Молекулярные аспекты функционирования рибосомных РНК

Молекулярные аспекты функционирования рибосомных РНК

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Рибосома это молекулярное устройство, осуществляющее синтез белков из аминокислот, приносимых транспортной РНК, согласно инструкциям, закодированным в последовательности нуклеотидов матричной РНК. Рибосома состоит из большой и малой субчастиц и имеет три участка связывания тРНК - А, Р и Е. В ходе своей работы она взаимодействует с несколькими десятками различных лигандов и координирует работу своих функциональных центров, разнесенных в пространстве. Основную структурную и функциональную роль в рибосоме выполняет рибосомная РНК. Основу 30S субчастицы составляет 16S рРНК, основу 50S субчастицы - 23S и 5S рРНК. Малая субчастица образует декодирующий центр, в котором происходит проверка соответствия кодона мРНК и антикодона аминоацил-тРНК. Связывание аа-тРНК осуществляется при помощи комплекса фактора элонгации Tu и GTP. После гидролиза GTP, который происходит в случае соответствия кодона мРНК и антикодона тРНК, аа-тРНК перемещается в А участок. При этом 3' - конец аа-тРНК, несущей аминокислоту проникает в пептидилтрансферазный центр большой субчастицы рибосомы. В этом каталитическом центре происходит перенос синтезируемого рибосомой пептида с 3' - конца тРНК, связанной с Р участком рибосомы, на аминокислоту, связанную с тРНК, находящейся в А участке. После переноса пептида возникает необходимость переместить молекулы тРНК из А и Р участков в Р и Е участки, чтобы освободить А участок для связывания следующей аа-тРНК. Вместе с тем, необходимо переместить мРНК на три нуклеотида, чтобы можно было считать следующий кодон. Согласно гипотезе, сформулированной Спириным и Бретшером, а затем подтвержденной Моазедом и Ноллером, перемещение тРНК происходит сначала на большой субчастице, а затем на малой. Транслокация катализируется фактором элонгации G в комплексе с GTP, который в ходе транслокации гидролизуется.

В начале 21 века изучение рибосомы вышло на качественно новый уровень. С помощью рентгеноструктурного анализа были определены с высоким разрешением структуры рибосомных субчастиц, а затем и всей рибосомы. Появилась возможность формулировать вопросы и предположения о назначении тех или иных «деталей» рибосомы и подвергать их экспериментальной поверке. Методы изучения структуры рибосомы - рентгеноструктурный анализ и криоэлектронная микроскопия помогли выявить несколько изменений структуры рибосомы в ходе биосинтеза белка. Однако, функциональная роль этих изменений не может быть установлена исключительно с помощью определения строения рибосом. Направленное изменение тех или иных элементов пространственной структуры с помощью мутаций и анализ мутантных рибосом позволяет понять роль этих элементов в процессе трансляции. В настоящее время изучение взаимосвязи структуры и функции рибосомы - это чрезвычайно динамично развивающаяся область биоорганической химии и молекулярной биологии. Более того, без понимания механизмов работы таких молекулярных устройств, как рибосома, невозможно представить себе дальнейший прогресс в создании искусственных молекулярных машин нанометровых размеров.

Цель работы. Понять роль ряда элементов рибосомной РНК в функционировании рибосомы.

Задачи:

1. Найти неизвестные ранее гены ферментов, проводящих модификацию рРНК, и определить роль модификаций рРНК в клетке.

2. Определить функциональную роль элементов 16S рРНК, участвующих в формировании структуры декодирующего центра.

3. Установить функциональную роль формы желоба 50S субчастицы, по которому аа-тРНК поступает в А участок.

4. Выяснить функциональную роль Е и РЕ участка и участка связывания факторов элонгации. Определить, как происходит выбор между связыванием EF-G и EF-Tu при их конкуренции за общий участок связывания с рибосомой.

Научная новизна и практическая значимость. Все результаты работы получены впервые и не описаны ранее в научной литературе. В ходе выполнения работы впервые определены гены рРНК метилтрансфераз, модифицирующих основания G966 16S рРНК, A1618, G1835 и G2445 23S рРНК E. coli. Показано, что субстратом для метилтрансферазы YhhF, метилирующей NH₂ группу нуклеотида G966 16S рРНК, служит 30S субчастица. На основе пространственных структур 30S субчастицы и белка YhhF построена модель их комплекса. Предположено, что метилтрансфераза связывается с малой субчастицей в том месте, где в ходе функционального цикла рибосомы расположена антикодоновая петля тРНК, находящейся в Р участке. Субстратом метилтрансфераз YgjO и YcbY, модифицирующих нуклеотиды G1835 и G2445 23S рРНК, служит, как было показано, депротеинизированная рРНК. Метилированные нуклеотиды m²G1835 и m²G2445 23S рРНК расположены в области контакта субчастиц и в пептидилтрансферазном центре. Метилтрансфераза YbiN проводит монометилирование нуклеотида А1618 23S рРНК. Субстратом для нее служит промежуточный комплекс сборки 50S субчастицы, сходный с рибонуклеопротеидом, образующимся при частичной депротеинизации 50S субчастицы. Хотя отсутствие любой из обнаруженных в работе метилтрансфераз приводит к замедлению роста клеток, оно не нарушает работу рибосомы in vivo.

В работе разработана методология изучения функции рибосомной РНК с помощью мутагенеза. Впервые в мире разработан метод выделения рибосом, несущих аптамер в рРНК, с помощью аффинной хроматографии. В результате стало возможным выделять и изучать рибосомы, несущие летальные мутации. Собраны в одну систему методы изучения структуры рРНК и способы определения эффективности отдельных стадий трансляции.

Впервые получены мутации нуклеотидов 16S рРНК, участвующих в третичных взаимодействиях спирали 34 16S рРНК. Обнаружено, что мутации влияют на точность трансляции и предложено объяснение этого эффекта. Впервые доказано экспериментально, что нуклеотидные остатки U2492, C2556 и C2573 23S рРНК, образующие сужение на пути перемещения аа-тРНК в А участок не важны для скорости этого перемещения.

