50

1

НОСИТЕЛИ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ СИНТЕТИЧЕСКИХ ПОЛИПЕПТИДОВ

02.00.06 - Высокомолекулярные соединения

02.00.10 - Биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора химических наук

БУРОВ Сергей Владимирович

Санкт-Петербург 2008

Работа выполнена в Учреждении Российской Академии Наук Институте высокомолекулярных соединений РАН.

Научный консультант: член-корр. РАН, доктор химических наук, профессор Евгений Федорович Панарин

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Лев Иванович Валуев, доктор химических наук, профессор Николай Алексеевич Лавров, доктор химических наук, профессор Александр Григорьевич Шавва

Ведущая организация: ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» федерального медико-биологического агентства России.

Защита состоится « 26 » февраля 2009 г. в 10 часов на заседании

Диссертационного совета Д 002.229.01 при Учреждении Российской академии наук Институте высокомолекулярных соединений РАН по адресу: 199004, Санкт-Петербург, В.О., Большой пр. д. 31, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института высокомолекулярных соединений РАН.

Автореферат разослан «__ » _______2009 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета кандидат физико-математических наук Долотова Н.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Присоединение низкомолекулярных лекарственных веществ к полимерному носителю широко используется для повышения их биологической активности, растворимости, длительности и избирательности действия. Одним из наиболее актуальных направлений исследований является создание новых полимерных носителей противоопухолевых препаратов. Благодаря особенностям строения и физико-химических свойств макромолекул происходит их постепенное накопление в опухолевой ткани, что позволяет многократно повысить локальную концентрацию присоединенного химиотерапевтического агента.

Тем не менее, общим недостатком используемых медико-биологических полимеров остается низкая избирательность действия, связанная с неоднородностью их состава и сложностью контроля процесса иммобилизации лекарственных веществ.

Одним из перспективных подходов является применение для адресной доставки химиотерапевтических препаратов полипептидных носителей, специфически связывающихся с рецепторами, расположенными на поверхности клеток злокачественных опухолей. При этом терапевтическое действие может быть усилено благодаря наличию у носителя собственной противоопухолевой активности.

Используемые в настоящее время методы позволяют получать аналоги природных пептидов, устойчивые к ферментативному расщеплению, которые обеспечивают эффективный перенос лекарственных соединений к пораженным органам и тканям. Тем не менее, в случае противоопухолевых препаратов, роль полипептидного носителя обычно ограничена специфическим взаимодействием с рецептором, в то время как вопросы его собственного влияния на злокачественные клетки и внутриклеточный транспорт цитотоксического агента изучены недостаточно.

Другим перспективным направлением является применение синтетических полипептидов при генной терапии опухолевых заболеваний. Несмотря на низкую эффективность переноса генов, такие носители не имеют выраженных побочных эффектов и могут использоваться при продолжительном лечении. Вместе с тем, основными причинами, ограничивающими их применение, являются недостаточная избирательность действия и неэффективность в экспериментах in vivo.

Поэтому при разработке систем адресной доставки противоопухолевых препаратов особенную актуальность приобретает рациональный выбор структуры полипептидного носителя.

Благодаря наличию на поверхности многих опухолевых клеток специфических рецепторов, отсутствующих в большинстве нормальных тканей, в качестве таких носителей может быть использован ряд природных полипептидов. К числу наиболее перспективных соединений относятся аналоги регуляторного пептида гипоталамуса - люлиберина и фрагментов белков, обеспечивающих межклеточные контакты (RGD-пептидов).

Цель работы. Разработка принципов создания полимерных носителей противоопухолевых препаратов на основе синтетических полипептидов, обладающих собственной цитотоксической активностью.

Для достижения этой цели было необходимо решить следующие задачи:

1) Синтезировать ряд аналогов люлиберина и исследовать особенности их противоопухолевого действия, включая прямое влияние на злокачественные клетки.

2) Разработать методы модификации структуры полипептидного носителя с целью повышения его цитотоксической активности.

3) Синтезировать аналоги люлиберина, обеспечивающие направленный транспорт цитотоксических агентов к опухолевым клеткам, их перенос через клеточную мембрану и доставку в ядро.

4) Исследовать возможности применения фрагментов -цепи фибриногена и их аналогов в составе систем адресной доставки противоопухолевых препаратов.

5) Разработать системы доставки в опухолевые клетки «суицидных» генов, основанные на использовании полипептидных носителей, обладающих цитотоксическим действием.

Положения, выносимые на защиту. Применение синтетических полипептидов, обладающих цитотоксической активностью, в качестве носителей противоопухолевых соединений повышает эффективность воздействия на опухолевые клетки.

Модификация полипептидов остатком пальмитиновой кислоты является перспективным подходом при разработке систем адресной доставки цитотоксических агентов.

Преимуществом противоопухолевых соединений на основе аналогов люлиберина, по сравнению с другими природными полипептидами, является комплексное воздействие на клетки ряда аденокарцином в результате подавления секреции стероидных гормонов, направленной доставки цитотоксического агента и стимуляции иммунной системы.

Носители на основе фрагментов -цепи фибриногена и их аналогов позволяют осуществлять направленный транспорт лекарственных препаратов непосредственно к пораженным органам и тканям.

Эффективность генной терапии опухолевых заболеваний может быть повышена с помощью систем доставки, основанных на использовании пептидов, обладающих противоопухолевой активностью.

Научная новизна. Предложен новый подход к выбору структуры носителей для адресной доставки противоопухолевых препаратов, основанный на использовании синтетических полипептидов, обладающих собственной цитотоксической активностью.

