МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ УКРАИНЫ

Донецкий национальный университет

кафедра физической химии

Курсовая работа на тему:

“Процессы окислительного старения пива и его стабилизация”

Содержание

Вступление

1. Литературный обзор

1.1 Химический состав пива

1.2 Окислительные процессы в пиве и органолептическое старение

1.2.1 Окисление высших спиртов

1.2.2 Окислительный распад изогумулонов

1.2.3 Реакция Майара и распад Штреккера

1.2.4 Автоокисление ненасыщенных жирных кислот и их этиловых эфиров

1.2.5 Ферментативный распад жирных кислот

1.2.6 Фотоокисление жирных кислот

1.2.7 Альдольная конденсация

1.2.8 Вторичное окисление альдегидов

2. Эксперементальная часть

2.1. Хемилюминесцентный метод

2.2. Определение окислительно-восстановительной способности пива

2.2.1. Приготовление фосфатного буфера с рН = 4,35

2.2.2 Измерение оптической плотности раствора 2,6- дихлорфенолиндофенолята натрия в буферном растворе

2.2.3 Определение редуктонов фотометрическим методом

2.3 Синтез меланоидинов

2.4 Определение металлов в пиве

3. Исследование процессов окислительного старения пива и его стабилизация (Обсуждение результатов)

Выводы

Литература

Введение

Пиво, как и любой другой пищевой продукт, имеет ограниченный срок хранения. В зависимости от процессов, ухудшающих качество пива, выделяют биологическую, коллоидную, вкусовую устойчивость пива [8].

Биологическую и коллоидную устойчивости пива, на данный момент, повысить не сложно. Но, даже если пиво стабилизировать биологически и коллоидно, вкус его со временем все равно ухудшается: пиво стареет органолептически [7].

Появление вкуса старого пива, как правило, связывают с накоплением так называемых карбонилов старения. Эти вещества имеют низкое пороговое значение вкуса, поэтому даже небольшое изменение в их количестве приводит к значительным изменениям вкуса и запаха пива, как правило в худшую сторону [3].

Карбонилы старения накопляются в пиве вследствие автоокисления ненасыщеных жирных кислот, при окислении высших спиртов, при меланоидинообразовании, при окислительном расщеплении изогумулонов и при других процессах [7]. Но самым главным источником является автоокисление ненасыщеных жирных карбоновых кислот [7].Известно, что этот процесс идет по радикально-цепному механизму [5].

Проблема вкусовой стабилизации пива остается нерешенной и до сих пор. Поэтому целью этой работы является изучение процессов окисления ненасыщеных жирных карбоновых кислот в пиве, подбор возможных антиоксидантов, которые смогут или замедлить, или совсем остановить окислительные процессы, и таким образом существенно увеличить срок годности данного продукта питания.

1. Литературный обзор

1.1 Химический состав пива

Химический состав пива является довольно сложным. Он не является постоянным. В зависимости от сорта пива, технологии его изготовления и используемого сырья изменяется как количественный, так и качественный состав. Все вещества в пиве разделяют на главные и минорные [19].

Главными компонентами пива являются вода (91-93%), углеводы(1,5-4,5%), этиловый спирт(3,4-4,5%), и азотсодержащие соединения (0,2-0,65%). Углеводы пива (приблизительно 26 г/л) на 75-85% состоят из декстринов. На простые сахара (глюкоза, сахароза, фруктоза) приходится 10-15% от общего количества углеводов. Только 2-3% углеводов представлены сложными сахарами (полисахариды, фрагменты пектина и др.) Пиво содержит незначительное количество высших спиртов(50-100мг/л), метиловый спирт практически отсутствует [12,15]. Азотсодержащие вещества представлены главным образом полипептидами и аминокислотами. В пиве присутствуют все главные аминокислоты, но их содержание незначительно [18,24].

Минорные компоненты пива классифицируют на [19] минеральные вещества, витамины, органические кислоты, фенольные соединения, горькие вещества, ароматические вещества, биогенные амины, эстрогены.

В биологически значимом количестве в пиве присутствуют ионы калия, кальция, магния, фосфора, серы, хлора [18]. Также присутствуют ионы железа, меди, цинка и другие ионы металлов [25].

В пиве много витаминов группы В, а именно В₁ (тиамин), В₂ (рибофлавин) [6,18,26]. Также есть витамин С, который иногда специально добавляют в пиво для предотвращения процессов окисления других компонентов. В пиве мало витамина В₆ (пиридоксин), пантотеновой кислоты, биотина. Многие витамины присутствуют в фосфорелированной форме [6,18,27,26,24,28].

Органические кислоты в пиве присутствуют в виде солей. Больше всего солей лимонной кислоты [29,30]. Также присутствуют соли пировиноградной , уксусной, глюконовой, щавлевой кислот [29].

Общее содержание фенольных соединений колеблется в пределах 150-300 мг/л [6]. Больше всего в пиве содержится антоцианидинов, в состав которых входят лейкоцианидины, протоцианидины и лейкоантоцианидины.

Все горькие вещества пива разделяют на мало и высокосмолистые. Малосмолистые вещества, которых особенно много в пиве, состоят из б-кислот (гумулоны), в-кислот (лупулины) и других соединений, которые еще не исследованы. Гумулоны присутствуют в пиве главным образом в виде изомерных форм, прежде всего в виде изогумулонов, которые отличаются более высокой растворимостью и горьким вкусом. Другая их изомерная форма когумулоны образуют аромат пива [13.21].

