.

Оскільки ФК в організмі проявляє свою біологічну активність за рахунок наявності птерединового циклу шляхом приєднання атомів водню до атомів вуглецю і азоту в положеннях С-6, С-7 та N-5, N-8 з утворенням тетрагідрофолієвої кислоти, яка виконує біохімічну функцію коферменту в міжмолекулярному транспорті одновуглецевих груп різного ступеня окиснення [2], то введення ФК в структуру ПУС дозволить отримати матеріал з власною біологічною активністю.

Мета нашої роботи полягала в синтезі біологічно активних поліуретансечовин (ПУС) на основі макродіізоціанату, 1,6 - гексаметилендіаміну (ГМДА) та фолієвої кислоти, дослідженні біологічної активності синтезованих ПУС методом культури тканин.

Матеріали. Поліоксипропіленгліколь (ПОПГ) («Rokopol» Польща) ММ 1052 сушили при залишковому тиску 1-3 мм рт. ст. за температури (80±5)^оС в потоці сухого аргону протягом 8 год. безпосередньо перед синтезом. Вміст вологи за Фішером не перевищував 0,01-0,02%. 2,4; 2,6 - толуїлендіізоціанат (ТДІ, 80/20) (BAYER, Німеччина) очищали перегонкою в вакуумі (Т = 78-80^оС/ 3 мм рт. ст., n_D ²⁰ = 1,5678). Використовували свіжоперегнаним.

1,6 - Гексаметилендіамін (ГМДА) (Fluka, 99,9%) застосовували без додаткового очищення.

N, N'-диметилацетамід (ДМАА) (Швейцарія, 99,7%) переганяли з сумішшю бензол-вода у вакуумі (Т_кип. = (52±1)^оС/ 14 мм рт. ст.).

Лікарська речовина: Фолієва кислота (ФК) (фарм., Fluka) - N-птероіл-L-глутамінова кислота. Емпірична формула: С₁₉H₁₉N₇O₆. Т_розкл. = 250^оС. Перед синтезом сушили при 120 ^оС до постійної ваги.

Методи. Характеристичну в'язкість синтезованих полімерів розраховували за методом [6] з використанням віскозиметра Уббелоде за температури (25±0,1)^оС. Показники міцності при розриві та відносного подовження синтезованих ПУС визначали за методикою [8, с. 162-168] на розривній машині FU-1000 при швидкості руху зажиму 70 мм/хв. Дослідження молекулярних характеристик ПУС проводили методом універсальної колібровки [9] на комплекті обладнання для рідинної хроматографії фірми 8800 SLC «Du Pont» США (температура 50^оС, тиск в системі 58 бар, елюент - ДМАА).

Хімічну будову синтезованих полімерів досліджували методом ІЧ-спектроскопії. ІЧ-спектри записували на ІЧ-спектрометрі з Фур'є перетворенням «Tensor-37» в області 650-4000 см^-1 методом багаторазового порушеного повного внутрішнього відображення з використанням призми-трапеції з KRS-5 (число відображень N = 4), таблетованим з KBr. Віднесення смуг поглинання зроблено відповідно до [1].

Біологічну активність та біосумісність синтезованих полімерів досліджували методом культури тканин згідно [4, с. 54?56]. Об'єкти дослідження - зразки поліуретансечовини без ФК (ПУС) та поліуретансечовини з ФК (ПУС-ФК) у вигляді плівок. Як контроль - ФК. Клітинний матеріал одержували з підшкірно-жирової клітковини білих безпородних щурів, що в умовах культивування дає ріст фібробластів і фібробластоподібних елементів. Заміна живильного середовища в рідкій фазі проводилася на 3, 7, 10 й 14 добу культивування.

Синтез ПУС проводили у дві стадії за різним мольним співвідношенням ГМДА:ФК як 1:1, 3:1, 10:1 відповідно. На першій стадії синтезували макродіізоціанат (МДІ) на основі поліоксіпропіленгликолю (ПОПГ) та 2,4; 2,6 - толуїлендіізоціанату (ТДІ 80/20, NCO_вільн. = 6,0%). На другій стадії проводили реакцію між вільними ізоціанатними групами МДІ та амінними групами ГМДА в середовищі N, N-диметилацетаміду (ДМАА) (рис. 1).

Рис. 1 Схема синтезу ПУС

Окремо готували розчин ФК в ДМАА. За для блокування кислотних груп ФК додавали триетиламін (ТЕА) при мольному співвідношенні ФК/ТЕА = 1/2. Потім розчин ФК вводили до реакційної маси (ДМАА, Т = 60 ^оС, ? = 1 год.). Хід реакції контролювали методом ІЧ-спектроскопії (? _NCO = 2250 см^-1). Розчини полімерів виливали на тефлонові підкладки та сушили за температури (70±5) ^оС до постійної маси. Полімери одержували у вигляді жовтих прозорих плівок.

Проведені фізико-хімічні та фізико-механічні дослідження показали (табл. 1), що в ряду синтезованих ПУС зі збільшенням вмісту ФК спостерігається зменшення значень характеристичної в'язкості, фізико-механічних показників та молекулярної маси. За результатами ексклюзійної хроматографії синтезовані ПУС характеризувались як індивідуальні полімери без низькомолекулярних продуктів, що свідчить про те, що синтез пройшов без утворення побічних речовин до вичерпання всіх вихідних компонентів. Тобто іммобілізація ФК по вторинному аміну птеридину приводила до обриву макромолекулярних ланцюгів в процесі синтезу. Враховуючи можливе подальше використання синтезованих ПУС як імплантаційних матеріалів оптимальні фізико-механічні властивості має полімер ПУС-4, в якому співвідношення ГМДА: ФК = 10:1.