Проведен синтез серии аналогов люлиберина, обладающих комплексным действием на клетки гормонозависимых опухолей в результате подавления секреции стероидных гормонов, направленного транспорта цитотоксического агента, собственной цитотоксической активности и стимуляции иммунной системы.

Показано, что включение остатка пальмитиновой кислоты в структуру полипептидного носителя приводит к повышению его противоопухолевой активности как in vitro, так и in vivo. Впервые установлено непосредственное взаимодействие аналогов люлиберина с регуляторными участками последовательности гена интерлейкина-2, приводящее к усилению синтеза соответствующей мРНК.

На примере 5-фторурацила разработаны новые методы синтеза гибридных соединений, представляющих собой конъюгаты полипептидных носителей с химиотерапевтическими препаратами.

Впервые разработаны методы химического синтеза, позволяющие получать аналоги люлиберина содержащие фрагменты природных белков, которые обеспечивают направленный транспорт в ядро клетки (сигналы ядерной локализации; NLS). Показано, что включение NLS в последовательность пальмитоилсодержащих аналогов способствует значительному повышению их цитотоксической активности in vitro.

При использовании флуоресцентно меченых пептидов, содержащих остаток пальмитиновой кислоты, исследованы особенности их взаимодействия с клеточной мембраной и проникновения в клетки гепатомы человека, содержащие рецепторы люлиберина.

Показана возможность эффективного использования фрагментов -цепи фибриногена и их аналогов в системах адресной доставки противоопухолевых и сосудорасширяющих препаратов.

Разработан новый подход к синтезу полипептидных носителей, обеспечивающих адресный перенос генов в опухолевые клетки. Впервые показано, что в качестве таких носителей могут быть использованы аналоги люлиберина, содержащих NLS или доксорубицин.

Практическая ценность и использование работы. Разработан простой и эффективный метод включения 5-фторурацила в структуру полимерного носителя. На основе аналогов люлиберина синтезированы новые носители цитотоксических агентов, обладающие высокой противоопухолевой активностью в экспериментах in vitro и in vivo. Разработаны методы синтеза полипептидов, способных осуществлять транспорт химиотерапевтических препаратов непосредственно в ядро клетки. В результате исследования взаимосвязи структура - активность получены конъюгаты аналогов люлиберина с цитотоксическими агентами, перспективные для проведения доклинических испытаний. Разработаны системы направленной доставки генов в опухолевые клетки, основанные на применении в качестве носителей аналогов люлиберина, содержащих NLS, и конъюгатов полипептидов с доксорубицином.

Показана возможность применения фрагментов -цепи фибриногена и их аналогов в качестве носителей для адресной доставки противоопухолевых и сосудорасширяющих препаратов.

Личный вклад автора заключается в постановке цели исследования, разработке теоретических и методологических подходов к решению поставленных задач, участии в их экспериментальном выполнении, а также в анализе, интерпретации и обобщении полученных результатов.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на 4-м международном симпозиуме по применению аналогов люлиберина при терапии опухолевых заболеваний и нарушений репродуктивной функции (Женева, 1996 г.), 27-м Европейском пептидном симпозиуме (Сорренто 2002 г.), международной конференции «СПИД, рак и родственные проблемы» (С.-Петербург 2001 г.), Восточно-Азиатском симпозиуме по применению полимеров для передовых технологий (Самара 2005), 29-м Европейском пептидном симпозиуме (Гданьск 2006 г.), 1-м Индийском пептидном симпозиуме (Хайдарабад 2007 г.), III Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Пущино 2007 г.), 30-м Европейском пептидном симпозиуме (Хельсинки 2008 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 53 работы, из них 21 статья в отечественных и зарубежных журналах, 27 тезисов докладов, 2 авторских свидетельства, 2 патента РФ и 1 международный патент.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 217 стр., включает 7 таблиц, 48 рисунков и состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 268 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Направленный транспорт лекарственных соединений в клетки-мишени является одной из основных проблем при разработке новых противоопухолевых препаратов. Применение данного подхода при химиотерапии онкологических заболеваний позволяет повысить избирательность действия, уменьшить терапевтическую дозу и побочные эффекты.

В системах адресной доставки цитотоксических агентов в качестве носителей широко используются различные по структуре полимеры. Одним из перспективных вариантов таких носителей являются аналоги некоторых пептидных гормонов, рецепторы которых расположены на поверхности опухолевых клеток. Применение синтетических полипептидов для направленной доставки противоопухолевых соединений позволяет существенно уменьшить побочные эффекты, связанные с неспецифическим взаимодействием полимеров с клетками нормальных тканей. Кроме того, в этом случае существует возможность дополнительного избирательного воздействия на опухолевые клетки при наличии у пептидного носителя собственной биологической активности.

При терапии ряда гормонозависимых опухолей, относящихся к числу наиболее распространенных онкологических заболеваний, широко используются аналоги регуляторного пептида гипоталамуса - люлиберина. В последние годы рецепторы люлиберина обнаружены в клетках большинства аденокарцином, включая опухоли легкого, кишечника, почек и печени. При этом они отсутствуют или в существенно меньшем количестве присутствуют в нормальных тканях, за исключением гипофиза. Высокое содержание рецепторов на поверхности опухолевых клеток, наряду с особенностями внутриклеточного метаболизма и передачи сигналов обусловливает избирательность действия лекарственных препаратов на основе аналогов люлиберина. При этом воздействие на опухоль может быть комплексным и реализоваться за счет снижения уровня стероидных гормонов и направленного транспорта цитотоксического агента.

Вместе с тем, в традиционно используемом подходе возможности модификации структуры рилизинг-гормона для получения конъюгатов с химиотерапевтическими препаратами весьма ограничены, а вопросам влияния полипептидного носителя на опухолевые клетки и внутриклеточный транспорт цитотоксического агента не уделяется достаточного внимания.