Детально изучен механизм аллостерической связи между РЕ участок способствует связыванию EF-G и многократному не сопряженному с транслокацией гидролизу GTP. С помощью мутаций проверена возможность передачи аллостерического сигнала через спирали 38, 39, 89, 91, 95 и 42 23S рРНК. Показано, что спираль 38 и петли спиралей 89 и 91 не участвуют в передаче сигнала. Мутации в спирали 39 способствовали стабилизации такой конформации 23S рРНК в составе рибосомы, при которой защищены от химической модификации нуклеотиды 23S рРНК, взаимодействующие с тРНК, связанной с Р участком. С помощью мутации в спирали 95 23S рРНК было обнаружено, что гидролиз GTP не требует прочного взаимодействия EF-G с SRL. В тоже время, это взаимодействие необходимо для транслокации. Полученные результаты свидетельствуют в пользу того, что гидролиз GTP элонгационным фактором G предшествует транслокации. Движение спиралей 43-44 23S рРНК, наблюдаемое при связывании с рибосомой факторов элонгации, было вызвано нами искусственно, вне зависимости от присутствия лигандов рибосомы, с помощью мутации в спирали 42 23S рРНК. Впервые показано, что движение GAC в сторону SRL не мешает связыванию аа-тРНК*EF-Tu*GTP с рибосомой и декодированию, но препятствует связыванию EF-G*GTP и транслокации. С помощью химической модификации выявлена сеть третичных взаимодействий, связывающая пептидилтрансферазный центр с центром связывания факторов элонгации. Предложена модель селективного связывания факторов элонгации с рибосомой в зависимости от того, какое положение занимает в ней GAC.

Результаты работы опубликованы в виде 10 статей в отечественных и 23 статей в зарубежных научных журналах, а также глав в 3 книгах и 2 методических разработках.

Уникальные методы, разработанные в работе, такие, как метод детекции протонированных оснований в рРНК и метод аффинной хроматографии рибосом могут быть использованы в институтах, занимающихся исследованиями в области биоорганической химии и молекулярной биологии как в нашей стране, так и за рубежом. Разработанная нами система выделения рибосом с помощью аффинной хроматографии уже была успешно использована в Университете Брауна, США. Результаты, полученные в ходе выполнения работы, отвечают на многие вопросы о механизме функционирования сложных молекулярных машин и имеют фундаментальную научную ценность. Кроме того, выявленные в работе участки рРНК, необходимые для функционирования рибосомы, могут быть использованы как мишени для разработки новых видов антибиотиков.

Работа была поддержана грантами: РФФИ, HHMI, Fogarty, CRDF.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на нескольких десятках международных конференций, в том числе на ключевых международных конференциях по функции РНК и трансляции:

- The Ribosome: Structure, Function, Antibiotics, and Cellular Interactions, June 13-17, 1999, Helsingor, Denmark

- RNA2001, 6^th Annual meeting of the RNA society, May 29 - June 3, 2001, Banff, Canada

- Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, The Ribosome, May 31 - June 5, 2001, Cold Spring Harbor, USA

- The 5th International Engelhardt Conference on Molecular Biology, 21-26 июнь, 2001, Москва-Ярославль-Москва, Россия

- International conference in honour of Alexander Spirin, Protein synthesis, 27 августа - 1 сентября, 2001, Пущино, Россия

- The Dynamics of Ribosome Structure and Function, January 27 - February 1, 2002, Queenstown, New Zealand

- RNA2003, 8^th Annual meeting of the RNA society, July 1-6, 2003, Vienna, Austria

- RNA2006, 11^th Annual meeting of the RNA society, June 20-25, 2006, Seattle, USA

- The 8th International Engelhardt Conference on Molecular Biology «RNA - Protein Interactions», 19-24 августа, 2006, Московская обл., Россия

- Ribosomes: Form and Function, June 3-8, 2007, North. Falmouth, USA

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 286 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты и их обсуждение, материалы и методы, выводы. Материал иллюстрирован 85 рисунками и 10 таблицами. Библиографический указатель включает 405 цитированных работ.

Содержание работы

В настоящее время определена структура комплексов рибосомы, находящейся на различных этапах ее функционального цикла, однако функциональная роль конформационных изменений рРНК в этих комплексах не очевидна. Целью работы было изучение функциональной роли потенциально важных элементов рРНК и их наблюдаемых или предполагаемых конформационных изменений в ходе работы рибосомы. Стратегия, выбранная нами для изучения рибосомы это сочетание направленного мутагенеза компонентов рибосомы и анализа функциональных последствий внесенных мутаций.

Поиск генов рРНК-метилтрансфераз, ответственных за метилирование нуклеотидов G966 16S рРНК, A1618, G1835 и G2445 23S рРНК

Рибосомные РНК E. coli содержат 36 модифицированных нуклеотидов. Модификацию этих остатков проводят 32 фермента, из которых 10 до сих пор неизвестны. Распределение модифицированных нуклеотидов в пространственной структуре рибосомы крайне неравномерно. Большинство из них находятся в функциональных центрах рибосомы - декодирующем, пептидилтрансферазном и в местах контакта субчастиц. Отдельная группа модифицированных оснований сближена с туннелем, проходящим через большую субчастицу. Распределение модифицированных нуклеотидов в пространственной структуре рибосомы еще более неравномерно относительно участков связывания лигандов. Большинство модифицированных нуклеотидов сближены с тРНК, находящимися в А и Р участках. Особенно богато минорными остатками окружение Р участка. Понять функциональную роль модификаций рРНК можно, только получив клетки и рибосомы, в которых та или иная модификация не происходит. Для этого необходимо определить гены, ответственные за модификацию нуклеотидов и инактивировать их.

В нуклеотидной последовательности генома E. coli нами был произведен поиск открытых рамок считывания, кодирующих белки, гомологичные известным РНК метилтрансферазам. Штаммы, в которых соответствующие участки ДНК были заменены на ген устойчивости к канамицину, были любезно предоставлены нам проф. Х. Мори. Из штаммов, в которых предполагаемые рРНК-метилтрансферазы были инактивированы, была выделена суммарная клеточная РНК, большинство из которой составляла рРНК. Для того, чтобы понять, привела ли инактивация генов к отсутствию той или иной модификации, мы использовали метод обратной транскрипции.