На сегодняшний день идентифицировано более 70 компонентов, отнесенных к классу ароматических соединений пива. Все ароматические вещества разделяют на восстановленную и окисленную фракции. Восстановленная фракция включает в себя монотерпены (мирицен) и сескьютерпены (в-кариофилин, гумулин, фарнисин и др.). Окисленная фракция состоит из терпеновых спиртов (линалуол, гераниол), других спиртов, альдегидов, кетонов, эфиров и их производных. Приблизительно на 80-90% ароматические соединения состоят из мирицина, гумулина и кариофилина [10].

Из биогенных аминов в пиве были идентифицированы кадаверин, путрисцин, гистамин, тирамин [9].

Эстрогены представляют из себя вещества, которые имеют четкое гормональное воздействие на человека. В пиве их не так много но достаточно для оказания влияния [24].

Содержание главных и минорных веществ пива можно выразить в виде таблицы (таблица 1 и 2).

Таблица 1 - Содержание основных компонентов в пиве

	Компонент	Содержание
1	Вода	91-93%
2	Глюкоза, сахароза, фруктоза	2,6-2,9 г/л
3	Полисахариды и фрагменты пектина	0,52-2,08 г/л
4	Этиловый спирт	30 г/л
5	Высшие спирты	50-100 мг/л
Таблица 2 - Содержание минорных компонентов в пиве
Класс веществ	Содержание (мг/л)
Минеральные соединения
2	К	160-450
3	Na	120
4	Ca	80
5	Mg	80
6	P	140
7	S
8	CI
9	Fe	Не превышает 1
10	Cu
11	Zn
Витамины
1	В1	0,005-0,15
2	В2	0,3-1,3
3	С	20-50
4	Никотиновая кислота	5-20
5	Фолевая кислота	110
6	В6	0,4-1,7
7	Пантотеновая кислота	0,4-1,7
8	Биотин	5
Органические кислоты
1	Лимонная	130
2	Пировиноградная	60
3	Уксусная	90
4	Глюконовая	30
5	Щавлевая	15
Фенольные соединения
1	Антоцианидины	14-77
2	Эллагиковая, Протокатехиновая, ванилиновая, салициловая, п-оксибензойна кислоты	не более 1
3	Фенол, ортокрезол, кумарины	не более 1
4	Катехины	5-55
5	Эпикатехины	9-24
6	Рутин	1-6
7	Кверцетин	5-125
8	Хлорогеновая кислота	2-20
9	Кверцетрин	1
10	Кофейная кислота	2-20
11	Куиновая кислота	1-5
12	Р-кумариновая кислота	1-7
13	Феруловая кислота	2-21
14	Синапиковая кислота	1-20
15	Камферол	5-20
16	Мирицитрин	1
17	Галлиевая кислота	5-29
Горькие вещества
1	б-кислоты
2	в-кислоты
Ароматические вещества
1	Монотерпены
2	Сескьюитерпены
Биогенные амины
1	Кадаверин	1-3
2	Путресцин
3	Гистамин
4	Тирамин

Высшие жирные карбоновые кислоты. Главным источником попадания этих веществ в пиво является ячмень. Содержание этих кислот в ячменеследующее [1,2] :

Пальмитиновая к-та 0,37 г/100г.

Стеариновая к-та 0,02 г/100г.

Олеиновая к-та0,29 г/100г.

Линолевая к-та0,97 г/100г.

Линоленовая к-та 0.07 г/100г.

(Содержание выражено в граммах кислоты на 100 грамм съедобной части зерна ).

Естественным будет предусмотреть, что эти кислоты попадают в пиво в количествах прямопропорциональных к содержанию этих кислот в ячмене.

1.2 Окислительные процессы в пиве и органолептическое старение

Как уже было сказано, пиво стареет органолептически в результате накопления в нем карбонильных соединений, которые являются продуктами окислительных процессов [3]. Имеются данные о следующих, которые могут привести к образованию определяющих запах и вкус карбонилов [3]:

Окисление высших спиртов.

Окислительный распад изогумулонов.

Реакция Майяра и реакция распада Штреккера.

Автоокисление ненасыщенных жирных кислот и их этилового эфира.

Ферментативный распад ненасыщенных жирных кислот.

Фотоокисление ненасыщенных жирных кислот.

Альдольная конденсация альдегидов, состоящих из коротких цепочек.

Вторичное автоокисление альдегидов.

1.2.1 Окисление высших спиртов

Эти процессы были обнаружены на модельных растворах пива. Меланоидины, при окислении спиртов выступают в качестве окислителей. При этом происходит перенос атома водорода гидроксильной группы спирта в карбонильную группу меланоидинов. В результате из спирта образуется соответствующий альдегид. Значение окисления высших спиртов для образования вкуса старого пива оценивается как незначительное, поскольку особенно активные, с органолептической точки зрения, альдегиды, такие как транс-2-ноненаль не образуется из-за отсутствия в пиве соотвецтвующего высшего спирта.

1.2.2 Окислительный распад изогумулонов

Было обнаружено что при окислительном распаде изогумулонов образуются пропан-2-он, 2-метилпропаналь, 3,4-диметилбутан-2-он, а также 2-метил-3-бутил-2-ол [5]. Причем меланоидины должны выступать в этой реакции в качестве антиоксидантов [3].

1.2.3 Реакция Майяра и распад Штреккера

При реакции Майяра образуются различные б-дикарбонильные соединения, которые в рамках распада Штреккера могут реагировать с аминокислотами. При этом аминокислота в ходе декарбоксилирования переводится в альдегид, в котором на один атом углерода меньше:

Образующиеся в ходе реакции Майяра и распада Штреккера альдегиды не принадлежат к компонентам, определяющим старение пива. Однако распад Штреккера считают ответственным за формирование хлебного привкуса в пиве при его пастерезации [4,11,14].