В настоящем исследовании, в результате анализа взаимосвязи структура - активность и особенностей механизма действия, на основе аналогов люлиберина разработаны оригинальные носители противоопухолевых препаратов, обладающие собственной цитотоксической активностью. При этом значительно расширены возможности получения конъюгатов с цитотоксическими агентами, синтезированы соединения, обладающие комплексным влиянием на клетки гормонозависимых опухолей.

Большой интерес представляет также использование носителей на основе фрагментов -цепи фибриногена (RGD-пептидов), обладающих сравнительной простотой структуры наряду с высокой биологической активностью. Такие соединения способны связываться со специфическими рецепторами, расположенными на поверхности опухолевых клеток и эндотелиальных клеток сосудов, питающих опухоль.

Нами исследована возможность применения фрагментов -цепи фибриногена в качестве носителей для направленного транспорта лекарственных веществ при заболеваниях, сопровождающихся локальной активацией тромбоцитов (атеросклерозе, тромбообразовании, формировании метастазов).

В настоящее время большое внимание уделяется разработке методов генной терапии опухолевых заболеваний. Не смотря на то, что носители на основе синтетических полипептидов обеспечивают меньшую эффективность переноса гена, по сравнению с применением вирусных векторов, такие системы обладают определенными преимуществами в плане безопасности, возможности многократного использования и избирательности действия.

В настоящей работе исследованы возможности применения пептидов для доставки в злокачественные клетки так называемых «суицидных» генов. При этом в качестве носителей были использованы различные по структуре полипептиды, в том числе обладающие собственной цитотоксической активностью.

ОСНОВНЫЕ МЕТОДИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ В РАБОТЕ

Синтез пептидов

При получении использованных в работе полипептидов применяли классический и твердофазный методы. В последнем случае синтез проводили как в ручном варианте, так и на полуавтоматическом пептидном синтезаторе NPS-4000 при использовании полимера Меррифильда, 4- (оксиметил)-фенилацетамидометил-полимера (PAM), 4-метил-бензгидриламино-полимера (MBHA) и 4- (гидроксиметил)-феноксиметил-полимера (полимер Ванга). Реакцию конденсации проводили однократно, в основном DIC/HOBt методом. В случае положительного теста на наличие непрореагировавших амино или имино групп (нингидриновый или изатиновый тест; реакция с бромфеноловым синим) конденсацию повторяли. Гидрофобную N-концевую группировку присоединяли карбодиимидным методом при использовании свободной пальмитиновой, лауриновой и триметилуксусной кислоты или соответствующих производных N-концевых аминокислотных остатков.

При получении конъюгатов полипептидов с цитотоксическими агентами применяли п-нитрофениловый эфир 1-карбоксиметил-5-фторурацила и доксорубицин, модифицированный глутаровым ангидридом (N-Fmoc-DOX-14-O-гемиглутарат). В последнем случае синтез проводили по методике, предложенной в работах (Nagy, et.al. 1996).

Полученные пептиды отщепляли от полимера с одновременным деблокированием с помощью 1 M раствора трифторметансульфокислоты в трифторуксусной кислоте в присутствии тиоанизола и этандитиола. При получении этиламидов пептидов отщепление от полимерного носителя проводили под действием безводного этиламина при 0⁰C, с последующим удалением защитных групп в условиях, приведенных выше. Деблокированные пептиды обессоливали путем эксклюзионной хроматографии на сефадексе G-15 и очищали с помощью высокоэффективной обращенно-фазовой хроматографии. Для аналогов, модифицированных пальмитиновой, лауриновой или триметилуксусной кислотой, проводили предварительную очистку методом твердофазной экстракции на колонке LiChroprep RP-18.

При получении производных RGD пептидов методом классического синтеза в растворе реакцию конъюгации с 5-фторурацилом проводили по методике, разработанной для аналогов люлиберина. В случае аналога, содержащего группировку NO, пептид со свободной сульфгидрильной группой обрабатывали нитритом натрия в 30%-ной уксусной кислоте.

Конечные продукты характеризовали данными аминокислотного анализа, высокоэффективной обращенно-фазовой хроматографии и масс-спектрометрии. При необходимости для подтверждения структуры полученных соединений использовали УФ и ЯМР спектроскопию.

Биологические испытания

Исследование противоопухолевой активности аналогов люлиберина проводилось в Институте экспериментальной диагностики и терапии опухолей при Российском онкологическом научном центре РАМН на крысах линии Aci и мышах линии C₃H с перевиваемыми опухолями предстательной и молочной желез, соответственно. Цитотоксическую активность in vitro определяли в Медицинском центре Шеба (Тель-Хашомер, Израиль) на различных линиях клеток аденокарциномы человека (ATCC, США), включая карциному молочной железы (MCF7; MDA MB-231), простаты (DU-145; PC-3; 22RV-1; LNCaP), яичников (OVCAR3), кишечника (SW-48; HT-29; Colo-205) и печени (HepG2) в тесте с окрашиванием жизнеспособных клеток (Hemacolor assay). В качестве контроля использовали нормальные фибробласты F-89. Дополнительные исследования in vitro проводили в Институте цитологии РАН.

Взаимодействие флуоресцентно меченого аналога люлиберина с клетками гепатоцеллюлярной карциномы человека (HepG2) и нормальными фибробластами изучали в Институте цитологии РАН методом лазерной конфокальной микроскопии.

Влияние аналогов на экспрессию гена интерлейкина-2 и синтез матричной РНК исследовали в Институте экспериментальной медицины РАМН при использовании культуры T-лимфоцитов селезенки мыши.