Нуклеотид m²G966 16S рРНК напрямую взаимодействует с нуклеотидом 34 антикодоновой петли тРНК. Метилтрансфераза, проводящая модификацию этого нуклеотида была неизвестна. Обратная транскрипция рРНК, выделенной из клеток дикого типа, останавливалась за один нуклеотид до m²G966. Остановка обратной транскрипции не происходила, если использовалась рРНК, выделенная из клеток, в геноме которых ген yhhF был заменен на ген устойчивости к канамицину. При инактивации генов других рРНК метилтрансфераз остановка обратной транскрипции за один нуклеотид до G966 по-прежнему наблюдалась. Необходимо было доказать, что именно инактивация гена yhhF, а не изменение его окружения в геноме, послужила причиной отсутствия модификации. Мы трансформировали штамм, в котором ген yhhF на хромосоме был заменен на ген устойчивости к канамицину, плазмидой, в которой был закодирован ген yhhF. Экспрессия гена yhhF, содержавшегося на плазмиде, компенсировала отсутствие гена yhhF в геноме. Для того, чтобы показать, что белок YhhF без каких-либо дополнительных белков способен модифицировать G966, мы провели метилирование in vitro. Для этого нами были выделены 30S рибосомные субчастицы и 16S рРНК из штамма, в котором ген yhhF был инактивирован. Также, с помощью металлохелатной хроматографии на Ni-NTA агарозе был выделен рекомбинантный белок YhhF, содержащий гексагистидиновый «довесок». Рекомбинантный YhhF метилировал G966 в составе 30S субчастиц, но не был способен метилировать 16S рРНК. Модификации не наблюдалось в отсутствии S-аденозил-L-метионина, что позволяет отбросить маловероятную возможность того, что yhhF кодирует не метилтрансферазу, а специфическую рибонуклеазу.

Для оценки влияния модификации G966 на конкурентоспособность клеток, мы оценили эффективность вытеснения мутантного штамма из культуры клеток при совместной культивации с клетками дикого типа. Использовались различные среды и температуры культивации. Оказалось, что образование m²G966 дает клеткам небольшое преимущество при росте на богатой среде. Поскольку фенотип клеток, лишенных метилирования G966 был практически неотличим от дикого типа, мы сделали вывод о том, что маловероятна важная роль метильной группы, присоединенной к G966, в базовых стадиях трансляции. Возможно, метилирование G966 важно для регуляции работы рибосомы в каких-либо специфических, например, стрессовых условиях.

В нашей совместной работе с лабораторией проф. А. Йохимяка из Центра Структурной Геномики, США, была определена структура белка YhhF. Этот небольшой однодоменный белок имел пространственную укладку Россмана, сходную со структурами многих других метилтрансфераз. Интересно было сопоставить структуру этого фермента со структурой его субстрата, 30S субчастицы. Нуклеотидный остаток m²G966 расположен в углублении, образующем часть Р участка. В комплексе рибосомы с тРНК, m²G966 контактирует с наиболее далеко выступающим нуклеотидом антикодоновой петли тРНК и расположен практически в самом «глубоком» месте «щели», в которой происходит связывание мРНК и антикодонов тРНК. Удивительно, как метилтрансфераза может контактировать со столь малодоступным нуклеотидным остатком. Возможно, именно этим обстоятельством объясняются малые размеры YhhF. Белок не содержит характерных для других ДНК и РНК метилтрансфераз дополнительных узнающих доменов. Напротив, сама форма YhhF способствует его связыванию с Р участком рибосомы, как это было показано при помощи созданной нами компьютерной модели. В отличие от большинства ферментов, в которых субстрат связывается во «впадине» активного центра белка, здесь фермент связывается в «активном центре» субстрата.

С помощью обратной транскрипции рРНК, выделенной из штаммов, в которых были инактивированы гены предполагаемых метилтрансфераз, были установлены гены, ответственные за модификацию нуклеотидов G1835 и G2445 23S рРНК. Ими оказались ygjO и ycbY, соответственно. Экспрессия генов метилтрансфераз, закодированных на плазмиде, компенсировала отсутствие функциональных генов в геноме. В отличие от метилтрансферазы YhhF, субстратом которой служила 30S субчастица, метилтрансферазы YgjO и YcbY использовали депротеинизированную 23S рРНК в качестве субстрата. Отсутствие генов ygjO и ycbY в геноме замедляло рост клеток и приводило к преимущественному размножению клеток дикого типа при совместном культивировании. Особенно выраженным преимуществом обладали клетки дикого типа при выращивании на минимальной среде.

Метилтрансфераза, осуществляющая модификацию нуклеотида m⁶A1618 23S рРНК, была выявлена с помощью обратной транскрипции и масс-спектрометрии MALDI. Эта метилтрансфераза была закодирована в гене ybiN E. coli. Примечательно, что эта метилтрансфераза использовала в качестве субстрата не депротеинизированную рРНК и не 50S субчастицу, а исключительно частично депротеинизированную 3.5М LiCl частицу, сходную с рибонуклеопротеидными комплексами, служащими промежуточным звеном при сборке большой субчастицы. Особенностью YbiN было образование ковалентного соединения с рРНК в случае, когда субстрат подвергался обработке избытком фермента in vivo или in vitro. Наличие ковалентного соединения было показано с помощью со-выделения YbiN с 23S рРНК в денатурирующих условиях.

Отсутствие гена ybiN в геноме E. coli приводит к потере конкурентоспособности по отношению к клеткам дикого типа при совместном культивировании, особенно при росте на богатой среде. Расположение нуклеотида m⁶A1618 в непосредственной близости от туннеля 50S субчастицы позволяет предположить, что метильная группа, переносимая YbiN, может быть необходимой для взаимодействия с туннелем регуляторных пептидов. Тем не менее, среди четырех изученных в работе рРНК метилтрансфераз, мы не выявили ни одной, функционирование которой было бы необходимо для трансляции. Идентификация генов рРНК метилтрансфераз служит непременным первым шагом на пути установления функции модифицированных оснований в рРНК. Скорее всего, эта функция связана с процессами регуляции трансляции или адаптации к стрессовым условиям.

Изучение функции элементов рРНК с помощью мутагенеза

Изменение элементов рРНК, не связанное с нарушением метилирования, возможно с помощью направленного мутагенеза. Для того, чтобы изучить, как та или иная мутация нарушает работу рибосомы, необходимо иметь возможность выделять мутантные рибосомы в чистом виде. Получение мутантных рибосом в чистом виде возможно с помощью штаммов, лишенных рДНК оперонов в геноме, однако, таким образом можно изучать только рибосомы, сохраняющие функциональную активность.

Создание метода выделения рибосом, несущих летальные мутации

Изучение рибосом, несущих летальные мутации, таким способом невозможно. Мы создали метод выделения таких рибосом с помощью аффинной хроматографии. Основой метода служит введение в рРНК участка, с высокой аффинностью взаимодействующего со смолой-носителем. Подобный метод уже повсеместно используется для выделения белков, но только начинал применяться для выделения нескольких небольших РНК. О применении аффинной хроматографии для очистки объектов масштаба рибосомы от практически идентичных рибонуклеопротеидов, отличающихся лишь коротким фрагментом РНК, не сообщалось.

