Хроматографические методы анализа

Размещено на http://www.allbest.ru/

Хроматографические методы анализа

Хроматографией называется метод разделения и анализа смеси веществ, основанный на различной сорбции компонентов анализируемой смеси определенным сорбентом. Впервые хроматография была предложена в 1903 г. русским ученым М.С. Цветом. В настоящее время этот метод разделения и анализа смесей веществ применяется практически во всех областях химической технологии. Различают следующие основные типы хроматографии: адсорбционную, распределительную, ионообменную, электронообменную, электрофорез и гель-хроматографию.

В адсорбционной хроматографии адсорбирующей поверхностью является неподвижная твердая фаза, состоящая из мелкоизмельченного пористого материала (сорбента) - силикагеля, окиси алюминия, активированного угля, магнезии и т.п. Подвижной фазой служит жидкость или газ. Разделение анализируемых веществ основано на их различной способности к миграции в пористой среде (неподвижной фазе) за счет перемещения подвижной фазы.

Для хроматографического разделения небольшое количество анализируемого образца помещают в верхнюю часть колонки, заполненной пористым сорбентом, и пропускают через колонку сверху вниз газ или жидкость. Подвижная фаза проходит сначала через анализируемый образец, а затем движется через слой сорбента. При этом компоненты анализируемой смеси многократно распределяются между неподвижной и подвижной фазами. Вследствие различной адсорбции их на неподвижной фазе они мигрируют вдоль колонки с различной скоростью, разделяются и выходят из колонки отдельно. При контроле состава выходящей из колонки подвижной фазы можно зафиксировать моменты появления индивидуальных компонентов и определить их количественно.

В распределительной хроматографии распределение растворенного вещества происходит между двумя или более жидкими фазами или между неподвижной жидкой и газовой фазами. Неподвижная жидкая фаза может представлять собой пленку или слой либо быть диспергированной на объемном инертном твердом носителе.

В ионообменной хроматографии нерастворимой неподвижной твердой фазой является ионообменная смола, а подвижной фазой - раствор электролита.

В электронообменной хроматографии в качестве неподвижной фазы используют полимерные смолы, обладающие окислительно-восстановительными свойствами, способные избирательно окислять или восстанавливать компоненты подвижной фазы.

При электрофорезе компоненты смеси ионов на твердом носителе (например, фильтровальная бумага или колонка с сорбентом, пропитанным проводящим электрический ток буферным раствором) мигрируют с различными скоростями и разделяются на зоны под действием электрического поля. Этот метод часто используется для разделения белков (поле низкого напряжения), аминокислот и пептидов (поле высокого напряжения). В гель-хроматографии колонка заполняется адсорбентами, на поверхности которых имеются поры определенного размера (молекулярные сита). Мелкие молекулы могут проникать в поры, а крупные - нет. Поэтому мелкие молекулы более прочно удерживаются неподвижной фазой при проявлении растворителем, чем крупные, и соответственно выходят из колонки позже.

В зависимости от техники проведения хроматографического разделения различают колоночную, бумажную, тонкослойную (ТСХ), газовую, газожидкостную хроматографию (ГЖХ) и др.

Хроматографию применяют для очистки, разделения и количественного анализа веществ. Достоинствами хроматографических методов анализа являются их высокая чувствительность и селективность. Для анализа требуется небольшое количество вещества. Хроматография позволяет разделять и анализировать смеси веществ, близких по своим свойствам.

Колоночная хроматография

Колоночная хроматография, как адсорбционная, так и распределительная, является простым и удобным методом разделения смеси веществ.

Описанный выше метод адсорбционной колоночной хроматографии называется элюентным анализом. Как уже указывалось, при элюентном анализе подвижную жидкую фазу пропускают через колонку до тех пор, пока все зоны, образованные компонентами образца, не выйдут из колонки. Метод можно изменить, применяя последовательно несколько различных растворителей, подобранных таким образом, что каждый следующий является более эффективным элюирующим (вымывающим) агентом. Это позволяет ускорить процесс разделения смеси.

Для удовлетворительного разделения компонентов смеси важно соблюдать ряд условий при проведении анализа. Колонка не должна быть "перегружена" анализируемым веществом, т. е. размер пробы, загружаемой в колонку данного размера, ограничен. Рекомендуется использовать 25-50 г адсорбента на 1 г адсорбирующего материала при хорошей адсорбции и 100-1000 г адсорбента, если образец обладает слабой адсорбцией. Диффузия должна быть незначительной. Для этого используют плотный слой сорбента и увеличивают скорость движения подвижной фазы. Равновесие между подвижной и неподвижной фазами должно устанавливаться быстро. Это возможно лишь при большой скорости адсорбции и десорбции с неподвижной фазы.