Биологическую активность фрагментов -цепи фибриногена и их аналогов изучали в Институте кардиологии РАМН и Центре прикладной микроциркуляции (Луисвилль, США) в тестах ингибиции агрегации тромбоцитов и подавления тромбообразования. Исследование цитотоксической активности проводили в Институте цитологии РАН.

Сравнительное изучение эффективности переноса гена при использовании комплексов пептид/ДНК проводили в отделе биохимии Института экспериментальной медицины РАМН. Подбор соотношения компонентов комплекса проводили на основании данных гель-электрофореза. Эффективность пептидного носителя оценивали в опытах по доставке генов бактериальной ?-галактозидазы и люциферазы или «суицидного» гена тимидинкиназы вируса простого герпеса в клетки гепатомы человека in vitro.

1. Применение аналогов люлиберина в качестве носителей цитотоксических агентов

Поскольку прямое действие аналогов люлиберина на опухолевые клетки, как правило, малоэффективно, в ряде работ они используются в качестве носителей для направленной доставки цитотоксического агента непосредственно к клеткам-мишеням, что позволяет уменьшить эффективную дозу и побочные эффекты (Schally, et.al. 1999). Преимуществом данного подхода является воздействие не только на гормонозависимые, но и на гормононезависимые опухолевые клетки, что препятствует переходу опухоли в состояние не чувствительное к гормональной терапии.

К числу существенных недостатков носителей лекарственных препаратов на основе синтетических полипептидов относится их быстрое расщепление под действием различного рода ферментов. Так, время полужизни люлиберина в организме составляет порядка 4 мин. При получении более стабильных аналогов, используется модификация N- и C- концевых функциональных групп или включение в структуру пептида неприродных аминокислот.

Введение в положение 6 природной последовательности D-аминокислотных остатков повышает устойчивость аналога к энзиматическому расщеплению и его сродство к соответствующему рецептору (рис. 1). Поэтому такие замены широко используются при синтезе высокоактивных агонистов люлиберина (Monahan, et.al. 1973). Дополнительная модификация положения 2 (удаление остатка гистидина или его замена на D-аминокислоты) приводит к получению эффективных антагонистов (Yardley, et.al. 1975).

В настоящее время наиболее широко применяемым методом получения высокоактивных аналогов люлиберина является проведение множественных модификаций с использованием различных неприродных аминокислот. При этом в структуре пептида содержится не более 3-5 аминокислотных остатков, входящих в природную последовательность (

Применение такой стратегии, помимо значительного увеличения стоимости препаратов, в ряде случаев, приводит к соединениям, обладающим токсичностью или вызывающим развитие аллергических реакций.

В настоящей работе предложен новый подход, основанный на модификации положения 6, в сочетании с отдельными заменами в N-концевой части молекулы. При этом используется минимальное количество простых по структуре неприродных аминокислот, а выбор положения и способа присоединения химиотерапевтического агента проводится таким образом, чтобы это не снижало эффективности действия пептидного носителя.

2. Носители цитотоксических агентов на основе аналогов люлиберина с укороченной аминокислотной последовательностью

По литературным данным укороченные аналоги люлиберина могут сохранять высокое сродство к рецепторам и даже превосходить в этом отношении природный рилизинг-гормон (Haviv, et.al. 1989). Поэтому, такие соединения представляют наибольший интерес с точки зрения простоты получения конъюгатов с химиотерапевтическими агентами. С целью выбора структуры пептидного носителя нами был проведен синтез ряда укороченных аналогов люлиберина и исследовано влияние модификаций в N-концевой части последовательности на гормональную активность.

Учитывая требования стабильности гибридных препаратов в условиях пептидного синтеза и доставки к клеткам-мишеням, в качестве цитотоксического агента использовали 5-фторурацил (5-FU), широко применяемый при терапии опухолевых заболеваний. В ходе предварительных экспериментов с помощью карбамоилхлорида 5-FU был получен трет-бутиловый эфир N- (5-FU-1-ил)-карбонил-N-Z-лизина и соответствующий п-нитрофениловый эфир. Однако такие соединения оказались недостаточно стабильными в условиях, применяемых при синтезе и очистке пептидных препаратов.

Алкильные производные 5-FU обычно менее активны, по сравнению с исходным соединением, но значительно более устойчивы, чем карбамоильные. Поскольку по литературным данным 1-карбоксиметил-5-фторурацил (CMFU) сохраняет значительную противоопухолевую активность, при получении цитотоксических аналогов люлиберина было использовано именно это производное.

Синтез CMFU проводили путем кипячения 5-фторурацила в водном растворе KOH с избытком монохлоруксусной кислоты. При этом наряду с алкилированием положения 1, наблюдается частичная модификация положения 3 и для выделения целевого продукта из смеси образующихся производных используется метод ионообменной хроматографии. Структура полученного соединения, помимо данных масс-спектрометрии подтверждается наличием характерного гипохромного эффекта в области 270 нм, наблюдающегося при увеличении pH раствора.

Для активации карбоксильной группы CMFU был использован метод п-нитрофениловых эфиров, имеющий определенные преимущества при проведении классического синтеза в растворе. Для упрощения очистки активированного эфира при его получении использовали реактив Сакакибары (трифторацетат п-нитрофенола, рис. 2).

Рис. 2. Присоединение 5-фторурацила к полипептидному носителю.

Пептидные носители на основе укороченных аналогов люлиберина и их конъюгаты с CMFU получали методом классического синтеза в растворе. Исходный гексапептид, синтезировали фрагментной конденсацией по схеме (2+1)+3 с помощью комбинации азидного и дифенилфосфорилазидного методов (рис. 3). Применение такого подхода позволяет, наряду с модификацией N-концевой части молекулы, варьировать природу аминокислотных остатков, вводимых в положение 6, что может быть использовано в процессе оптимизации структуры пептидного носителя (рис. 4).