1.2.4 Автоокисление ненасыщенных жирных кислот и их этиловых эфиров

Попавшие в пиво, даже в незначительных количествах, ненасыщенные жирные кислоты и образовавшиеся при брожении этиловые эфиры несут в себе опасность для стабильности вкуса пива. Только ненасыщенные жирные кислоты окисляются достаточно быстро, чтобы их можно было считать веществами, обусловливающими вкус старого пива [4].

Так линоленовая кислота окисляется в 3-4 раза быстрее, по сравнению с линолевой кислотой, а последняя, в свою очередь, в 30 раз быстрее масляной кислоты. На модельных растворах пива было обнаружено, что автоокисление жирных кислот протекает по радикальному механизму [5].

При этом радикал, в большинстве случаев ракал пероксида, отщепляет атом водорода от молекулы жирной кислоты. Вновь возникший радикал, в свою очередь, реагирует с молекулярным невозбужденным кислородом с образованием радикала пероксида. Последний отщепляет атом водорода у следующей молекулы жирной кислоты и трансформируется в результате в гидропероксид жирной кислоты [3].

Поскольку линолевая кислота характеризуется максимальным содержанием в ячмене, по сравнению с другими ненасыщенными жирными кислотами , то целесообразно рассмотреть автоокисление на ее примере.

Процесс автоокисления линолевой кислоты имеет вид:

RH + R^'O₂*> R^'OOH + R*

R* + O₂ > RO₂*

RO₂* + RH > ROOH + R*

(RH - линолевая кислота; R^'O₂*- пероксирадикал)

Радикал пероксида атакует параллельном к двойной связи положении молекулу линолевой кислоты, преимущественно у 11-го атома углерода, поскольку здесь атом водорода может быть отщеплен легче всего. Однако атака возможна и в положениях 8 и 14. В результате образуется целая серия гидропероксижирных кислот, причем 9 и 13-гидропероксилинолевая кислота характеризуется наивысшей концентрацией [3].

В результате окисления в пиве образуются всевозможные гидропероксижирные кислоты, образованные из всех содержащихся непредельных карбоновых кислот. Эти кислоты подвержены распаду с образованием карбонилов старения. Схематически для всех гидропероксижирных кислот такой распад выглядит следующим образом:

Как видно, в зависимости от того расщепляется молекула жирной кислоты по варианту А или Б, возникают различные продукты. Расщепление с позиции Б энергетически более выгодно. С одной стороны образуется ненасыщенный альдегид, а с другой - жирная кислота, состоящая из коротких цепочек.

Образующиеся при распаде радикалы гидроксида чрезвычайно активны и могут отщеплять атомы водорода практически от всех органических молекул.

Исходя из вышенаписанного, можно сделать вывод, что автоокисление непредельных жирных кислот является цепным процессом с вырожденным разветвлением.

Реакции окисления способствует повышенная температура, низкое значение рН, наличие окислителей. Ионы тяжелых металлов оказывают каталитическое воздействие на процессы окисления. Так ионы железа и меди в форме реакции Фентона и Хабера-Вайса оказывают влияние на стадиях зарождения цепи окислительных реакций:

Реакция Фентона:

Fe²⁺ + H₂O₂ > Fe³⁺ + OH* + OH^?

Fe³⁺ + H₂O₂ > Fe²⁺ + O₂*^? + 2H⁺

Итого: 2H₂O₂ > OH* + OH^? + O₂*^? + 2H⁺

Реакция Хабера-Вайса:

Cu²⁺ + O₂*^?> Cu⁺ + O₂

Cu⁺ + H₂O₂ > Cu²⁺ + OH* + OH^?

Итого: O₂*^? + H₂O₂ > O₂ + OH* + OH^?

Образующиеся радикалы чрезвычайно активны и могут стать инициаторами окислительных реакций.

1.2.5 Ферментативный распад жирных кислот

Под действием липоксигеназы ячменя в присутствии кислорода воздуха линолевая и линоленовая кислоты превращаются в гидропероксикислоты, которые распадаются на различных стадиях производства пива с образованием карбонилов [16].

Однако, как правило, эти процессы идут либо во время, либо перед брожением и дрожжи восстанавливают карбонилы до соответствующих спиртов. Спирты после брожения способны опять окислятся в карбонилы, но этот процесс идет медленно даже при повышенных температурах. Поэтому долю карбонилов, образующихся таким путем можно оценивать как незначительную [17,20].

1.2.6 Фотоокисление жирных кислот

В этом процессе синглетный кислород реагирует, не требуя катализаторов, и независимо от температуры, с двойными связями жирной кислоты и образованием гидропероксидов, или альдегидов [3].

Сенсибилизаторами этого процесса может быть рибофлавин (витамин В2), хлорофилл, производные порфирина и другие красители, содержащиеся в пиве.

Было обнаружено в пиве образование различных ненасыщенных, а также однократно и двукратно ненасыщенных альдегидов при фотоокислении масляной и линолевой кислот [22].

1.2.7 Альдольная конденсация

Используя модельные растворы, удалось обнаружить что насыщенные альдегиды, состоящие из коротких цепочек, реагируют при каталитическом действии аминокислоты пролин сацетальдегидом в форме альдольной конденсации. При этом образуется ненасыщенный альдегид, который на 1, 2 атома углерода. Так в качестве продуктов альдольной конденсации были обнаружены гептанал с ацетальдегидом, транс-2-ноненаль и 2-пентил-2-бутиналь [5]. Правда в пиве эта реакция пока не была обнаружена, что можно объяснить незначительной концентрацией соответствующих веществ [31].