Успех хроматографирования на колонке зависит главным образом от правильного выбора сорбента и подвижной фазы. Полярные сорбенты (например, окись алюминия) хорошо сорбируют полярные органические вещества из неполярных растворителей. Такие полярные вещества легко вытесняются из колонки полярным растворителем. Сорбенты классифицируют по их относительной полярности и емкости (т. е. способности сорбировать определенное количество вещества). Одним из наиболее распространенных сорбентов, используемых в колоночной хроматографии, является силикагель. По величине рН водной суспензии силикагель относят к слабокислым сорбентам. Обычно используют технический силикагель, содержащий 10-20% воды, хотя максимальная активность силикагеля достигается после нагревания в течение нескольких часов при 150-160 С. На силикагеле хорошо разделяются алкалоиды, сложные эфиры Сахаров, глюкозиды, липиды, глицериды, стероиды, аминокислоты. Использование метанола и этанола в качестве подвижной фазы снижает активность силикагеля.

Окись алюминия для хроматографии бывает основная, нейтральная и кислая. Кроме того, в зависимости от содержания воды (от 0 до 15%) различают 5 степеней активности окиси алюминия. Наиболее активную (сухую) окись алюминия получают прокаливанием при 400-450 С. В колоночной хроматографии обычно используют основную (рН 9,0-10,0) и нейтральную окись алюминия. На ней хорошо разделяются спирты, углеводороды, стероиды, алкалоиды, природные пигменты, витамины и сложные эфиры. Надо иметь в виду, что окись алюминия может инициировать многие реакции (конденсации, полимеризации и др.). При использовании окиси алюминия нельзя применять в качестве элюентов ацетон и этилацетат.

Свойства магнезии (окиси магния) сходны со свойствами окиси алюминия, однако магнезия более эффективна для разделения ненасыщенных соединений. Ее часто используют для разделения витаминов, стероидов, алкалоидов, сложных эфиров.

Активированный древесный уголь пригоден для разделения углеводов, пептидов, аминокислот. Он избирательно сорбирует ароматические углеводороды.

Растворители располагают в ряд по их элюирующей способности; обычно элюирующая способность соответствует величине диэлектрической проницаемости растворителя. Можно привести следующий ряд растворителей по уменьшению их элюирующей способности: органические кислоты, пиридин, вода, метанол, этанол, пропанол, ацетон, дихлорэтан, этилацетат, хлороформ, диэтиловый эфир, бензол, четыреххлористый углерод, циклогексан, гексан. При использовании в качестве сорбента активированного угля этот ряд обращается.

В отличие от описанного ранее (см. с. 119) метода элюирование можно прекратить, как только фронт растворителя достигнет конца колонки. После этого весь столбик сорбента аккуратно выталкивают из колонки и определяют зоны расположения индивидуальных компонентов (по окраске, свечению при облучении УФ-лампой или после обработки специальным реагентом, образующим с компонентами смеси окрашенные соединения).

Отношение пути, пройденного зоной определяемого компонента, к пути, пройденному фронтом растворителя, обозначается и является важной характеристической величиной. Большое число значений Rf включено в справочники по хроматографии, их знание облегчает идентификацию компонентов исследуемого образца.

К недостаткам адсорбционной колоночной хроматографии относится длительность элюирования.

В отличие от адсорбционной распределительная колоночная хроматография напоминает противоточную экстракцию. Она основана на распределении растворенных веществ между подвижной органической фазой и водной фазой, удерживаемой твердым носителем. Носитель должен быть инертен по отношению к разделяемым веществам, но должен хорошо удерживать неподвижную жидкую фазу. Обычно применяемые носители (силикагель, кизельгур, целлюлоза) удерживают 0,5-1 мг жидкой фазы на 1 г собственной массы. В качестве неподвижной жидкой фазы чаще всего используют воду. При разделении веществ, хорошо растворимых в органических растворителях, часто поступают наоборот: твердый носитель пропитывают органическим растворителем, а в качестве подвижной жидкой фазы используют воду.

Колоночной распределительной хроматографией удобно пользоваться для препаративного выделения чистых веществ.

Как уже отмечалось, основным недостатком колоночной хроматографии является длительность разделения. Время хроматографирования можно уменьшить, если использовать тонкослойную или бумажную хроматографию.

Тонкослойная хроматография

Для проведения тонкослойной хроматографии используют стеклянные пластинки, покрытые тонким (до 1 мм) слоем мелкозернистого сорбента. Слой сорбента может быть закрепленным или незакрепленным.