После удаления защитных групп гидрогенолизом и очистки продукта с помощью ионообменной хроматографии на сефадексе SE C-25 чистота гексапептида (II) составляла более 95%. Дальнейшее наращивание пептидной цепи проводили методом активированных эфиров. Полученные аналоги [D-Asp⁶]-GnRH EA очищали методом ионообменной хроматографии на сефадексе SE C-25 или гель-фильтрации на сефадексе LH-20 с последующей обращенно-фазовой ВЭЖХ.

Рис. 3. Схема синтеза укороченных аналогов люлиберина.

H-Ser-Tyr-D-Ala-Leu-Arg-Pro-NHEt (I)

H-Ser-Tyr-D-Asp-Leu-Arg-Pro-NHEt (II)

CMFU-Ser-Tyr-D-Asp-Leu-Arg-Pro-NHEt (III)

H-Pro-Ser-Tyr-D-Ala-Leu-Arg-Pro-NHEt (IV)

H-Pro-Ser-Tyr-D-Asp-Leu-Arg-Pro-NHEt (V)

CMFU-Pro-Ser-Tyr-D-Asp-Leu-Arg-Pro-NHEt (VI)

H-D-Pro-Ser-Tyr-D-Ala-Leu-Arg-Pro-NHEt (VII)

Ns-Pro-Ser-Tyr-D-Asp-Leu-Arg-Pro-NHEt (VIII)

pGlu-Ser-Tyr-D-Ala-Leu-Arg-Pro-NHEt (IX)

BOC-Phe-Ser-Tyr-D-Ala-Leu-Arg-Pro-NHEt (X)

H-Pro-Gly-Ser-Tyr-D-Ala-Leu-Arg-Pro-NHEt (XI)

CMFU - 1-карбоксиметил-5-фторурацил; Ns - -Нафталинсульфонил

Рис. 4. Аналоги люлиберина с укороченной аминокислотной последовательностью.

В ходе синтеза цитотоксических аналогов люлиберина было показано, что п-нитрофениловый эфир CMFU обладает аномально высокой реакционной способностью. Так, при получении пептида (III) реакция ацилирования проходила за 0.5 ч, по сравнению с 48 ч в случае использования пентахлорфенилового эфира пролина (аналог (V)).

Исследование стабильности синтезированных аналогов в плазме крови человека, проведенное методом ВЭЖХ, показало, что пептиды, содержащие 5-фторурацил, в отличие от немодифицированных соединений, устойчивы в течение 24 ч инкубации. В месте с тем, при проведении испытаний in vivo на моделях карциномы простаты и опухоли молочной железы, укороченные аналоги вызывали не более чем 40-50%-ное торможение роста опухоли, причем присоединение 5-фторурацила приводило к снижению активности.

Таким образом, применение аналогов люлиберина с укороченной аминокислотной последовательностью в системах направленной доставки противоопухолевых препаратов представляется нецелесообразным из-за существенного влияния цитотоксического агента на гормональную активность пептидного носителя и его взаимодействие с соответствующим рецептором.

3. Получение конъюгатов цитотоксических агентов и аналогов люлиберина с полной аминокислотной последовательностью

Одним из вариантов решения проблемы является применение аналогов люлиберина с полной аминокислотной последовательностью, что позволяет уменьшить влияние цитотоксической группировки на биологическую активность гибридных соединений и их способность к связыванию с рецепторами клеток-мишеней. При этом необходимо исследовать зависимость противоопухолевой активности от структуры пептидного носителя и способа присоединения химиотерапевтического агента.

С целью упрощения синтеза гибридных препаратов, в положение 2 природной последовательности вводили D-фенилаланин, что приводит к соединениям, обладающим высокой антагонистической активностью (Coy, et.al. 1976). Применение антагонистов люлиберина позволяет широко варьировать как структуру N-концевой части молекулы, так и способ присоединения цитотоксической группировки.

Синтез аналогов проводили твердофазным методом при использовании MBHA полимера и BOC/Bzl стратегии. Ацетилирование N-концевого остатка пролина проводили на полимерном носителе под действием уксусного ангидрида. Для введения пальмитоильной группировки использовали пальмитоил-пролин, который присоединяли методом симметричных ангидридов. Остаток CMFU присоединяли в растворе, методом активированных эфиров, после отщепления пептидов от полимерного носителя. Структура полученных аналогов представлена на рис. 5.

H-Pro-D-Phe-Pro-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ (XII)

Ac-Pro-D-Phe-Pro-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ (XIII)

Pam-Pro-D-Phe-Pro-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ (XIV)

Ac-Pro-D-Phe-Pro-Ser-Tyr-D-Lys (CMFU)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ (XV)

CMFU-Pro-D-Phe-Pro-Ser-Tyr-D-Lys (CMFU)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ (XVI)

Pam-Pro-D-Phe-Pro-Ser-Tyr-D-Lys (CMFU)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ (XVII)

Рис. 5. Структура аналогов люлиберина с полной аминокислотной последовательностью.

Данные биологических испытаний показывают, что присоединение 5-FU позволяет повысить эффективность действия in vivo (пептид (XVII), рис. 6), причем N-концевая группировка оказывает существенное влияние на противоопухолевую активность аналогов (соединения (XV), (XVI) и (XVII)). При этом пептиды (XVI) и (XVII) эффективны в дозе 10 мкг/кг веса, по сравнению со 100 мкг/кг для широко используемого препарата “Buserelin”.