1.2.8 Вторичное автоокисление альдегидов

Содержащиеся в пиве альдегиды в свою очередь подвержены самым различным последовательным реакциям. Так ненасыщенные альдегиды могут переводится при вторичном автоокислении в насыщенные с более короткой цепочкой. Например, из транс-2-ноненала может образовываться пентонал, гексонал, гептанал и октанал [5].

Таким образом, среди реакций, которые ведут при старении пива к образованию карбонильных соединений, сильно искажающих его вкус и запах, особое внимание заслуживают реакции с радикалами, протекающие при автоокислении жирных кислот и их этиловых эфиров.

Как известно, замедлить или вообще остановить подобные процессы можно благодаря использованию антиоксидантов, которые обрывают цепи окислительных процессов.

Поэтому целью данной работы стало изучение окислительных процессов в пиве и разработка способов стабилизации его вкусовых качеств.

2. Эксперементальная часть

2.1 Хемилюминесцентный метод

Одним из методов изучения кинетики химических реакций может быть измерение хемилюминесценции, то есть свечения, которое сопровождает, химические процессы. Хемилюминесценция возникает в экзотермических элементарных актах реакций, поэтому ее характеристики закономерно связаны с характеристиками реакций. Детальное изучение закономерностей хемилюминесценции в реакциях, которые идут с участием свободных радикалов, показало, что свечение возникает в элементарных актах рекомбинации свободных радикалов по схеме:

RO₂* + RO₂* > [ROOOOR] > R=O^* + O₂ > R=O + hх

Как видно, свечение возникает при квадратической рекомбинации пероксирадикалов и его интенсивность пропорциональна скорости этого процесса.

I = ?₆k₆[RO₂*],

где ? - квантовый выход свечения, то есть вероятность превращения энергии, которая выделилась в результате рекомбинации радикалов, в энергию кванта света.

На рисунке 2.1 приведена схема установки для изучения реакций жидкофазного окисления по хемилюминесценции. Установка состоит из реакционного сосуда 1, который находится в светонепроницаемой камере 2 и к которому подсоединена система продувки газа 3, охлаждения 4 и термостатмирования 5, фотоумножителя ФЕУ-6, защищенного кожухом 7, усилителя постоянного тока (У1-7) 8, высоковольтного выпрямителя стабилизатора (ВС-22) 9 и автоматического электронного потенциометра (ЕПП-0,9М) 10.Свечение, которое возникает в процессе окисления, через светофильтр 11 направляется на внешний торец светопровода 12, а потом попадает на фотоумножитель, где световой сигнал превращается в постоянный ток, который через выносной каскад электрометрического умножителя попадает в электрометрический усилитель 8 и регистрируется с помощью автоматического потенциометра 10.

Поскольку интенсивность свечения прямопропорциональна количеству окисляемого субстрата, в реактор вводилось постоянное количество пива (5мл).

Пиво перед опытами тщательно дегазировалось для удаления СО₂.

2

4

1

6 7

3

Рис. 2.1 Схема хемилюминесцентной установки 1 - реакционный сосуд; 2 - светонепроницаемая камера 3 - продувка газом в реакционный сосуд 4 - обратный холодильник 4 - вводы термостата 6 - фотоумножитель 7 - кожух фотоумножителя 8 - усилитель постоянного тока 9 - высоковольтный стабилизатор 10 - электронный потенциометр 11 - светофильтр 12 - светопровод 13 - выносной каскад электрометрическогоусилителя.

2.2 Определение окислительно восстановительной способности пива (ОВС)

2.2.1 Приготовление фосфатного буферного раствора с рН = 4,35

1,08876 г КН₂РО4 растворяют в 120 мл дистиллированной воды. 0,23876 г Na2HPO4*12H2O растворяют в 120 мл дистиллированной воды. 0,35 мл раствора Na2HPO4*12H2O помещают в мерную колбу на 100 мл и доводят до метки раствором КН2РО4. рН полученного раствора = 4,78. На рН-метре доводим рН буферного раствора до 4,35 добавлением 0,1 М раствора HCI.

2.2.2 Измерение оптической плотности раствора 2,6- дихлорфенолиндофенолята натрия в буферном растворе

К 10 мл фосфатного буферного раствора (рН=4,35), из микробюретки осторожно по стенкам пробирки приливают 0,25 мл 0,005 М водного раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия. Содержимое встряхивают, наполняют кювету на 1 см. и определяют оптическую плотность при длине волны 520 нм. Свидетель - дистиллированная вода.

2.2.3 Определение редуктонов фотометрическим методом

Этим методом определяется окислительно-восстановительная способность, зависящая от количества редуктонов в исследуемом растворе. Сущность метода заключается в измерении оптической плотности раствора по истечении 60 секунд после прибавления к нему чувствительного реактива (2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия). Редуктоны восстанавливают его красные кислые или голубые щелочные растворы в бесцветное лейкосоединение

Реактив имеет синюю окраску при рН = 6 которая переходит в красную при рН = 5,5. При определении редуктонов в пиве применяют 0,005 М раствор индикатора.

Пиво перед анализом выдерживают при 20⁰С. В пробирку берут 10 мл пива, освобожденного от СО2, и из микропипетки приливают 0,25 мл 0,005 М раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия. Содержимое встряхивают и включают секундомер. По истечении 60 сек. смесью наполняют кювету на 1см и определяют оптическую плотность при длине волны 520 нм.