Таблиця 1. Фізико-хімічні та фізико-механічні властивості ПУС з фолієвою кислотою

На рис. 2 подані фрагменти ІЧ-спектрів ФК (крива 1), ГМДА (крива 2), МДІ (крива 3), МДІ+ФК (крива 4), МДІ+ГМДА (крива 5), ПУС з мольним співвідношенням ГМДА:ФК як 1:1 (крива 6), 3:1 (крива 7) та 10:1 (крива 8) відповідно. ІЧ-спектри (криві 4-8) свідчать про утворення поліуретансечовин за наявністю в структурі всіх полімерів сечовинних груп. На кривій 4 присутні смуги коливань, які можна віднести до валентних та деформаційних коливань карбонілу сечовинної групи ?_С=О - 1695 см^-1 (амід І), ?_NH - 1533 см^-1 (амід ІІ), утвореної взаємодією NH₂-групи ФК з NСО - групою МДІ. Наявність смуги поглинання ?_С=О - 1651 см^-1 (амід І) та ?_NH - 1540 см^-1 (амід ІІ) в спектрі полімеру ПУС-5 (крива 5) є свідоцтвом утворення поліуретансечовин взаємодією NH₂-групи ГМДА з NСО - групою МДІ. На ІЧ-спектрах ПУС-6 - ПУС-8 (криві 6-8) спостерігаються смуги поглинання ?_С=О - 1694 см^-1 (амід І) та ?_NH - 1535 см^-1 (амід ІІ), які можна віднести до сечовинних груп утворених внаслідок взаємодії вторинних аміногруп ГМДА та ФК з вільними ізоціанатними групами макродіізоціанату. Кількісне зростання вмісту сечовинних зв'язків в ряду полімерів (криві 6-8) підтверджується різною інтенсивністю смуг валентних коливань карбонілу уретанових та сечовинних груп ?_С=О - 1725 см^-1, ?_С=О - 1694 см^-1 відповідно. У полімері ПУС-6 (крива 6) смуги поглинання рівні за інтенсивністю, тоді як у полімері ПУС-7 (крива 7) інтенсивність смуги сечовинної групи зменшилась в 2 рази, а в ПУС-8 (крива 8) стала плечем смуги ?_С=О - 1725 см^-1. Таким чином ІЧ-спектроскопічні дослідження підтвердили проходження хімічної іммобілізації ФК з утворенням сечовинних зв'язків на полімерному носії.

Рис. 2 Фрагменти ІЧ-спектрів:

1 - ФК, 2 - ГМДА, 3 - МДІ, 4 - МДІ+ФК, 5 - МДІ+ГМДА, 6 - МДІ+ГМДА+ФК (ГМДА:ФК=1:1), 7 - МДІ+ГМДА+ФК (ГМДА:ФК=3:1),

8 - МДІ+ГМДА+ФК (ГМДА:ФК=10:1)

синтез поліуретансечовина фолієвий іммобілізований

Дослідження впливу фолієвої кислоти в складі ПУС на ріст фібробластичних елементів (ФЕ) методом культури тканин показали, що на 3 добу культивування у контрольних флаконах та у флаконах зі зразками ПУС (рис. 3а) спостерігалася міграція одиничних ФЕ. У флаконах з ПУС-ФК ріст клітин був значно більший ніж у контрольних флаконах. Також були присутні одиничні ФЕ значно віддалені від експлантату (рис. 3б).

а б

Рис. 3 Зона мігруючих ФЕ на 3 добу культивування:

а) подложка ПУС; б) подложка ПУС+ФК.

синтез поліуретансечовина фолієвий іммобілізований

На 5-7 добу у флаконах з ПУС-ФК спостерігалось формування трьох зон росту - компактної, сіткоподібної та зони мігруючих ФЕ, також було помічено що ріст клітин проходив під поверхнею полімеру. У флаконах з ПУС та контрольних флаконах сформувалася сіткоподібна зона з елементами компактної, збільшилася зона мігруючих ФЕ. На 10 добу культивування як у контрольних флаконах, так і у флаконах з ПУС були сформовані компактна та сіткоподібна зони росту. З'явилися ознаки дегенеративних змін, що проявлялися у вауколізації клітин. У флаконах з ПУС-ФК спостерігався тканеподібний ріст та збільшення зони мігруючих ФЕ. На 14 добу популяція клітин знаходиться в стадії дегенерації як в контрольних флаконах так і в флаконах з ПУС. В флаконах з ПУС-ФК збільшувалась кількість мігруючих ФЕ та з'являлися клітини полігональної форми. На 21 добу у контрольних флаконах та флаконах з ПУС (рис. 3в) спостерігалась повна дегенерація клітин, в той час як для ПУС-ФК продовжувався ріст ФЕ (рис. 3г).

Рис. 4 Культура ФЕ на 21 добу культивування:

а) дегенеративні зміни - подложка ПУС; б) активний рост - подложка ПУС+ФК.

Таким чином, введення до складу ПУС фолієвої кислоти приводить до подовження періоду росту клітинних елементів, стимуляції їх диференцировки.

В результаті виконаної роботи синтезовано ряд поліуретансечовин, модифікованих фолієвою кислотою за різного мольного співвідношення ГМДА:ФК як 1:1, 3:1, 10:1 відповідно. Дослідження методом культури тканин показали, що біологічна активність ПУС з хімічно іммобілізованою ФК проявлялась в їх здатності стимулювати ріст та диференцировку клітинних елементів в умовах культивування.

Размещено на Allbest.ru