Рис. 6. Противоопухолевая активность аналогов люлиберина на модели карциномы простаты in vivo. 29-й день после начала лечения, доза 100 мкг/кг. *- 10 мкг/кг. B - “Buserelin”.

Исследование цитотоксической активности in vitro свидетельствует об отсутствии прямого влияния пептида (XII) на клетки карциномы яичников человека CaOv, в отличие от аналогов (XIV) и (XVII). Необычно высокая активность пептида (XII) in vivo в дозе 100 мкг/кг, наряду с неэффективностью in vitro наводит на мысль о возможном дополнительном механизме подавления опухолевого роста. На основании литературных данных относительно наличия рецепторов люлиберина на поверхности T-лимфоцитов (Jacobson, et.al. 1998) можно предположить, что некоторые аналоги обладают иммуностимулирующим действием.

Проведенное нами исследование влияния соединений (XII) и (VIII) на иммунную функцию Т-лимфоцитов селезенки мыши показало, что оба пептида обладают стимулирующим действием, усиливая синтез мРНК интерлейкина-2. При этом декапептид (XII) обладал большей эффективностью и продолжительностью действия, что согласуется с его высокой противоопухолевой активностью. Дальнейшие эксперименты с использованием гомологичной и гетерологичной ДНК показали наличие специфического связывания аналога (VIII) с регуляторными участками последовательности гена интерлейкина-2.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что применение аналогов люлиберина с полной аминокислотной последовательностью является перспективным направлением при разработке пептидных носителей цитотоксических агентов. В результате проведенных исследований синтезированы пептиды, обладающие комплексным влиянием на рост опухолевых клеток in vivo за счет проявления гормонального, цитотоксического и иммуностимулирующего действия. При этом показано, что модификация N-концевой части последовательности и, в частности, введение пальмитоильной группировки, позволяет существенно повысить противоопухолевую активность гибридных препаратов.

4. Синтез полипептидных носителей, обладающих собственной цитотоксической активностью

Применение аналогов люлиберина при терапии опухолевых заболеваний основано либо на проявлении гормонального действия (снижение уровня стероидных гормонов), либо на возможности их использования для направленного транспорта химиотерапевтических препаратов к клеткам-мишеням. Вместе с тем, имеются данные относительно прямого влияния аналогов люлиберина на опухолевые клетки, связанного с их способностью индуцировать апоптоз. Недостаточная эффективность такого действия делает актуальной разработку методов модификации аминокислотной последовательности для синтеза пептидных носителей, обладающих собственной цитотоксической активностью.

Piv-Pro-D-Phe-Pro-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ (XVIII)

Lau-Pro-D-Phe-Pro-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ (XIX)

H-Pro-D-Nal-Pro-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ (XX)

Pam-Pro-D-Nal-Pro-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ (XXI)

H-Pro-D-Phe-Pro-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-NHEt (XXII)

Pam-Pro-D-Phe-Pro-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-NHEt (XXIII)

H-Pro-Gly-D-Phe-Pro-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ (XXIV)

H-Gly-Pro-D-Phe-Pro-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ (XXV)

Pam-Pro-Gly-D-Phe-Pro-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ (XXVI)

Lau-Pro-Gly-D-Phe-Pro-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ (XXVII)

Hex-Pro-Gly-D-Phe-Pro-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ (XXVIII)

Pam-Gly-Pro-D-Phe-Pro-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ (XXIX)

Pam-Pro-Gly-Pro-D-Phe-Pro-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ (XXX)

Pam-D-Pro-Gly-Pro-D-Phe-Pro-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ (XXXI)

Pam-Lys-Pro-Gly-D-Phe-Pro-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ (XXXII)

Pam-Lys-Gly-D-Phe-Pro-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ (XXXIII)

Pam-D-Lys-Pro-Gly-D-Phe-Pro-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ (XXXIV)

Pam-D-Lys-Gly-D-Phe-Pro-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ (XXXV)

Pam-D-Pro-Gly-D-Phe-Pro-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ (XXXVI)

Pam-Pro-Pro-Pro-D-Phe-Pro-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ (XXXVII)

Pam-D-Pro-Pro-Pro-D-Phe-Pro-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ (XXXVIII)

Pam-Pro-Gly-D-Leu-Pro-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ (XXXIX)

Pam-Pro-Gly-D-Phe-Ala-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ (XL)

Pam-Pro-Ala-D-Phe-Pro-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ (XLI)

Рис. 7. Аналоги люлиберина, модифицированные в N-концевой части последовательности.

Полученные на первом этапе исследования данные о высокой противоопухолевой активности пептида (XII) на модели карциномы простаты in vivo в сочетании с неэффективностью in vitro свидетельствуют об отсутствии прямого цитотоксического действия. В то же время пептид (XIV), модифицированный остатком пальмитиновой кислоты, оказался эффективным при подавлении роста клеток карциномы яичников in vitro и на ранней стадии карциномы простаты in vivo. Поэтому на следующем этапе работы основное внимание уделялось изучению влияния структуры N-концевой части молекулы на цитотоксическую активность пептидного носителя. С этой целью была получена серия аналогов (XVIII) - (XLI) (рис. 7).

Синтез пептидов проводили твердофазным методом на полуавтоматическом синтезаторе NPS-4000 с использованием Boc/Bzl-стратегии. Аналоги (XVIII)- (XXI) и (XXIV)- (XLI) синтезировали на 4-метилбензгидриламино-полимере, соединения (XXII) и (XXIII) на полимере Меррифильда. Гидрофобную N-концевую группировку присоединяли карбодиимидным методом при использовании свободной пальмитиновой, лауриновой, капроновой и триметилуксусной кислоты или соответствующих производных N-концевых аминокислотных остатков.