Окислительно-восстановительную способность рассчитывают по формуле

ОВС = 100(1-Д520)/Д0

Где Д520- оптическая плотность раствора пива и 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия; Д0 - оптическая плотность раствора индикатора при рН = 4,35

Как правило, индикатор за 60 сек. обесцвечивается на 80%. Если же исследуемое пиво имело большую ОВС (100% обесцвечивание), то количество индикатора может быть удвоено.

2.3 Синтез меланоидинов

Главную роль в формировании окраски пива играют меланоидины. Также они придают пиву специфический вкус и аромат, оказывают благоприятное влияние на пеностойкость и стабильность пива.

Меланоидины не являются индивидуальным веществом. Это сложная смесь продуктов взаимодействия редуцирующих сахаров с аминокислотами.

Образование меланоидинов при взаимодействии глюкозы и глицина идет по схеме:



Последний продукт в наведенной схеме (дифруктоглицин) конденсируемся с аминокислотами с образованием азотсодержащих окрашенных пигментов. Среди продуктов меланоидинообразования содержатся пиразиновые, имидазольные производные, фурфурол, оксиметилфурфурол, метилглиоксаль, пировиноградный альдегид, ацетальдегид, диацетил, и др.

На 1 часть по массе аминокислоты (на сухое вещество) берут 4 части глюкозы и 6 частей дистиллированной воды. Смесь кипятят с обратным холодильником на песчаной бане в течении 10 ч. Нагревание должно проводится осторожно во избежание образования нерастворимых форм меланоидинов.

После остывания желеобразную массу растирают в ступке и 10 минут взбалтывают с 5-кратным количеством этилового спирта. Жидкую часть отсасывают на фильтре под вакуумом и производят дегидратацию ацетоном. Затем полученный зернистый продукт обрабатывают диэтиловым эфиром. Эфир сливают и последние следы органических растворителей удаляют под вакуумом.

2.4 Определение металлов в пиве

Анализ сусла и пива проводили атомноабсорбционным методом по межгосударственному стандарту ГОСТ 30178-96 на атомно-абсорбционном спектрометре Сатурн-3. Подготовку проб сусла и пива проводили по ГОСТ 26929-86 и межгосударственному стандарту ГОСТ 26929-94. Воду готовили по международному стандарту ИСО 11885.

Подготовку проб пива проводили следующим образом, пробу упаривали досуха и проводили обугливание до прекращения выделения дыма. После окончания обугливания минерализацию проб проводят в печи, повышая температуру до 450⁰С, до получения серной золы. После этого содержимое смачивают раствором азотной кислоты. Выпаривают кислоту досуха на водяной бане с последующей выдержкой в сушильном шкафу при температуре до 140⁰С. После охлаждения чашу с навеской снова помещают в электропечь. Постепенно доводят температуру до 300⁰С и выдерживают в течении 0,5 ч. Указанный цикл повторяют несколько раз. Минерализацию считают законченной, когда зола станет белого или слегка окрашенного цвета. Полученную золу используют в опытах.

3. Исследование процессов окислительного старения пива и его стабилизация (обсуждение результатов)

Неферментативное окисление основных биохимических компонентов пива считается в настоящее время основной причиной порчи вкуса и запаха напитка при хранении. Самыми известными реакциями старения пива являются радикальные реакции автоокисления ненасыщенных жирных кислот, эфиров, спиртов с образованием карбонилов старения, придающих пиву специфический вкус и запах.

Доказательства реакций, протекающих с образованием радикалов, опираются на изменение естественной хемилюминесценции в этих процессах. Метод хемилюминесценции является одним из наиболее информативных при изучении радикальных реакций окисления и при решении проблем торможения таких реакций.

Этот метод и был использован для изучения окислительных процессов в пиве. В основе метода хемилюминесценции (ХЛ) лежит реакция рекомбинации пероксирадикалов (RO₂*) окисляющегося субстрата с образованием электронновозбужденных продуктов (карбонильные соединения):

RO₂* + RO₂* > [ROOOOR] > R=O^* + O₂ > R=O + hх

При переходе молекул из возбужденного (R=O^*) в обычное состояние испускается квант света. Интенсивность (I) возникающего в процессах окисления свечения пропорциональна концентрации RO₂* , а значит интенсивности протекающих в системе реакций окисления. Метод ХЛ позволяет установить вещества, способные вызвать хемилюминесценцию, а также оценить влияние на ХЛ различных веществ в зависимости от того как они ослабляют или усиливают естественную хемилюминесценцию пива.

Поскольку естественная ХЛ свежего пива очень слабая и не может быть измерена, то пиво подвергалось форсированному старению (60-70⁰С) с добавлением в качестве инициатора окисления персульфата натрия. Инициирующее действие персульфата связано с протеканием в указанных условиях следующих реакций:

N_a2S₂O₈ + 2H₂O > H₂O₂ + 2N_aHSO₄

H₂O₂ > 2HO*

N_a2S₂O₈ > 2N_aSO₄*

Возможно образование гидроксильных радикалов по схеме[23]:

S₂O₈^2- + H₂O > SO₄*^- + HSO₄^2- + OH *

На рис.3.1 приведена кривая изменения ХЛ при окислении кислородом светлого пива завода “Сармат”.

(70⁰С W N_a2S₂O₈=7%)

Видно, что наблюдается достаточно сложная картина изменения ХЛ-свечения. На диаграмме имеется два максимума (h₁,h₂). Появление второго пика наблюдается через продолжительный промежуток времени - период индукции (ф).