Для проведения анализа каплю раствора анализируемой смеси наносят на слой сорбента недалеко от конца пластинки. Затем этот конец стеклянной пластинки опускают в хроматографическую камеру с растворителем (пластинку располагают наклонно под углом 20-30). Под влиянием капиллярных сил растворитель движется вдоль пластинки, а компоненты анализируемой смеси движутся вместе с растворителем, но с различной скоростью, разделяясь на отдельные зоны (хроматографические пятна). После того как фронт растворителя пройдет расстояние, несколько меньшее длины пластинки, ее вынимают из растворителя, подсушивают, определяют положение хроматографических пятен (визуально, при УФ-освещении или после проявления подходящим реагентом) и рассчитывают величины Rf для отдельных компонентов смеси. Данные величины Rf сравнивают с величинами, полученными в опыте с чистым компонентом. Для установления химической природы и количества компонентов разделенные зоны соскабливают с пластинки, вещество вымывают из сорбента подходящим растворителем и после фильтрации анализируют соответствующими микроаналитическими методами (чаще всего спектральными).

Выбор сорбента и растворителя производят так же, как и при колоночной хроматографии. Аналогично проводят и распределительную тонкослойную хроматографию смесей.

В нашей стране серийно выпускается комплект "Аппаратура для тонкослойной хроматографии", в который входят: стол для закрепления пластин, шаблон для нанесения закрепленного слоя сорбента толщиной от 0,1 до 3 мм, подставка и валики для нанесения незакрепленного слоя сорбента толщиной от 0,2 до 1 мм, набор хроматографических камер, пульверизатор, камера для опрыскивания пластинок, шаблон для нанесения вещества, прибор для снятия слоя сорбента с веществом, УФ-осветители и другая необходимая аппаратура.

Для получения закрепленного слоя сорбент фиксируют на стекле. В качестве фиксаторов применяют гипс медицинский, аэросил-380, рисовый и маисовый крахмал. Для приготовления хроматографических пластин устанавливают по уровню стол для закрепления пластин, закрепляют в нем необходимое количество вымытых и высушенных стеклянных пластин и с помощью шаблона наносят на пластины слой массы, состоящей из сорбента, связующего вещества и воды. После подсыхания слоя в течение 10-15 мин пластины переносят в кассеты и досушивают в горизонтальном положении при комнатной температуре. Для приготовления пластины с незакрепленным слоем ее кладут на специальную подставку, насыпают на пластину сорбент и, раскатывая его валиком с уступом выбранной величины, получают равномерный слой сорбента необходимой толщины.

Пробу вещества наносят из микропипетки через отверстия в специальном шаблоне. Хроматографирование проводят в специальной камере. При отсутствии камеры можно воспользоваться чашкой Петри и эксикатором или любой плоской кюветой и стеклянным колпаком необходимых размеров.

Для обнаружения на хроматограмме бесцветных веществ обычно пользуются осветителями (ультрахемископами) с УФ-излучением, соответствующим длине волны 254 или 365 нм. Наиболее распространенный химический метод обнаружения хроматографических пятен заключается в опрыскивании пластины из пульверизатора реагентом, дающим цветные реакции с исследуемыми веществами. В качестве "проявителя" часто используется I2 в виде 1% раствора в метаноле или камеры с парами I2 (йодная камера). Соединения проявляются в виде коричневых пятен. Можно использовать также 50-98% серную кислоту. После опрыскивания ею пластинки нагревают до 100-150 С. При этом соединения проявляются в виде черных пятен.

Углеводы обнаруживают с помощью анисового альдегида. Для этого берут 0,5 мл анисового альдегида в 0,5 мл концентрированной серной кислоты, добавляют 9 мл С2Н5ОН и несколько капель СН3СООН. После опрыскивания пластину нагревают при 100°С в течение 20-30 мин: наблюдаются пятна голубого цвета различных оттенков.

Алкалоиды и органические основания проявляются реагентом Драгендорфа в виде оранжевых пятен, аминокислоты - нингидрином, стероиды, витамины, липиды - SbCl3 и т. д.

В настоящее время промышленностью многих стран выпускаются готовые к применению пластины из фольги или других материалов с тонким закрепленным слоем сорбента. В СССР наиболее распространены пластины типа силуфол (на фольге) производства ЧССР.

В качестве сорбента можно использовать целлюлозу в виде полосок специальной бумаги. Бумажная хроматография нашла широкое применение в практике исследовательских и аналитических работ.