Мы выбрали спирали 9, 25, 45, 63 и 98 23S рРНК для вставки аптамеров, поскольку в различных организмах длины этих спиралей варьируются. В качестве аффинной вставки использовали участок связывания белка оболочки фага MS2, стрептомицин-связывающий аптамер и стрептавидин-связывающий аптамер. Для выделения рибосом с помощью участка связывания белка оболочки фага MS2 нам был нужен гибрид белка оболочки фага MS2 с доменом, который мог бы прочно связываться с каким-либо аффинным сорбентом. Была создана плазмида, кодирующая гибрид двух мономерных молекул белка оболочки и двух Z доменов белка А Staphylococcus aureus. Z домены белка А были нужны для связывания этого гибридного белка с IgG сефарозой. Участки связывания с РНК и с IgG сефарозой были разделены аминокислотной последовательностью, содержащей участок узнавания протеиназой TEV. К сожалению, одновременного связывания гибридного белка и с рибосомой и с IgG сефарозой не наблюдалось. Возможно, это объясняется слишком коротким участком аминокислотной последовательности, соединяющим две части белка, РНК-связывающую и IgG-связывающую.

Аптамер, связывающий стрептомицин, был присоединен к уже сделанной вставке в спираль 98 23S рРНК. Рибосомы, содержащие аптамер, связывали стрептомицин той областью 23S рРНК, которая содержала вставку. Об этом свидетельствовала защита нуклеотидов, входящих в состав аптамера, от химической модификации при связывании стрептомицина. Тем не менее, специфичного взаимодействия рибосом, несущих стрептомицин-связывающий аптамер со стрептомицином, иммобилизованном на агарозе, не удалось. Аминогруппы иммобилизованного стрептомицина превращали агарозу в анионообменную смолу, прочно и неспецифично взаимодействующую с рибосомами как содержащими аптамер, так и с рибосомами дикого типа.

Использование аптамера, взаимодействующего со стрептавидином, привело к желаемому результату. Для внедрения аптамера были выбраны спирали 9, 25 и 45 23S рРНК. Известно было, что вставки участка узнавания белка оболочки MS2 в эти спирали не сказывается на функциональной активности рибосом. Чтобы избежать проблем с отталкиванием такого крупного лиганда, как рибосома, от стрептавидин-сефарозы, была увеличена длина спирального участка, отделяющего аптамер от тех нуклеотидов 23S, где до вставки находились петли этих спиралей. Плазмиды pLK1192U, несущие вставки аптамеров в спирали 9, 25 и 45 могли служить единственным источником рРНК в клетках. Опыты показали, что чистые рибосомы дикого типа не связываются со стрептавидин-сефарозой. Рибосомы, несущие стрептавидин-связывающий аптамер, присоединенный к спиралям 25 и 45, связывались с аффинным сорбентом и элюировались биотином. Связывание с сорбентом рибосом, имеющих вставку аптамера в спираль 25, было на 30% лучше, чем связывание рибосом, содержащих вставку в спирали 45. Рибосомы, в которых стрептавидин-связывающая последовательность была введена в спираль 25 23S рРНК, были использованы для дальнейших опытов по аффинной очистке рибосом, содержащих летальные мутации 23S рРНК.

Изучение значимости для трансляции третичных взаимодействий спирали 34 16S рРНК

Спираль 34 это один из основных структурных элементов декодирующего центра рибосомы. Еще до определения структуры 30S субчастицы с помощью РСА функциональная важность спирали 34 в декодировании и терминации трансляции была выявлена с помощью мутагенеза. Опыты по фотоаффинному сшиванию, проведенные в нашей лаборатории, показали, что спираль 34 находится в контакте с частью мРНК, расположенной от 6 до 9 нуклеотидов к 3' - концу от кодона в Р участке. Взаимодействие спирали 34 с EF-G, было выявлено в ходе экспериментов по химической модификации, проведенных в лаборатории Винтермайера-Родниной.

Спираль 34 связана со спиралью 31 16S рРНК помощью третичного взаимодействия нуклеотидов U961 - A974 - A1201. Положение спирали 34 в пространстве, по-видимому, определяется структурой узла спиралей 3438 16S рРНК. По предсказанию Гутелла, основанном на сравнительном анализе последовательностей, нуклеотид С1109 находящийся в месте соединения спиралей 3438 16S рРНК образует третичный контакт с парой оснований G933-C1384 16S рРНК. Это взаимодействие также может фиксировать положение узла спиралей. Мы сделали мутации U961A, A1201U, и двойную компенсаторную мутацию U961A35A1201U возобновляло способность субчастиц к ассоциации. Скорее всего, разрушение контакта U961 - A974 - A1201 влияло на положение «головы» субчастицы относительно ее «тела» и эффективность образования межсубчастичных мостиков В1 группы. Мутация U961A приводила к большей точности декодирования и меньшей эффективности терминации. Уровень точности декодирования восстанавливался при компенсаторной мутации U961AIV факторов терминации. Фенотип мутаций A1191C и A1191U отличался от фенотипа мутации A1191G. Мутации A1191C и A1191U повышали частоту +1 сдвига рамки считывания и препятствовали терминации, в то время как A1191G - повышала частоту -1 сдвига рамки и не препятствовала терминации. Пиримидиновые основания, меньшее объемные, чем аденин, могли вызывать компактизацию узла соединения спиралей 3438. Гуанин, напротив, «раздвигал» укладку этого узла. В результате могло меняться положение всей спирали 34. В случае компактизации узла соединения спиралей 3438, спираль 34 сдвигалась по направлению к большой субчастице, а в случае увеличения размеров этого узла, от большой субчастицы. Вероятность -1 и +1 сдвига рамки считывания увеличивалась из-за того, что спираль 34 определяет 3' - границу А участка. При перемещении в сторону большой субчастицы, эта спираль будет стремиться сдвинуть антикодон тРНК на один нуклеотид в сторону 5' - конца мРНК. При возможности образования кодон-антикодоновых взаимодействий в -1 рамке считывания это приведет к сдвигу рамки. Отклонение спирали 34 от большой субчастицы будет позволять антикодону тРНК, если это позволяет нуклеотидная последовательность мРНК, образовать кодон-антикодоновый дуплекс в +1 рамке. Таким образом, положение спирали 34, фиксированное с помощью ее третичных взаимодействий, определяет размер декодирующего центра и, таким способом, минимизирует вероятность ошибок декодирования и сдвига рамки считывания.