При определении цитотоксической активности пептидов использовали различные линии клеток аденокарциномы человека, которые по литературным данным содержат рецепторы люлиберина (Nechushtan, et.al. 1997). При этом исследовалось влияние структуры N-концевой группировки и длины пептидной цепи на эффективность действия аналогов. Результаты, полученные в экспериментах на клетках линии Colo-205, оказавшихся наиболее чувствительными к действию пептидов, представлены в табл. 1.

В литературе имеются данные, свидетельствующие об избирательном цитотоксическом действии пальмитиновой кислоты на опухолевые клетки (Harada, et.al. 2002). Поэтому представлялось целесообразным использовать N-концевую пальмитоильную группировку для повышения противоопухолевой активности пептидных носителей и их способности проникать через гемато-энцефалический барьер, что особенно важно при терапии опухолей мозга.

Сопоставление данных биологических испытаний пептидов (XVIII), (XIX), (XXVII) и (XXVIII), а также аналогов (XII), (XIV), (XX), (XXI), (XXII), (XXIII) и (XXIV)- (XXVI) свидетельствует о важности остатка пальмитиновой кислоты для проявления цитотоксического действия. Так, использование в качестве N-концевой группировки лауриновой, капроновой (пептиды (XIX), (XXVII), (XXVIII)) или пивалиновой кислоты (пептид (XVIII)) приводит к резкому снижению активности. При этом ни один из исследованных аналогов, за исключением пальмитоильных производных, не обладал выраженным цитотоксическим действием.

Таблица 1. Цитотоксическая активность аналогов люлиберина на клетках карциномы кишечника человека Colo-205.

Пептид	Доза	Цитотоксическое действие*
GnRH	> 10-4 M	-
(XVIII)	> 10-4 M	-
(XIX)	> 10-4 M	-
(XX)	> 10-4 M	-
(XXI)	5x10-5 M	+
(XXII)	> 10-4 M	-
(XXIII)	5x10-5 M	++++
(XXIV)	> 10-4 M	-
(XXV)	> 10-4 M	-
(XXVI)	2x10-5 M	++++
(XXVII)	> 10-4 M	-
(XXVIII)	> 10-4 M	-
(XXIX)	10-4 M	+++
(XXX)	5x10-5 M	++
(XXXI)	5x10-5 M	++
(XXXII)	5x10-5 M	++
(XXXIII)	5x10-5 M	+++
(XXXIV)	3.5x10-5 M	++++
(XXXV)	5x10-5 M	++++
(XXXVI)	5x10-5 M	++
(XXXVII)	5x10-5 M	++
(XXXVIII)	5x10-5 M	++
(XXXIX)	5x10-5 M	++
(XL)	3.5x10-5 M	++++
(XLI)	5x10-5 M	++

^* Число знаков «+» пропорционально уменьшению количества жизнеспособных опухолевых клеток (оценивалось по изменению оптического поглощения элюата при 650 нм).

Замена D-фенилаланина на D-лейцин (пептид (XXXIX)) приводит к заметному снижению активности, что согласуется с литературными данными о высокой эффективности антагонистов люлиберина, содержащих ароматические D-аминокислоты в положении 2. Увеличение длины пептидной цепи до 11 аминокислотных остатков (аналоги (XXVI) и (XXIX)) или ее укорочение (аналог (XXII)) приводит к высокоактивным соединениям. При этом следует отметить, что в литературе описано лишь несколько активных аналогов люлиберина, содержащих более 10 аминокислотных остатков (Wasiak, et.al. 1979).

Существенное различие в активности пептидов (XXIX) и (XXVI) указывает на важную роль аминокислотной последовательности в N-концевой части молекулы. Данные биологических экспериментов свидетельствуют о существенном влиянии природы и количества аминокислотных остатков, расположенных между пальмитоильной группировкой и положением 1 в структуре рилизинг-гормона, на эффективность цитотоксического действия аналогов (XXX)- (XXXVIII) in vitro. Так, включение фрагментов Pro-Gly или D-Pro-Gly (пептиды (XXX) и (XXXI)) в последовательность аналога (XIV) приводит к снижению активности. Аналогичный эффект наблюдается и в случае присоединения остатка лизина к N-концевому пролину пептида (XXVI). В то же время укорочение аминокислотной последовательности на один остаток и/или использование D-лизина (аналоги (XXXIII)- (XXXV)) позволяет получить высокоактивные соединения.

Включение в структуру аналогов второго остатка лизина увеличивает возможности присоединения цитотоксической группировки. При этом наличие в боковой цепи дополнительной -аминогруппы позволяет проводить синтез конъюгатов с противоопухолевыми агентами, не затрагивая «активного центра» рилизинг-гормона.

Значительное влияние точечных модификаций не изменяющих существенным образом физико-химические свойства аналогов, на их цитотоксическую активность (замена остатков пролина и глицина на аланин в пептидах (XL) и (XLI) соответственно), свидетельствует в пользу специфичности действия и возможного участия в этом процессе рецепторов люлиберина. Дополнительным подтверждением такой гипотезы является отсутствие цитотоксического действия аналогов в дозах, гибельных для опухолевых клеток, на используемые в качестве контроля нормальные фибробласты человека, не содержащие соответствующих рецепторов.

Таким образом, в результате проведенных исследований получены аналоги люлиберина, обладающие высокой цитотоксической активностью по отношению к различным клеточным линиям аденокарциномы человека. Эти данные свидетельствуют о перспективности введения остатка пальмитиновой кислоты с целью создания противоопухолевых препаратов с повышенной эффективностью действия. При этом представляет интерес как дальнейшее изучение противоопухолевой активности синтезированных аналогов in vivo, так и их применение в качестве носителей цитотоксических агентов.