Бумажная хроматография

Для разделения компонентов смеси методом бумажной хроматографии на полоску фильтровальной хроматографической бумаги в 2-4 см от конца ее помещают каплю анализируемого образца, а конец полоски опускают в растворитель, который начинает двигаться по бумаге под действием капиллярных сил. Для предотвращения дегидратации бумаги подвижную фазу обычно насыщают водой. При движении подвижной фазы компоненты исследуемого образца, нанесенного на бумагу вблизи старта, распределяются между движущимися растворителем и пленкой воды, удерживаемой целлюлозой. При этом компоненты движутся с разной скоростью в виде зон, размер которых обычно несколько больше размера начального пятна. Хроматографию на бумаге обычно проводят в закрытом сосуде (рис. 1), чтобы избежать испарения растворителя при хроматографировании. При восходящей хроматографии верхний конец полоски бумаги закрепляют в держателе, а нижний опускают в растворитель, который налит в низкую кювету или чашку Петри, расположенную на дне сосуда, в котором проводится хроматографирование. Для этих целей можно использовать также большой мерный цилиндр, на дно которого наливают подвижную фазу, а сверху закрывают стеклом.

Рис. 1 - Хроматография на бумаге: А - восходящая хроматограмма; Б - нисходящая хроматограмма; 1 - сосуд для хроматографирования; 2 - резервуар с растворителем; 3 - хроматографическая бумага; 4 - стартовые точки; 5 - разделенные компоненты; 6 - фронт растворителя

При нисходящей хроматографии растворитель движется вниз по бумаге из расположенного в верхней части сосуда резервуара с растворителем. Таким способом можно элюировать отдельные компоненты.

Проявление бумажных хроматограмм в принципе не отличается от описанного для тонкослойных.

Эффективность бумажной хроматографии зависит как от типа бумаги, так и от состава подвижной фазы. Сорта бумаги отличаются пористостью, толщиной, степенью гидратации. По скорости движения растворители различают быстрые, средние и медленные бумаги. Наиболее распространенные типы хроматографических бумаг - ленинградская, ватман и др.

Наиболее распространенные системы растворителей: СН3СООН-Н2O (15:85 объем), 1-бутанол - СН3СООН-Н20 (4:1:5), 2-пропанол - NH3 (конц.) - Н2O (9:1:2), 1-бутанол - 1,5 н. NH3 (1:1), фенол - вода и др. Состав подвижной фазы обычно подбирают экспериментально или ориентируясь на данные, приведенные в справочниках или монографиях по бумажной хроматографии.

Использование ионообменной бумаги позволяет сочетать достоинства бумажной хроматографии и ионного обмена. Такую бумагу получают путем смешения ионообменной смолы с целлюлозой, используемой для изготовления бумаги.

Бумажная хроматография имеет большое значение для качественного анализа. Использование ее в количественном анализе ограниченно.

Газожидкостная хроматография (ГЖХ)

Газожидкостная хроматография основана на физико-химическом разделении анализируемых компонентов, находящихся в газовой фазе, при их прохождении вдоль нелетучей жидкости, нанесенной на твердый сорбент. Это один из наиболее перспективных методов анализа. Широкое распространение и перспективность методов ГЖХ обусловлены тем, что они позволяют разделить и количественно определить вещества в сложной смеси даже в тех случаях, когда они сходны по химическим свойствам, а температуры кипения W различаются на десятые доли градуса. Для анализа требуются очень малые количества вещества, а время определения обычно исчисляется минутами.

Разделение анализируемых веществ происходит в колонках (трубках), наполненных твердым пористым сорбентом, на который нанесена жидкая нелетучая стационарная фаза. Пары анализируемых веществ, смешанные с газом-носителем, движутся через колонку. При этом происходит многократное установление равновесия между подвижной газовой и жидкой стационарной фазами, обусловленное многократным повторением процессов растворения и испарения. Вещества, лучше растворимые в стационарной фазе, дольше удерживаются ею. Благодаря этому происходит разделение анализируемой смеси на отдельные компоненты, которые выходят из колонки отдельно и регистрируются на выходе.

Эффективность использования метода ГЖХ в каждом отдельном случае зависит от правильного выбора жидкой фазы, размера частиц и природы твердого носителя, скорости и природы газа-носителя, температуры, количества вводимой пробы, длины колонки и других факторов. Поскольку теоретический учет этих факторов не всегда возможен, эффективность анализа ГЖХ в большой степени зависит от практических знаний и опыта экспериментатора.