Определение функциональной роли «желоба», по которому аа-тРНК попадает в А участок.

На поверхности 50S субчастицы, между пептидилтрансферазным центром и участком связывания трансляционных факторов GTPаз проходит желоб, образованный спиралями SRL, 91, 90 и 89 23S рРНК «сверху» и L14 и спиралью 92 23S рРНК «снизу». По этому «желобу» движется аминоацилированный конец аа-тРНК, когда она перемещается от EF-Tu*GDP к PTC. Перемещение аа-тРНК из АА участок было подвергнуто компьютерному моделированию Санбонматсу и коллегами. Согласно компьютерной модели, аминоацилированный конец тРНК движется неравномерно. Временная остановка перемещения аа-тРНК происходит перед сужением, образованном нуклеотидными остатками U2492, C2556 и C2573 спиралей 89, 91 и 90 23S рРНК, соответственно. На основе компьютерной модели возникла гипотеза, что задержка перемещения аа-тРНК в А участок, вызванная этими «воротами», необходима для повышения точности трансляции, поскольку при замедлении перехода аа-тРНК из АА участок аа-тРНК, несоответствующая кодону мРНК, будет иметь дополнительное время для ухода из рибосомы.

Мы сконструировали плазмиды, в которых в ген 23S рРНК были внесены замены С2573 на A, G и U, а также проведена делеция этого нуклеотида и соседнего нуклеотида А2572. Предположительно, замена цитидина на более объемные пуриновые основания должна «сужать» коридор, через который проходит аа-тРНК. Мутации нуклеотида U2492 и его окружения планировались так, чтобы изменить вторичную структуру спирали 89, которой принадлежит этот остаток. Для этой спирали можно предложить два варианта вторичной структуры. Тот вариант, который был определен методом РСА, содержит три неспаренных основания. Альтернативный, гипотетический вариант содержит лишь одно неспаренное основание. Мы внесли в спираль 89 23S рРНК ряд мутаций, UUU2491-3UC, A2459G, U2491C, U2491CG2458C, каждая из которых влияла на предполагаемый переход между двумя альтернативными структурами.

Среди введенных в 23S рРНК мутаций летальными оказались делеции нуклеотидов C2573 и А2572, а также замена UUU последовательности 2491-2493 на UC. Остальные мутации в разной степени замедляли рост клеток, но не были летальными, даже если все рибосомы в клетке содержали мутацию. Измерение скоростей роста клеток позволило заключить, что мутации, дестабилизирующие «альтернативную» вторичную структуру не влияют на процесс трансляции. Напротив, мутации, дестабилизирующие вторичную структуру, наблюдаемую при помощи РСА, приводили к замедлению роста клеток. Мутация UUU2491-3UC, полностью исключающая образование вторичной структуры, наблюдаемой при помощи РСА, была летальна. На основании этих наблюдений можно сделать вывод о том, что «альтернативная» вторичная структура не реализуется в ходе трансляции.

В чем причина летальности, вызываемой мутацией UUU2491-3UC? Проверка эффективности связывания fMet-тРНК_f^Met с Р участком и Phe-тРНК^Phe с А участком показала, что мутация UUC2491-3UC приводит к снижению степени связывания тРНК на 20% с Р-участком и на 50% с А участком. Эффективность переноса пептида, катализируемого мутантными рибосомами, была проверена с помощью гидролиза пептидил-тРНК, выделенной из комплекса с рибосомами, содержащими мутацию UUC2491-3UC и разделения продуктов гидролиза с помощью ВЭЖХ. Оказалось, что эта мутация полностью ингибирует пептидилтрансферазную реакцию. Полученный результат уникален, поскольку ни одна из изученных до сих пор мутаций не приводила к полному ингибированию переноса пептида на аминоацил-тРНК. В литературе описаны лишь мутации, предотвращающие перенос пептида на пуромицин. Поддержание вторичной структуры спирали 89 23S рРНК оказалась важным для пептидилтрансферазной реакции.

Можно было предположить, что мутации нуклеотидов С2572 и А2573 будут влиять на размер «ворот», через которые проходит аа-тРНК. В сотрудничестве с лабораторией Винтермайера-Родниной мы измерили константы скорости перемещения аа-тРНК в А участок рибосом, содержащих мутации A2572U, C2573A, ?2573 и ?2572. Мы ожидали, что в соответствии с моделью Санбонматсу, мутация C2573A будет уменьшать, а ?2573 увеличивать скорость перемещения аа-тРНК в А участок. Для измерения констант скоростей перемещения аа-тРНК в А участок использовали взаимодействие комплекса рибосом, содержащего fMet-тРНК_f^Met в Р участке с комплексом Phe-тРНК^Phe*EF-Tu*GTP. Скорость перемещения аа-тРНК в А участок оценивали по образованию дипептида, поскольку скорость пептидилтрансферазной реакции на 2 порядка превышает скорость перемещения аа-тРНК. Кинетические кривые, описывающие процесс перемещения Phe-тРНК^Phe в А участок рибосом и соответствующие константы скорости представлены на рисунке 10б. Оказалось, что константы скорости перемещения аа-тРНК в А участок рибосом изменяются несущественно в результате мутаций A2572U, C2573A, ?2573 и ?2572 в 23S рРНК. Это значит, что гипотеза Санбонматсу о важности размера «ворот», образованных нуклеотидами С2573, U2492 и С2556, как фактора, определяющего скорость перемещения аа-тРНК не подтверждается.

Изучение роли Е участка в работе рибосомы с помощью мутации С2394G, препятствующей связыванию тРНК с Р и РА участка в АР в РЕ участок?

Кроме функциональной роли гибридного РЕ участком. Для того, чтобы определить, с каким участком мутантных рибосом связана деацилированная тРНК, мы использовали метод химической модификации. В первую очередь подтверждено, что рибосомы, несущие мутацию C2394G в 23S рРНК не могут связывать тРНК в Е участок. На радиоавтографах, интенсивность полос, соответствующих модификации нуклеотидов G2112 и G2116 кетоксалем, практически не изменялась при связывании тРНК с Е участком мутантных рибосом. Для рибосом дикого типа защита нуклеотидов G2112 и G2116 от модификации кетоксалем наблюдалась уже при связывании деацилированной тРНК с Р участком. Взаимодействие тРНК с Е участком 50S субчастицы дикого типа сохранялось и при связывании двух тРНК и при последующей транслокации. Защита нуклеотида U2585 23S рРНК дикого типа от модификации СМСТ возникала при связывании с рибосомой двух тРНК. После транслокации, когда в Р участке рибосом оказывалась не деацилированная, а AcPhe-тРНК^Phe пониженный уровень модификации U2585 сохранялся. Наши опыты свидетельствовали о связывании деацилированной тРНК в гибридный РР участок. Защита нуклеотидных остатков G2112 и G2116 от модификации кетоксалем, характеризующая взаимодействие с Е участком при связывании деацилированной тРНК, не наблюдалась. Нуклеотид U2585 23S рРНК мутантных рибосом оказывался защищенным от модификации 1-циклогексил-3 - карбодиимидметил-п-толуолсульфонатом при связывании деацилированной тРНК, что свидетельствовало о взаимодействии ССА конца тРНК с Р участком 50S субчастицы.