Общий вид хемилюминесцентной кривой сохраняется неизменным с изменением партии пива одного производителя (ЗАО “Сармат”) и при использовании напитка других производителей (Чехия, Австрия, Балтика, Оболонь). Это позволяет считать картину хемилюминесценции причиной для исследуемой системы. Изменения величин h₁, h₂ и ф для пива разных образцов и производителей указывает на индивидуальные отличия каждого из напитков и характеризует их окислительно-восстановительные свойства.

Основными компонентами пива, способными усиливать или ослаблять ХЛ-свечение могут быть: ненасыщенные жирные кислоты, их этиловые эфиры, спирты, меланоидины, фенольные соединения, горькие и ароматические вещества хмеля, соединения металлов переменной валентности, кислород.

Для выяснения их роли в процессах окисления в пиве и интерпритации вида ХЛ-кривой исследовалось влияние основных компонентов системы на величины h₁, h₂ и ф.

Показано, что отключение подачи кислорода в систему или замена кислорода на аргон приводит к исчезновению свечения. Это свидетельствует о возникновении хемилюминесценции в реакциях с участием пероксирадикалов (RO₂*).

С увеличением концентрации радикального инициатора окисления (N_a2S₂O₈) высота первого и второго пиков увеличивается (рис.3.2), а период индукции уменьшается (рис.3.3).

Такие зависимости подтверждают радикальную природу процессов окисления, а также свидетельствуют о том, что высота первого и второго максимумов ХЛ характеризуют интенсивность радикальных реакций окисления в пиве. Величина ф, соответствующая затуханию хемилюминесценции, по-видимому, обусловлена наличием в пиве веществ, подавляющих окисление (антиоксидантов).

Хемилюминесценция пива зависит от температуры окисления. С понижением температуры h₁ и h₂ уменьшаются, а ф существенно возрастает (рис.3.4).

Ионы железа и меди катализируют ХЛ, увеличивая высоту пиков h₁ и h₂ и, уменьшая период индукции. На рис.3.5 приведена зависимость ф от концентрации Fe²⁺. Железо и медь могут стимулировать образование в пиве радикалов в форме реакций Фентона и Хабера-Вайса:

Реакция Фентона:

Fe²⁺ + H₂O₂ > Fe³⁺ + OH* + OH^?

Fe³⁺ + H₂O₂ > Fe²⁺ + O₂*^? + 2H⁺

Итого: 2H₂O₂ > OH* + OH^? + O₂*^? + 2H⁺

Реакция Хабера-Вайса:

Cu²⁺ + O₂*^?> Cu⁺ + O₂

Cu⁺ + H₂O₂ > Cu²⁺ + OH* + OH^?

Итого: O₂*^? + H₂O₂ > O₂ + OH* + OH^?

Контроль содержания этих металлов в воде, сусле и пиве является важным элементом в решении проблемы повышения вкусовой стабильности пива. Содержание железа в готовом пиве не должно превышать значения 1мг/л. Для оценки влияния естественной примеси железа на окисление и хемилюминесценцию пива атомно-абсорбционным методом в различных образцах свежего пива определено содержание железа (табл.3).

Таблица 3 - Содержание железа (Fe²⁺ ;Fe³⁺) в образцах светлого пива ЗАО “Сармат”

Номер образца	Содержание железа, мг/л
1	0,01
2	0,10
3	0,20
4	0,40
5	0,60
6	1,60

Из таблицы 1 видно, что в большинстве образцов количество железа не превышает предельно-допустимой концентрации (ПДК=1мг/л). Следует отметить, что железо в пиве присутствует, в основном, в форме Fe²⁺ и, по-видимому, связано в комплексы с полифенолами. Малое содержание железа в пиве и дезактивация его в составе комплексов позволяет пренебречь его влиянием на радикальные окислительные процессы в пиве.

В таблице 4 приведены результаты исследования влияния различных компонентов пива на параметры хемилюминесценции (h₁,h₂,ф).

Анализ полученных результатов позволяет отметить следующее:

дополнительное количество эфиров непредельных кислот (твин80) в пиве усиливает начальную хемилюминесценцию (h₁), не влияя при этом на параметры h₂,ф;

Таблица 4 - Изменение параметров ХЛ пива при введении дополнительного количества его компонентов. (Т=70⁰С, СN_a2S₂O₈ =7%)

Компонент пива	h1/h01	H2/h02	ф/ ф0
Без добавок	1	1	1
Твин	1,5	1	1
Меланоидины	1,07	0,96	1,05
Ионол	1,37	0,96	1,1
Кофейная к-та	1,5	0,86	1,3
СО2-экстракт хмеля	1,0	0,93	1,0

меланоидины, являющиеся сложной смесью соеденений, образующихся при нагревании аминокислот с сахарами, практически не изменяют параметры хемилюминесценции;

дополнительное введение фенолов (ионол, кофейная кислота) в пиво существенно повышает свечение в первом пике, понижает высоту второго и увеличивает период индукции ;

увеличение количества СО₂-экстракта хмеля, применяемого для охмеления сусла в производстве пива, не изменяет параметры хемилюминесценции.

С учетом вышеустановленных фактов можно сделать некоторые предварительные выводы про природу и механизм ХЛ-свечения, возникающего при окислении пива:

Хемилюминесценция обусловлена радикальными реакциями окисленикомпонетов пива, протекающими с участием кислорода.