Поведение анализируемого вещества в колонке хроматографа можно охарактеризовать временем удерживания (fe), Т. е. временем, прошедшим от момента ввода пробы в колонку до момента появления максимума хроматографического пика этого компонента. Очевидно, что эта величина при прочих равных условиях будет зависеть от объемной скорости газа-носителя (F). Поэтому хроматографические пики принято характеризовать величиной удерживаемого объема (VR):

Удерживаемый объем зависит от размера пробы и ряда других факторов. Поэтому для расчетов применяют не простую величину Vr, а исправленную с учетом времени удерживания несорбирующегося вещества (воздух, инертный газ) - t0; мертвого объема, равного удерживаемому объему несорбирующегося вещества, - Vm, сжимаемости j; массы неподвижной фазы W; абсолютной температуры колонки T и т.д.

Довольно часто пользуются исправленным удерживаемым объемом VR, который представляет собой разность удерживаемого объема вещества и удерживаемого объема газа-носителя:

Вдоль каждой колонки существует градиент давления. Поэтому вводят поправочный коэффициент j, который учитывает сжимаемость газа в колонке:

где Pi - давление газа-носителя на входе в колонку, а Ро - давление на выходе из колонки. С учетом сжимаемости исправленный удерживаемый объем будет:

Пользуются также величиной удельного удерживаемого объема:

Эта величина эквивалентна VN при 0 С на 1 г жидкой фазы.

Относительный удерживаемый объем рассчитывают по формуле:

где индекс s относится к некоторому внутреннему стандарту, в качестве которого обычно используют нормальные алканы, а индекс х - к данному компоненту пробы.

Типичная блок-схема газожидкостного хроматографа изображена на рис. 2. Газ-носитель (гелий, азот, аргон) из баллона 1 через редуктор поступает в блок стабилизации газового потока 2, а из него - в аналитический блок 3, состоящий из термостата, колонок и ротаметра. Испытуемое вещество вводится с помощью микрошприца на стеклянную насадку, расположенную в начале колонки и обеспечивающую быстрое испарение вещества и полное смешение его с газом-носителем. Ввод пробы шприцем в колонку осуществляется через прокладку из силиконовой резины. Объем пробы в зависимости от типа детектора, прибора и условий хроматографирования колеблется в пределах от 0,1 до 10 мкл. Определяемые компоненты в смеси с газом-носителем поступают в детектор 4. Электрический сигнал от детектора поступает в усилитель 5. Усиленный сигнал записывается самопишущим потенциометром в виде хроматограммы (рис. 3) с числом пиков, соответствующим числу определяемых компонентов смеси. Количество каждого компонента можно высчитать по площади пика. Температура колонки может меняться по заданной программе с помощью блока программирования 7. Внешний вид современного хроматографа изображен на рис. 3.

Рис. 2 - Типичная блок-схема газожидкостного хроматографа: 1 - баллон с газом-носителем; 2 - блок стабилизации газового потока; 3 - аналитический блок, состоящий из термостата, колонок и ротаметра; 4 - детектор; 5 - усилитель; 6 - самопишущий потенциометр; 7 - блок программированного изменения температуры колонки

хроматографический газожидкостный метод анализ

Газ-носитель. В качестве газа-носителя обычно применяют аргон, гелий, азот, водород, воздух. Выбор газа зависит от типа детектора и некоторых других причин. Чем больше относительная молекулярная масса газа-носителя, тем выше качество разделения компонентов анализируемой смеси (благодаря уменьшению их диффузии). Газы с меньшей молекулярной массой обеспечивают лучшую чувствительность детекторов по теплопроводности.

Наибольшая эффективность хроматографической колонки достигается при постоянной скорости потока газа-носителя. Обычно используются скорости потоков 75-100 мл/мин для колонок с внешним диаметром 6 мм и 25-50 мл/мин для колонок с внешним диаметром 3 мм. Скорость газа-носителя определяется вмонтированными в прибор ротаметрами. Для обеспечения устойчивости газового потока приборы снабжаются стабилизаторами давления. Газы для хроматографии должны быть тщательно осушены, так как вода снижает точность определения. Другие примеси практически не влияют на удерживаемые объемы, но ухудшают стабильность показаний и чувствительность детекторов.

Рис. 3 - Типичная газовая хроматограмма хлороформа: 1 - н-гептан; 2 - метиленхлорид; 3 - 1,1 дихлорэтан; 4 - четыреххлористый углерод; 5 - хлороформ

Колонки. Применяемые в ГЖХ колонки представляют собой U-образные или свернутые в спираль металлические трубки длиной от 1 до 5 м и диаметром 3-6 мм, заполненные твердым сорбентом с нанесенной на него жидкой нелетучей фазой. Твердые носители должны быть химически инертными, иметь большую удельную поверхность (обычно 5-10 м2/г) и обладать механической и термической стойкостью. Для обеспечения максимальной эффективности колонки следует использовать носители с узким диапазоном размеров зерен. Наиболее часто рекомендуются диапазоны размеров зерен в мешках: 60/80, 80/100 или 100/120. С уменьшением размеров зерен увеличивается эффективность разделения, но возрастает сопротивление колонки и соответственно время удерживания.