Связывание деацилированной тРНК происходит с Р участком рибосом, несущих мутацию C2394G в 23S рРНК, а не с РЕ участок важно для функциональной активности EF-G в комплексе с рибосомами.

Гибридный РЕ участок может влиять на EF-G? Между РЕ участком и EF-G должна осуществляться с помощью изменения конформации одного или нескольких из этих элементов структуры 50S субчастицы. Внося мутации в эти элементы, мы искали путь передачи аллостерического сигнала исходя их нескольких соображений.

Во-первых, структура 50S субчастицы, определенная с помощью РСА, выглядит монолитной и не позволяет точно идентифицировать подвижные элементы. Мы предполагаем существование нескольких конформаций элементов 50S субчастицы между РЕ участке или нет. Теоретически, возможно создание мутаций 23S рРНК, вследствие которых EF-G будет либо все время взаимодействовать с рибосомой так, как если бы она содержала тРНК в РЕ участке, EF-G слабо взаимодействует с таким комплексом, как будто тРНК в РЕ участка к месту взаимодействия с EF-G. Делеция части ASF привела к усилению степени модификации нуклеотида G956 петли спирали 39 кетоксалем. Спираль 39 привлекла наше внимание еще до определения пространственной структуры 50S субчастицы рибосомы. В нашей лаборатории, с помощью фотоаффинного сшивания, было обнаружено, что D петля 5S рРНК соединяет спирали 39, 42 и 89 23S рРНК. Эти спирали сближены с GAC и PTC во вторичной структуре 23S рРНК. Именно тогда, еще до определения структуры большой субчастицы рибосомы с атомарным разрешением, в нашей лаборатории была сформулирована гипотеза о передаче аллостерического сигнала между PTC и участком связывания EF-G.

Замены нуклеотида А960 на G, C и U оказались не летальными. Рибосомы, несущие эти мутации могли поддерживать жизнь клеток, в которых не было рибосом дикого типа. Замены A960G и А960U практически не меняли времени удвоения клеток, составляющему 1191 минута для клеток дикого типа, 1078 минут для клеток, несущих мутацию А960G в 23S рРНК и 1253 минуты для мутанта А960U. Замена нуклеотида А960 на цитидин замедляла рост клеток.

Мы использовали химическую модификацию рибосом DMS, кетоксалем и CMCT для определения нуклеотидных остатков 23S и 5S рРНК, изменяющих свою конформацию в результате мутаций нуклеотида А960. Как и ожидалось, мутации изменяли структуру петли спирали 39 и D петли 5S рРНК. Степень изменения реакционной способности коррелировала со степенью влияния мутаций на скорость роста клеток.

Наибольшее отличие от дикого типа имели рибосомы, несущие мутацию А960С. Кроме нуклеотидов, непосредственно взаимодействующих со спиралью 39, мы обнаружили еще несколько нуклеотидов 23S рРНК, которые меняли свою реакционную способность по отношению к DMS, кетоксалю или CMCT при мутациях А960. Эти нуклеотиды были расположены вблизи, либо входили в состав PTC. Наиболее удивительным было то, что нуклеотиды G2251, G2252, U2506, U2585, защищаемые от химической модификации при связывании тРНК с Р участком рибосом, также оказывались защищены в рибосомах, несущих мутации А960. Особенно сильным было изменение реакционной способности нуклеотидов PTC при замене А960С. Нарушение структуры спирали 39 23S рРНК приводит к конформационному изменению ПТЦ, делающему недоступными для химической модификации нуклеотиды, взаимодействующие с тРНК в Р участке.

Можно было предположить, что подобное изменение структуры, также делает эти нуклеотиды недоступными для взаимодействия с тРНК. В таком случае мы можем иметь дело со стабилизацией конформации 50S субчастицы, при которой нарушено взаимодействие тРНК с Р участком большой субчастицы. Эта конформация может реализовываться в ходе транслокации, при перемещении тРНК в участки АЕ. Пространственное расположение нуклеотидов, которые меняют конформацию в результате мутации А960С представлено на рисунке 19. Эти нуклеотиды образуют третичные взаимодействия между спиралями 39, 89, 91, 92 23S рРНК и D петлей 5S рРНК. Изучение рибосом, несущих мутации нуклеотида А960, подтвердило, что 50S субчастица имеет участки конформационной подвижности между PTC и местом связывания EF-G. Необходимо было определить, какой из элементов большой субчастицы, расположенных между двумя ее функциональными центрами, необходим для передачи аллостерического сигнала.

Изучение роли взаимодействия между спиралями 89 и 91 23S рРНК в функционировании факторов трансляции - GTPаз

Петли спиралей 89 и 91 23S рРНК находятся между GAC и SRL, двумя участками связывания факторов трансляции, имеющих GTPазную активность. Хотя реакционная способность нуклеотидов спиралей 89 и 91 по отношению к химическим модифицирующим реагентам не меняется при связывании EF-G с рибосомой, IF2 защищает нуклеотиды A2476 и A2478 спирали 89 23S рРНК от модификации DMS. Участок 23S рРНК, изменяющий свою реакционную способность по отношению к DMS при связывании фактора, участвует в третичных взаимодействиях со спиралью 91 23S рРНК. Эти две спирали связывает неканоническая, так называемая обращенная Уотсон-Криковская пара C2475 - G2529. Для изучения функциональной важности этих взаимодействий в 23S рРНК были введены мутации: C2475G, двойная мутация C2475GG2529C наоборот, приводила к разобщению спиралей 89 и 91. Делеция A2471G2529C приводила к увеличению времени удвоения клеток до 13410 мин. Укорочение спирали 89 приводило к самому сильному замедлению роста.