Интенсивность ХЛ-свечения в первом максимуме обусловлена окислением легкоокисляемых компонентов (ненасыщенных жирных кислот и их эфиров) с образованием пероксирадикалов (RO₂*), рекомбинирующих с хемилюминесценцией.

Фенольные соединения (PhOh) пива (кверцетин, протокатеховая кислота и др.) способны подавлять свечение в результате реакции:

(2) PhOH + RO₂* > ROOH + PhO*

а значит свечение (I) должно понижаться до израсходования природных антиоксидантов пива.

Наличие свечения (h₁) в начале окисления позволяет предположить, что его источником, кроме реакции 1 является реакция с участием образовавшегося в реакции 2 феноксильного радикала:

PhO* + RO₂* > (хинон)^* > хинон + hн

Возможность возникновения свечения по реакции 3 установлена ранее в углеводородных средах где показано, что она протекает с более высокими квантовыми выходами, чем реакция 1. В водных (полярных) средах вероятность протекания реакции 3 с ХЛ-свечением возрастает. В пользу предложения о возникновении ХЛ-свечения в реакции 3 свидетельствуют данные об увеличении h₁ добавками твина и фенолов.

Уменьшение концентрации RO₂* вследствие реакции 2 подавляет реакции 1 и 3 и свечение существенно снижается в течении времени ф. Наличие свечения в периоде индукции можно объяснить незначительным протеканием реакции 3.

После израсходования PhOH свечение усиливается что и обуславливает высоту максимума h₂.

Поскольку СО₂-экстракт хмеля не влияет на параметры хемилюминесценции, это означает что горькие и ароматические вещества хмеля (гумулоны, лупулины, хмелевые масла) не участвуют в окислительных процесах, сопровождаемых хелюминесценцией. Индифферентность экстрактов хмеля по отношению к хемилюминесценции пива свидетельствует и о низкой антиокислительной активности фенолов этого экстракта. Это согласуется с литературными данными по составу фенолов хмеля, которые являются, в основном, олигомерными и полимерными формами фенолов. Тормозить процессы окисления способны, в основном, мономерные фенолы. Мономерные фенолы поступают в пиво из ячменя, однако их количество недостаточное.

Второй максимум на ХЛ-кривой (h₂) соответствует возобновлению свечения после израсходования фенолов, в результате возобновления реакции 1 и 3.

Полученные результаты хемилюминесцентных исследований окислительных процессов в пиве показали, что метод ХЛ позволяет установить компоненты, участвующие в процессах окисления и вызывающие хемилюминесценцию. Метод позволяет оценить проокислительную и анттиокислительную способность веществ в зависимости от их влияния на интенсивность хемилюминесценции.

Проведенные исследования показали также, что наиболее эффективным методом повышения вкусовой стабильности пива является сохранение или увеличение в нем редуцирующих веществ (антиоксидантов). Такими веществами в пиве являются, в первую очередь фенолы ячменя и, возможно, меланоидины. Чем больше антиоксидантное действие таких веществ, тем более высокая его вкусовая устойчивость.

В связи с вышеуказанным, становится понятной необходимость контроля в пиве содержащихся редуктонов (восстанавливающих веществ). Определение редуктонов в пиве проводили фотометрическим методом с использованием индикатора - 2,6-дихлорфинолиндофенолята натрия. Это позволило рассчитать окислительно-восстановительную способность (ОВС) пива, значение которой приведены в таблице 5.

Таблица 5 - Значение ОВС светлого пива ЗАО “ Сармат ” и светлого пива других производителей

Производитель пива, тара, срок хранения	ОВС
“ Сармат” стекло, до 16.11.03 стекло, до 30.11.03 стекло, до 02.12.03 стекло, до 19.02.04 стекло, до 21.06.04 ПЭТ, до 30.11.03 ПЭТ, до 19.02.04	58 66 70 61 84 57 61
Чехия, до 20.01.05 Австрия, до 01.09.04 Балтика, до 23.07.04 Оболонь, до 06.06.04	90 78 74 81

Анализ полученных значений ОВС позволяет отметить следующее:

по величине ОВС свежего пива можно судить о перспективной вкусовой стабильности напитка при его хранении; значения ОВС ниже значения 60 свидетельствует о более низкой стабильности пива;

стартовые (исходные) значения ОВС свежего пива завода “ Сармат “ существенно отличаются для разных партий напитка, а значит целесообразно контролировать этот показатель при определении сроков хранения пива;

отдельные образцы выпускаемого пива имеют высокий уровень ОВС; данный факт свидетельствует о необходимости проведения анализа причин получения пива такого качества.

Изучена динамика изменения ОВС одного из образцов пива (срок годности до 19.02.04) в течение трех месяцев хранения в стеклянной таре и ПЭТ (?20⁰С, в темноте). Установлено что в процессе хранения показатель ОВС пива снижается (рис.6), что свидетельствует об уменьшении содержания естественных антиоксидантов. Снижение ОВС более выражено в пиве, хранящемся в ПЭТ. Снижение показателя ОВС сопровождается повышением цветности и мутности пива, что также более выражено для пива в ПЭТ.

Полученные в ходе исследования результаты позволяют наметить направления дальнейших исследований с целью повышения вкусовой стабильности пива путем введения дополнительного количества мономерных фенолов растительного происхождения, а также растительных экстрактов. Такие антиоксиданты (АО) используются для стабилизации кондитерских изделий, жиров и жиросодержащих продуктов.

Мономерные растительные фенолы и их смеси в составе экстрактов ряда растений не только более реакционно способны, чем высококонденсированные фенолы хмеля, но, в отличие от последних не способствуют осаждению белковых соединений пива, а значит не должны нарушать его коллоидную стабильность. Их антиоксидантное действие обусловлено способностью дезактивировать активные формы кислорода, свободные радикалы и связывать в комплексы металлы переменной валентности.