Большинство носителей изготовляют из диатомитовой земли, представляющей собой разновидность водной миккроаморфной двуокиси кремния, содержащей примеси окислов металлов, и огнеупорного кирпича, свойства которого близки к свойствам диатомитовой земли. Огнеупорный кирпич имеет, как правило, более развитую поверхность и предпочтителен для работы с длинными колонками. Носители, изготовляемые на основе диатомитовой земли и огнеупорного кирпича, - это хромосорб, диатом, целатом, S-80 и др. Ряд носителей изготавливают на основе полимеров (анапорт, флуоропак, хромосорб Т, порапак и др.), а также из стекла и двуокиси кремния. В некоторых случаях адсорбент перед нанесением жидкой фазы промывают спиртовой щелочью или слабой кислотой либо обрабатывают диметилдихлорсиланом для увеличения химической инертности.

Эффективность хроматографического разделения компонентов анализируемой смеси во многом зависит от правильного выбора неподвижной фазы. Неподвижная фаза должна обладать очень низким давлением пара при рабочей температуре, так как в противном случае она будет испаряться в процессе работы колонки. Неподвижная фаза должна быть термически стойкой и оставаться в жидком состоянии во всем интервале температур, при которых работает колонка. Она должна обладать достаточной растворяющей способностью по отношению к определяемым веществам.

В большинстве случаев для приготовления колонок используют от 1 до 30% жидкой фазы от массы носителя. Колонки с содержанием жидкой фазы более 20% применяют в препаративной хроматографии. Более эффективное разделение, как правило, достигается при использовании колонок с низким содержанием жидкой фазы. Для выбора подходящей неподвижной фазы часто приходится применять метод проб и ошибок. Во многих случаях полезным оказывается правило: "подобное растворяется в подобном". В соответствии с этим такие вещества, как углеводороды, хорошо анализируются на неполярных фазах, а полярные соединения на неполярных фазах делятся плохо и выходят из колонки значительно быстрее, чем неполярные, кипящие при той же температуре (табл. 4).

Детекторы. При помощи детектора измеряют состав газа, выходящего из колонки. В настоящее время используют дифференциальные детекторы, которые позволяют измерять концентрацию компонента в данный момент. При выходе чистого газа-носителя такой детектор дает нулевой сигнал. Наибольшее распространение получили катарометр и пламенно-ионизационный детектор (ДИП). Катарометр регистрирует изменение теплопроводности газа-носителя, вызванное появлением анализируемого вещества. При работе пламенно-ионизационного детектора происходит ионизация анализируемых веществ в процессе их сгорания в пламени водорода. Образующиеся ионы рекомбинируют на электродах. Возникающий при этом ток пропорционален концентрации ионов и напряжению на электродах. Катарометр проще по устройству и удобнее в работе, но значительно менее точен, чем ионизационный детектор.

Таблица 1 - Наиболее распространенные неподвижные фазы, применяемые в ГЖХ

Усиленный сигнал детектора записывается на движущейся диаграммной бумаге в виде хроматографических пиков (см. рис. 24). В основе количественного хроматографического анализа лежит измерение площади регистрируемого пика, которая пропорциональна концентрации вещества в пробе. На современных приборах площадь пика определяется с помощью интегратора. При отсутствии интегратора площадь может быть определена как произведение высоты пика на его полуширину (ширина пика на половине его высоты).

Расчет концентрации анализируемого вещества производят различными методами. При использовании метода абсолютной калибровки предварительно строят калибровочные кривые, связывающие площадь хроматографического пика с концентрацией анализируемого вещества. Затем определяют площадь пика для пробы с неизвестной концентрацией и находят концентрацию по калибровочной кривой. Необходимо точно выдерживать постоянство условий анализа, так как площадь пика зависит от скорости газа-носителя, температуры, метода ввода пробы и других факторов. При соблюдении всех правил относительная ошибка определения составляет менее 1%.

Если постоянство условий проведения анализа по каким-либо причинам выдержать невозможно, используют метод внутреннего стандарта. Калибровка производится при добавлении определенных количеств вещества - стандарта к смеси с известной концентрацией анализируемых веществ. На основании полученных данных строят кривую зависимости содержания исследуемого вещества и отношения площадей пиков исследуемого вещества и стандарта.