Для оценки роли взаимодействия петель спиралей 89 и 91 в поддержании точности трансляции мы использовали систему плазмид, в которых был закодирован ген lacZ. Мутации, внесенные в этот ген, могли быть компенсированы ошибками при трансляции считанной с него мРНК. Оказалось, что взаимодействие петель спиралей 89 и 91 не важно для поддержания точности декодирования.

Эффективность отдельных стадий трансляции, осуществляемой мутантными рибосомами, мы оценивали с помощью метода тоупринтов. Для этих опытов использовали мРНК, кодирующую пептид MFK. Связывание fMet-тРНК_f^Met с Р участком, связывание Phe-тРНК^Phe*EF-Tu*GTP с А участком и транслокация проходили одинаково эффективно с рибосомами дикого типа и мутантными рибосомами. Кроме того, все типы мутантных рибосом были способны стимулировать не сопряженный с транслокацией гидролиз GTP элонгационным фактором G в той же степени, что и рибосомы дикого типа. Получив подобные результаты, мы пришли к заключению, что взаимодействие спиралей 89 и 91 не важно для функционирования ни EF-Tu, ни EF-G и вообще для элонгации трансляции.

Согласно литературным данным, петля спирали 89 взаимодействует с инициаторным фактором 2. Этот фактор, как EF-Tu и EF-G, связывает GTP, однако, катализирует другой процесс - отбор fMet-тРНК_f^Met и ассоциацию субчастиц при инициации. Связывание IF2*GDPNP с рибосомами мы детектировали, наблюдая за защитой оснований 23S рРНК от химической модификации. Поскольку было известно, что IF2 E. coli связывается с рибосомой слабо и не способен защищать нуклеотиды 23S рРНК от химической модификации, мы использовали IF2 T. thermophilus. Как было известно, взаимодействие IF2 с рибосомой приводит к уменьшению реакционной способности нуклеотида А2665 и повышению реакционной способности нуклеотида А2660 23S рРНК по отношению к DMS. Все мутантные рибосомы были способны связывать IF2*GDPNP, однако степень связывания отличалась у рибосом, несущих мутации. Оценка степени связывания IF2*GDPNP проводилась с помощью сравнения реакционной способности нуклеотидов А2660 и А2665 по отношению к DMS. Мы использовали такой своеобразный «внутренний контроль», чтобы небольшие отличия в интенсивности дорожек радиоавтографа соответствующего полиакриламидного геля, в котором разделяли продукты обратной транскрипции, минимально влияли на результаты нашей оценки. Мутация A2471G2529C приводила к снижению эффективности изменения реакционной способности нуклеотидов А2660 и А2665 23S рРНК на 60%. Ни одна из изученных мутаций не приводила к полному ингибированию связывания IF2 с рибосомой, что вполне согласуется с тем, что мутации не были летальными.

Как же мутации в спиралях 89 и 91 влияют на выполнение фактором IF2 своей функции - сборке комплекса рибосом с мРНК, содержащего fMet-тРНК_f^Met в Р участке? Для ответа на этот вопрос мы использовали метод тоупринтов. Для определения влияния IF2 на сборку инициаторных комплексов сравнивали интенсивности сигналов тоупринтинга, соответствующих инициаторным комплексам, собранным в присутствии всех трех инициаторных факторов и в присутствии только IF1 и IF3. Все мутантные рибосомы были способны образовывать инициаторный комплекс, и для всех мутантных рибосом присутствие IF2 способствовало сборке этого комплекса. Количественные оценки показали, что для мутации A2471G2529C 23S рРНК снижали эффективность работы IF2 вдвое. Эти результаты хорошо согласуются с интерпретацией результатов оценки связывания IF2 с рибосомой и измерения GTPазной активности IF2, стимулируемой рибосомами. Мутации C2475G и C2475GЕ участка большой субчастицы к EF-G. Хотя мутации, нарушающие взаимодействие этих петель, не сказываются на функционировании EF-G, нам показалось интересным выяснить, какие изменения они вызывают в конформации 23S рРНК? Возможно, не прервав цепь передачи аллостерического сигнала полностью, мутации могли сместить равновесие конформеров 23S рРНК. Обнаружение нуклеотидов 23S рРНК, которые изменили свою реакционную способность в результате мутаций в спиралях 89 и 91, позволило бы выявить подвижные элементы 23S рРНК, расположенные между PTC и участком, взаимодействующим с факторами элонгации.

Химическая модификация рибосом, несущих мутации C2475G, C2475GU2479 23S рРНК, проводилась с помощью DMS, кетоксаля и CMCT. Степень модификации тех или иных оснований 23S рРНК определялась с помощью обратной транскрипции. Были обнаружены несколько нуклеотидных остатков 23S рРНК, реакционная способность которых по отношению к используемым реагентам менялась в результате мутаций. Степень изменения конформации рРНК, вызванная мутациями, коррелировала с замедлением скорости роста клеток. Замена C2475G 23S рРНК практически не вызывала изменений реакционной способности нуклеотидов 23S рРНК. Двойная мутация C2475GЕ участка к EF-G. Нуклеотид G956 расположен в непосредственной близости от PTC, а нуклеотид G2751 образует третичный контакт со спиралью 42 23S рРНК, соединяющей GAC с оставшейся частью 23S рРНК. Делеция нуклеотидов A2471G2529C, но дополнительно изменяет конформацию еще нескольких нуклеотидов. В спирали 89 оказываются реакционноспособными по отношению к кетоксалю нуклеотиды G2470 и G2481. Это наблюдение свидетельствует о разрушении части вторичной структуры спирали 89. Неожиданным было обнаружить, что мутация A2471С2655 отмечены стрелкой. Использовали олигонуклеотид, комплементарный нуклеотидам 2730-2749 23S рРНК. В. Зависимость степени не сопряженного с транслокацией гидролиза GTP EF-G от времени. Гидролиз стимулировали рибосомами дикого типа, рибосомами, несущими мутацию G2655С, рибосомами дикого типа в присутствии фусидовой кислоты и рибосомами, несущими мутацию G2655С в присутствии фусидовой кислоты. Г. Изучение влияния мутации G2655С 23S рРНК на эффективность транслокации. Белые столбцы соответствуют функциональным комплексам рибосом дикого типа, черные - комплексам рибосом, несущих мутацию G2655С 23S рРНК. рибосомы, polyU и AcPhe-тРНК^Phe; комплекс + AcPhe-тРНК^Phe; комплекс + EF-G*GTP.