5. Синтез полипептидных носителей, содержащих сигнал ядерной локализации

Изучение особенностей проникновения в злокачественные клетки пептидного носителя и присоединенного к нему цитотоксического агента является необходимым этапом разработки гибридных противоопухолевых препаратов. Для анализа взаимодействия пептидов с рецепторами, расположенными на поверхности опухолевых клеток и последующего внутриклеточного распределения гибридных препаратов нами был использован флуоресцентно меченый аналог (XXVI)-F.

Флуоресцентную метку вводили в положение 6 природной последовательности с помощью изотиоцианата флуоресцеина, в водном растворе пептида (XXVI) по стандартной методике. Такой способ конъюгации не влияет на способность аналога связываться с рецептором и позволяет получить достаточно стабильное производное.

Исследование влияние пептида (XXVI) и суперактивного агониста люлиберина «аларелина» на взаимодействие аналога (XXVI)-F с клетками HepG2 которые по литературным данным содержат рецепторы люлиберина, показывает наличие дозо-зависимого подавления связывания (рис. 8). При этом действие «аларелина» проявляется в большей степени, что согласуется с его высокой агонистической активностью и свидетельствует в пользу проникновения аналога (XXVI)-F внутрь клетки в результате взаимодействия со специфическими рецепторами. Дополнительным подтверждением этого служит отсутствие меченого пептида в цитоплазме нормальных фибробластов человека, использованных в качестве контроля.

Рис. 8. Влияние аналога (XXVI) и “аларелина” на связывание меченого пептида (XXVI)-F с клетками гепатоцеллюлярной карциномы HepG2.

Применение метода лазерной конфокальной микроскопии указывает на наличие первоначального связывания аналога (XXVI)-F с клеточной мембраной. При этом проникновение меченого пептида в клетки наблюдаются уже через 10 минут инкубации, а через 2 часа он обнаруживается в ядре. Существенным моментом является отсутствие признаков повреждения мембраны, что дополнительно подтверждает предположение о том, что цитотоксическая активность пептидных носителей связана со способностью входящей в их состав пальмитиновой кислоты индуцировать апоптоз.

В настоящее время аналоги люлиберина широко используются при получении гибридных соединений на основе доксорубицина и его производных, цитотоксическое действие которых, в первую очередь, связано с нарушением функций ДНК. Поэтому одним из возможных вариантов повышения эффективности таких химиотерапевтических агентов является их направленный транспорт к внутриклеточным мишеням. В данном случае при выборе структуры носителя могут быть использованы те же принципы, которые используются при разработке пептидных систем доставки генов. При этом проникновение гибридного препарата внутрь опухолевой клетки происходит наиболее эффективным путем - в результате взаимодействия со специфическим рецептором. Далее пептидный носитель может способствовать выходу препарата из образующихся эндосом, доставке цитотоксического агента в ядро и последующему взаимодействию с ДНК.

Следует отметить, что получение носителей, обладающих всеми вышеперечисленными свойствами, является достаточно сложной задачей, особенно в случае аналогов люлиберина, где возможности необходимого изменения исходной структуры весьма ограничены. Поэтому было необходимо разработать новые методы модификации аминокислотной последовательности рилизинг-гормона путем включения в ее состав сигнала ядерной локализации (NLS).

Анализ литературных данных, проведенный с целью выбора достаточно короткой и эффективной структуры, показывает, что в наиболее полной мере этим требованиям отвечает последовательность Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val, входящая в состав ядерного T антигена вируса SV40. Поскольку принципиальные возможности включения сигнала ядерной локализации в структуру аналогов люлиберина сводятся к модификации положений 1 и 6, в качестве исходного соединения при проведении дальнейших исследований был выбран пептид (XXXIV). Наличие в аминокислотной последовательности аналога второго остатка D-лизина позволяет расширить возможности синтеза за счет использования дополнительной е-аминогруппы. При этом для сохранения функциональной активности сигнала ядерной локализации N-концевую иминогруппу пролина оставляли незащищенной. Структура полученных аналогов представлена на рис. 9.

Синтез пептидов проводили с использованием комбинации BOC/Bzl и Fmoc/Bu^t стратегии, остаток пальмитиновой кислоты присоединяли карбодиимидным методом. В случае аналога (XLIV) применяли ди-пальмитоил-лизин при проведении реакции конденсации в смеси фенол-хлороформ 1:3. Следует отметить, что получение пептида (XLIV) представляет наибольшую сложность, как вследствие высокой гидрофобности конечного продукта, так и его склонности к образованию комплекса с ди-пальмитоил-лизином, стабильного в условиях деблокирования и очистки с помощью ВЭЖХ. Для разрушения комплекса и получения конечного продукта перед отщеплением пептида от полимерного носителя проводили дополнительную обработку трифторуксусной кислотой.

Результаты биологических испытаний на клетках линии Colo-205 (рис. 10) показывают, что включение в структуру пептидного носителя сигнала ядерной локализации приводит к существенному увеличению цитотоксической активности in vitro (пептиды (XXVI) и (XLIII); (XXXIV) и (XLII)).

H-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val

Pam-D-Lys-Pro-Gly-D-Phe-Pro-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ (XLII)

H-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val

Pam-Pro-Gly-D-Phe-Pro-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ (XLIII)

H-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val

Pam-D-Lys(Pam)-Pro-Gly-D-Phe-Pro-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ (XLIV)

Рис. 9. Структура аналогов люлиберина, содержащих сигнал ядерной локализации.