Советская промышленность выпускает большое число моделей хроматографов. Одними из наиболее совершенных и распространенных приборов являются хроматографы серии "Цвет-100" (Цвет-101, 102, 103, ... 120 ... 150 и т.д.). Каждая из модификаций представляет определенную комбинацию стандартных блоков (блоки детекторов, блок подготовки газов и т.д.).

"Цвет-ПО" является одной из наиболее универсальных моделей хроматографов, предназначенных для количественного и качественного анализа органических и неорганических веществ и определения микропримесей в широком диапазоне температур кипения, а также для анализа агрессивных и неустойчивых соединений на стеклянных колонках. В приборе использована двухколоночная газовая схема с независимой установкой расхода газа-носителя. Колонки набивные U-образные, микронабивные, капиллярные и препаративные. Специальное аналитическое оборудование, поставляемое в комплекте (оборудование для пиролиза), дает возможность анализировать высокомолекулярные вещества, выделять отдельные компоненты для идентификации. Хроматограф снабжен набором детекторов. Максимальная температура колонок 400 С, а испарителя - 450 С. Порог чувствительности ионизационно-пламенного детектора и детектора электронного захвата 1*10в-7, катарометра - 1*10в-3, плотномера - 1*10в-2.

Более новые модели "Цвет-134" и "Цвет-152" могут работать в режиме программирования температуры колонок в диапазоне температур от 50 до 400 С, так как они снабжены не только стеклянными и капиллярными, но и фторопластовыми колонками; порог чувствительности детектора повышен до 1*10в-8.

Высокоэффективная жидкостная хроматография.

В связи с введением в практику фармацевтического производства России GMP. повышается значимость использования современных унифицированных методов анализа, как на предприятиях-производителях:, так и в системе государственного контроля качества лекарственных средств. Базовым методом анализа качества субстанций и готовых лекарственных средств в странах с развитой фармацевтической промышленностью (США, Англия. Япония, страны ЕС) является высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Данный метод по своим характеристикам соответствует требованиям количественного анализа около 80-90% препаратов.

Произошедшие за последние 10 лет изменения в фармацевтической отрасли России, направленные на модернизацию производств, интенсифицировали внедрение ВЭЖХ в контроль качества технологического процесса. Организации-разработчики также начали более активно включать ВЭЖХ метод в соответствующие разделы фармакопейных статей и технологических регламентов. Стали появляться хроматографы в региональных органах контроля качества лекарственных средств. Вместе с тем при общей положительной направленности, процесс в значительной мере сдерживается отсутствием общей упорядоченности.

В первую очередь следует отметить отсутствие соответствующей современным требованиям общей фармакопейной статьи на метод. Скупое изложение основ хроматографии в XI-й Государственной Фармакопее не может методически обеспечить становление в России высокотехнологичного фармацевтического производства и в равной степени тормозит формирование современных аналитических под-разделений государственной службы контроля качества лекарственных средств.

Ранее нами отмечалась нецелесообразность прямого заимствования в рамках внедрения в России GMP и GLP зарубежного опыта в решении этой проблемы [1,2]. Это связано, в первую очередь, с необходимостью больших материальных затрат, как на приобретение оборудования (преимущественно зарубежного), так и на подготовку специалистов.В стране отсутствует единая система подготовки специалистов по ВЭЖХприменительно к фармацевтическому анализу, что привело к появлению в многочисленных ФСП на регистрируемые вновь или перерегистрируемые лекарственные средства, разнообразных методик хроматографического определения отдельных соединений. Данные методики в значительной мере отражают специфику лабораторно-методической базы организации-разработчика, и. учитывая сложность метода, не всегда воспроизводимы контрольно-аналитическими лабораториями на местах. Не оптимально подобранные аналитические условия определения многих соединений часто не позволяют получать удовлетворительные результаты при замене сорбента в колонке на его аналог, при отклонениях в составе экстрагента и элгоента, условий экстракции и элюирования (давление, температура, режим элюирования и т.д.) смене режима детектирования.

Немаловажное значение для точного определения низких концентраций действующих веществ, что характерно для целого ряда современных лекарственных препаратов, либо выявления примесей, особенно на фоне нескольких сопутствующих компонентов с близкими физико-химическими свойствами, имеет точное воспроизведение иногда не описанных Б ФСП особенностей методики. Большое значение в этой ситуации и мест и используемый метод обработки сигнала детектора, применяемые алгоритмы математического анализа хромато грамм.