Выводы

1. Изучено особенности хемилюминесценции (ХЛ), которая наблюдается при инициированном окислении пива .

2. Доказано, что хемилюминесценция пива обусловлена радикальными реакциями окисления его компонентов, протекающими с участием кислорода.

3. Установлено влияние основных компонентов пива на его ХЛ. Отключение подачи кислорода приводит к исчезновению ХЛ свечения. Дополнительное введение фенолов приводит к увеличению периода индукции.

4. Подтверждено, что ХЛ свечение пива является следствием реакций рекомбинации между пероксильными радикалами, а также следствием реакций между пероксильным и феноноксильным радикалами.

5. Изучена динамика изменения окислительно восстановительной способности пива при его хранении.

6. Установлено, что наиболее эффективным методом повышения вкусовой стабильности пива является дополнительное введение антиоксидантов.

Литература

1. Химический состав пищевых продуктов / Под ред. М.Ф. Нестерина // М.: Пищевая промышленность, 1979 -250С.

2. Изменение липидов в процессе пивоварения и их влияние на вкусовую стабильность пива Е. Г. Иванова // Журнал Пиво и напитки.- 2003.- №3.- С.12-13.

3. К. Вакербауэр, Р. Хардт Реакция с радикалами и стабильность вкуса пива//Журнал Brauwelt Мир пива.- 1997.- №.- 4.-С.38-42.

4. Мейльгард М. Затхлый вкус пива, вызванный карбонилами// дайджест Brew. Dig. 47,1972.- С.52,54,56,57,62.

5. Хашимото Н.Кураиво Пути образования летучих альдегидов во время хранения бутылочного пива// Научно-исследовательский отчет лаборатории фирмы Kirin Brew, 18,1- 11,1975.

6. HASHIMOTO,N.:Rep.Rs.La6.Com. 31, 1988, S. 99.

7. Кунце Правильное пиво - как его сварить?// Журнал пиво и напитки.- 2001.- №2.

8. С. Горал Новое направление в стабилизации пива//2Журнал Brauwelt Мир пива.- 1999.- №5.- С.27.

9. BASAROVA, G.: Brauwissenschaft 27.1974, S.244.

10. MARZISS, L. MEHLTRETTER, A.: Brauwissenschaft 24. 1971, S. 273.

11. Блокманс, Машелен, Деврю А.: Источники определенных соединений карбонилов, образующихся в результате старения пива// Материалы 17-го конгр. Евр. пивов. конв., 279 - 291, Берлин 1979.

12. DROST, B. W. etal.: I. Amer. Soc. Brew. Chem. 48, S.124.

13. BAMFORT, C. W., MULLER, R. E., WALKER, M. D.: I. Amer. Brew. Soc. Chem. 51, 1993, S. 79.

14. Машелен Роль фотохимических реакций для устойчивости вкуса пива// Cerevisia 5, 107, 110, 1980.

15. HASHIMOTO, N., ESHIMA, T.: I Amer. Soc. Brew. Chem. 35, 1977, S.145.

16. Косса Т., Барри Д., Трессль Р. Ароматические вещества солода и их вклад в аромат пива// Mschr. Brauerei 32, 249 - 252, 254, 1974.

17. Стенрооз Л., Уонг П., Зиберт К. Источники образования 2-ноненала в нагретом пиве// Журнал MBAA Techn. Qart 13. 227-232, 1976.

18. BELDEROK, B.: I. Inst. Brew. 74, 1968, S 333.

19. AMAHA, M., HORIUCHI, T.: Soc. Brew. Japan 74, 1971, S 273.

20. Эстербауэр Х., Шауэнштайн Е. Изомеры тригидроксиоктадеценовых кислот в пиве: доказательство их существования и их количественное определение// Журнал Lebensm. Unters. Foorsch. 164, 255-259, 1977.

21. NARZISS, L., MEHLTRETTER, A.: Drauwissenschaft 24, 1971, S.273.

22. Тресль Р., Барри Д. Образование альдегидов в результате окисления липидов и их значение как компонентов, нарушающих вкус пива// материалы 19-го конгр. Евр. повов. Конв., 525-532, Лондон 1983.

23. Торопцева А.М., Белгородская К.В., Бондаренко В.М. Лабораторный практикум по химии и технологии высокомолекулярных соединений// Под. ред. проф. А.Ф. Николаева. Л., Химия, 1972, стр 416.

24. EILS, H. G., JUNEMANN, A.: PROC. 26thEBC, MAASTRICHT, 1967, S367.

25. ANNES, B.J., REED, R.j.r.:J. Inst. Brew.91, 1985, s.456.

26. NOEL, S.,COLLIN, S.:Proc, 25^th EBC, Bressels, 1995, S.483.

27. LERMUSIEAU, G, et al.: I Amer. Soc. Brew. Chem. 57,1999, S.29.

28. WAINWRIGHT, T.: I. Inst. Brew. 79, 173, S.451.

29. COLLIN, S. et al.: Proc. 27^th EBC, Bressels, 1995, s.483.

30. TRESSL, R. Et al.: I Agric. Food Chem. 28, 1978, S.1426.

31. Ван Де Меерше, Блокманс, Деврю А., Маншелейн Образование транс-2-ноненала при фотоокислении гидроксиоктадеценовых кислот // материалы 17-го конгр. Евр. Пивов. конв., 27-41, Берлин,1979.