Мы оценивали связывание EF-G с рибосомами по степени модификации нуклеотидов А1067 и А2660 DMS. Основание А1067 принадлежит GAC, а А2660 - SRL. Оценивая степень модификации этих нуклеотидов, можно было получить ответ на вопрпос, взаимодействует ли EF-G с GAC и взаимодействует ли он с SRL. Оказалось, что связывание EF-G с GAC не было подвержено влиянию мутации G2655C. В то же время, заимодействие EF-G с SRL в результате этой мутации было значительно ослаблено.

Было известно, что SRL взаимодействует именно с той частью EF-G, которая связана с GTP. Влияет ли мутация G2655C 23S рРНК на стимуляцию GTPазной активности EF-G рибосомами? Мы использовали не сопряженный с транслокацией гидролиз GTP, для оценки способности EF-G взаимодействовать с рибосомами и осуществлять гидролиз гуанозин - 5' - трифосфата. Оказалось, что рибосомы, несущие мутацию G2655C 23S рРНК, стимулируют не сопряженный с транслокацией гидролиз GTP, осуществляемый EF-G, в той же степени, что и рибосомы дикого типа. Может быть, эта мутация вообще не влияет на функционирование EF-G?

Для оценки эффективности транслокации, катализируемой EF-G, мы использовали пуромициновую реакцию. Способность мутантных рибосом к транслокации была значительно, примерно в 3 раза, снижена. В этом опыте мы не измеряли скорость транслокации, а лишь выход этой реакции за 10 минут. Такой низкий уровень транслокации в течении длительного для элонгационного цикла рибосомы времени свидетельствовал о том, что в клетке рибосомы, несущие мутацию G2655C должны быть практически неактивны в трансляции, что и объясняет летальность мутации. За те же 10 минут мутантные рибосомы стимулировали количественный гидролиз 100-кратного избытка GTP, осуществляемого EF-G. Значит, рибосомы, имеющие мутацию G2655C 23S рРНК, связывают EF-G*GTP и стимулируют гидролиз трифосфата, после чего комплекс рибосомы с EF-G*GDP диссоциирует без прохождения конформационных изменений, необходимых для транслокации.

Сходное явление было описано в литературе для EF-G, в котором домены I и V были сшиты дисульфидной связью. Такой, «конформационно-ограниченный» EF-G взаимодействовал с GAC 50S субчастицы дикого типа и не взаимодействовал с SRL. Отсутствие взаимодействия с SRL не препятствовало гидролитической активности EF-G, но делало транслокацию невозможной. Мы наблюдали практически такой же эффект, нарушая взаимодействие EF-G с SRL с помощь мутации G2655C. Основываясь на результатах этих опытов, можно предложить, в какой последовательности происходят конформационные превращения комплекса EF-G с рибосомой. Взаимодействие EF-G с GAC первично. Для него не требуется «разгибания» субдоменов I-III и IV-V. Взаимодействие EF-G с GAC приводит к гидролизу GTP. Затем, для катализа транслокации, необходимо изменить взаиморасположение субдоменов EF-G. Это изменение конформации EF-G требует стабилизации, достигаемой дополнительно возникающим взаимодействием EF-G с SRL. GAC и SRL оказываются не просто двумя частями участка связывания EF-G, но и элементами, активно участвующими в изменении конформации EF-G, и в транслокации.

Изучение движения GAC как основного конформационного изменения, необходимого для связывания EF-G. Роль GAC в связывании EF-G и EF-Tu.

Факторы элонгации EF-G и EF-Tu взаимодействуют с двумя участками 50S субчастицы - GAC и SRL. По данным криоэлектронной микроскопии, в комплексе рибосомы с EF-G*GDPNP GAC сдвинут в сторону центрального протуберанца. Затем, после гидролиза GTP, рибосома принимает ту конформацию, которую она имела до связывания EF-G. В структуре комплекса рибосомы с аа-тРНК*EF-Tu*GDPNP, GAC немного смещается в сторону спирали 89 23S рРНК, принимая «полузакрытую» конформацию, которая затем, после гидролиза GTP, превращается в «закрытую». Изменение положения GAC можно наблюдать также, сравнивая пространственные структуры 50S субчастиц H. marismortui и D. radiodurans. Очевидно, что GAC это подвижная структура и ее положение относительно других компонентов 50S субчастицы зависит от функционального состояния рибосомы.

Почему GAC может перемещаться относительно других элементов большой субчастицы? Дело в том, что GAC представляет собой разветвленную шпильку, соединенную с оставшейся частью 23S рРНК одной спиралью 42. Эта спираль взаимодействует со спиралью 89 в своем начале и имеет изгиб, образованный т.н. К-поворотом. Мы решили проверить, насколько важен поворот спирали 42 23S рРНК, ведущий к «закрытой» конформации GAC для связывания и функционирования факторов трансляции. Было интересно также выяснить, сопровождается ли переход в эту конформацию другими изменениями структуры 50S субчастицы. Для того, чтобы зафиксировать GAC в «закрытой» конформации вне зависимости от функционального состояния рибосомы, мы ввели в спираль 42 вставку С-G пары после пары оснований C1030-G1124 23S рРНК. Вставка пары оснований в спираль РНК приводит к удлинению спирали на 3-3.5A и повороту нуклеотидов спирали, следующих за вставкой на 30-36^о. В случае спирали 42, имеющей изогнутую Г-образную форму, вставка пары оснований будет приводить к смещению GAC в стороны спирали 89 и образованию «закрытой» конформации.

Перемещение GAC в сторону спирали 89 23S рРНК и образование контакта с этой спиралью должно было сопровождаться изменением реакционной способности нуклеотидов спирали 89 и, возможно, тех элементов структуры 50S субчастицы, которые образовывали третичные взаимодействия с этой спиралью. Для проверки этого предположения мы провели химическую модификацию мутантных рибосом DMS, кетоксалем и CMCT. Степень модификации нуклеотидов 23S рРНК определяли с помощью обратной транскрипции. Множество нуклеотидов 23S рРНК в результате мутации InsC1030G1124, сгруппированы вокруг спирали 89 23S рРНК. Одни нуклеотиды этой группы напрямую участвуют в образовании третичных взаимодействий с этой спиралью, другие участвуют в третичных взаимодействиях со спиралями 23S рРНК, в свою очередь, находящихся в контакте со спиралью 89 23S рРНК. Область изменения конформации рРНК, вызванная переходом GAC в «закрытое» состояние находится между PTC и участком взаимодействия с факторами элонгации. Интересно, что изменение положения GAC вызвало, в свою очередь, изменение конформации SRL.