Безусловно, большинство задач фармацевтического ВЭЖХ анализа с успехом решается при наличии прибора, предназначенного для универсальных аналитических лабораторий и рассчитанного на определение низких концентраций разнообразных по свое природе веществ. Средняя рыночная стоимость такого прибора составляет 60-100 тысяч долларов США, а годовое обслужи-вание расходными материалами обходится в сумму порядка 5000 долларов. Очевидно, только немногие организации могут позволить себе подобное оснащение, особенно с учетом необходимости постоянной работы в отделах контроля качества фармацевтических предприятий или региональных контрольно-аналитических лабораториях сразу нескольких приборов, в силу большой продолжительности традиционно используемых процедур анализа.

Нами предлагалось ранее решение, основанное на применении унифицированного метода, позволяющего в одной и той же хроматографической системе (колонка с обращенной фазой, градиентное элюирование, УФ-детектирование) проводить анализ сотен соединений [1,2]. Идентификация пиков на хроматограмме исследуемого образна осуществляется путем сравнения их времен удерживания и спектральных характеристик в области УФ-спектра с параметрами, заранее полученными для стандартных веществ на откалибро-ванном приборе. Совокупность таких "справочных" параметров представляет собой "базу данных", а хроматограф, позволяющий осуществлять анализ с применением базы данных, можно назвать "ВЭЖХ-аналшатором". Техническими особенностями созданного в России автоматического ВЭЖХ-анализатора "Милихром А-02" является его простота в эксплуатации (базовая подготовка лаборанта-аналитика не более 1 недели), высокая надежность (выдерживает многомесячный круглосуточный режим эксплуатации и пересылку багажом или по почте), короткое время всего анализа (минуты), десятикратно меньший по сравнению со стандартными хроматографами расход элюента и сорбента для колонок, низкая стоимость, возможность любого серийного прибора работать в режиме средства измерения (автокалибровка).

Главным преимуществом предложенного подхода к фармакопейному анализу по сравнению с традиционным является существенное сокращение времени анализа при одновременном снижении затрат на проведение анализа в десятки раз. Так например, анализ субстанции ампициллина по требованиям Европейской фармакопеии занимает 17-18 часов н для его проведения необходимо приготовить 9 вспомогательных растворов. Этот же анализ на хроматограмме "Милихром А-02" занимает всего 30 мин и не требует использования каких-либо вспомогательных калибровочных растворов.

В настоящее время на подобных анализаторах наработана база в несколько сот соединений. Прибор позволяет надежно идентифицировать любое соединение из базы в многокомпонентных (до нескольких десятков веществ) смесях без использования стандартов. Применение подобных анализаторов в единой сети посредством подключения к Интернет (это конструктивно заложено в прибор) позволяет из одного центра управления контролировать состояние каждого прибора, а также "правильность" выполнения конкретного анализа; пополнять из единого источника базу данных, что решает проблему стандартных образцов в лабораториях на местах. На центральном сервере сети может накапливаться и первично автоматически обрабатываться вся информация о каждом выполненном анализе лекарственного препарата либо субстанции, сведения о выданном заключении; появляется возможность автоматического сопоставления результатов анализа различных лабораторий страны лекарственного препарата или фармацевтической субстанции из одной серии и принятия оперативною решения при выявлении отклонений от нормы. Таким образом, создан реальный прообраз единой надежно контролируемой в реальном масштабе времени системы контроля качества лекарственных средств. Ее масштабирование на территории всей страны возможно уже сегодня при наличии соответствующего финансирования.

Несколько лет на базе НИИ фармакологии Томского научного центра Сибирского отделения РАМН по указанию МЗ РФ действует Школа по подготовке специалистов по ВЭЖХ-анализу в фармации. На ней проводятся лекционные и практические занятия, приобретается опыт самостоятельного решения под руководством опытных специалистов сложнейших задач фармацевтического анализа. Школа предназначена как для начинающих сотрудников аналитических лабораторий, так и для химиков-аналитиков со стажем работы. За несколько лет в ней прошли подготовку более 50 специалистов Государственной системы контроля качества лекарственных средств и контрольно-аналитических лабораторий фармацевтических предприятий из 16 регионов страны. Организаторами Школы накоплен богатый опыт подготовки высококвалифицированных кадров, способных решать сложнейшие задачи фармацевтического анализа, в том числе с использованием уникальных отечественных ВЭЖХ-анализаторов "Милихром Л-02". Подготовлен оригинальный методический материал, наработан опыт дистанционного (с помощью Интернет) консультирования последующей работы выпускников Школы. Опыт Школы, при соответствующей поддержке и востребованности, также может быть масштабирован с целью обеспечения лабораторий необходимыми кадрами.

Таким образом, усилиями отечественных специалистов средств, не имеющей мировых аналогов и превосходящей по своим характеристикам наиболее передовые зарубежные системы контроля.

Размещено на Allbest.ru