МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ

Донецький національний університет

кафедра фізичної хімії

Курсова робота за темою:

“Газоволюмометричне дослідження окиснювального старіння пива”

Зміст

Вступ

1. Літературний огляд

1. Фізико-хімічна характеристика об'єкту дослідження

1.2 Хімічні процеси окиснювального старіння пива

1.2.1 Неферментативні процеси окиснення

1.2.2 Ферментативне окиснення

2. Експериментальна частина

2.1 Газоволюмометричний метод

2.2 Хемілюмінесцентний метод

3. Газоволюмометричне дослідження окиснювального старіння пива (обговорення результатів)

Висновки

Використана література

Вступ

Смак та аромат пива є найголовнішими критеріями його якості. Але, як би не був виготовлений цей напій, все одно його органолептичні властивості з часом змінюються [8].

Серед багатьох хімічних процесів, що ведуть до зміни цих властивостей пива, найбільш шкідливими є окиснення його головних компонентів. Пиво “старіє” [7]. Окиснювальні процеси у пиві відбуваються не лише при зберіганні готового напою, а й на всьому шляху його виготовлення [34, 35, 7]. В результаті протікання процесів “старіння” у пиві накопичується великий спектр продуктів окиснення, які по-різному впливають на смак та аромат напою. Але найголовніший внесок у зміну смаку та аромату створюють карбонільні сполуки (карбоніли старіння), що утворюються при окисненні ненасичених жирних кислот, вищих спиртів та інших речовин складу пива [3]. Підвищена небезпека цих речовин криється у низькому поріговому значенні їх смаку та аромату.

Процеси “старіння” у пиві практично неминучі. Єдине, що можна зробити, - вплинути на швидкість їх перебігу, тобто підвищити окислювальну стабільність напою [32]. Питанню антиокислювальної (органолептичної) стабілізації на даний момент приділяється велика увага. Існує багато робіт, де досліджувалися процеси окислення пива. Головними методами дослідження в цих роботах був хемілюмінесцентний та хроматографічний методи, останній з яких дозволяє вивчати кінетику окислювальних процесів за зміною кількості продуктів окислення [3, 39, 40]. Автори цих робіт дійшли до спільного висновку, що головним хімічним методом смакової стабілізації напою є внесення додаткової кількості речовин з антиоксидантними властивостями. Але сказати, що питання антиокислювальної стабілізації пива цілком вирішене, неможливо.

У зв'язку із вищезазначеним метою цієї роботи є встановлення шляхів та механізмів окислювальних процесів, що протікають у пиві, методом газоволюмометрії, який до цього моменту не був використаний у таких дослідженнях, а також порівняння результатів, отриманих цим методом, з результатами інших методів дослідження.

1. Літературний огляд

1.1 Фізико-хімічна характеристика об'єкту дослідження

Пиво, як і будь-який інший природній об'єкт, має дуже складний хімічний склад. Ідо цього моменту це питання є невирішеним. В залежності від сорту пива, технології його виготовлення та використаної сировини змінюється його кількісний та якісний склад. Для більшої зручності, прийнято розділяти всі компоненти пива на головні та мінорні [19].

Головними компонентами пива є вода (91 - 93%), Вуглеводи (1,5 - 4,5%), етиловий спирт (3,4 - 4,5%) та азотовмісні сполуки, які представлені головним чином амінокислотами та полі пептидами (0,2 - 0,65%) [18,24]. Переважна кількість вуглеводів пива (75 - 85%) складається з декстринів. На прості сахара (глюкоза, фруктоза, сахароза) припадає 10 - 15% від загальної кількості вуглеводів. І тільки 2 - 3% вуглеводів представлені складними саварами (полісахариди та ін.). Пиво містить незначну кількість вищих спиртів (50 - 100мг/л), метиловий спирт практично відсутній [12,15].

Мінорні компоненти пива класифікують на мінеральні речовини, вітаміни, органічні кислоти, фенольні сполуки, гірки речовини, ароматичні речовини, біогенні аміни, естрогени [19].

В біологічно значимій кількості в пиві присутні іони калію, кальцію, магнію, фосфору, сірки, хлору [18]. Також присутні іони заліза, міді, цинку та іони інших металів [25]. В пиві багато вітамінів групи В, а саме В₁, В₂ [6,18,26]. Також є вітамін С, який іноді спеціально додають до пива для запобігання процесів окиснення інших компонентів. Майже всі вітаміни присутні в пиві у фосфорельованій формі [6,18,24,26,27,28]. Органічні кислоти представлені в пиві головним чином лимонною, піровиноградною, оцтовою, глюконовою, щавлевою кислотами [29,30].Цим і пояснюється те, що рН готового пива знаходиться в кислій області (рН = 5,1 - 5,4). Загальний вміст фенольних сполук коливається в межах 150 - 300мг/л [6]. Більше за все в пиві міститься антоцианидинів (лейкоцианидини, протоцианидини, лейкоантоцианидини). Всі гіркі речовини пива поділяють на мало- та високо-смолисті. Малосмолисті речовини складаються з б - кислот (гумулони), в - кислот (лупуліни) та інших сполук, які є не ідентифіковані [13,21]. На сьогодні ідентифіковано близько 70 компонентів, віднесених до класу ароматичних сполук пива. Всі ароматичні речовини поділяють на відновлену та окислену фракції. Відновлена фракція включає в себе моно терпени (міріцен) і сескьюітерпени (в-каріофілін, гумулін, фарнісин та ін.). Окислена фракція складається з терпенових спиртів (ліналуол, гераніол), інших спиртів, альдегідів, кетонів, ефірів та їх похідних [10]. З біогенних амінів в пиві були ідентифіковані кадаверин, путресцин, гістамін, тирамін [9]. Естрогени є речовинами що створюють чіткий гормональний вплив на людину. В пиві таких речовин не так багато [24].

Вміст головних та мінорних компонентів пива можна виразити у вигляді таблиці (табл.1.1, 1.2).

Таблиця 1.1 - Вміст головних компонентів пива

	Компонент	Вміст
1	Вода	91-93%
2	Глюкоза, сахароза, фруктоза	2,6-2,9 г/л
3	Полісахариди та фрагменти пектина	0,52-2,08 г/л
4	Етиловий спирт	30 г/л
5	Вищі спирти	50-100 мг/л

Таблиця 1.2 - Вміст мінорних компонентів пива

Клас речовин	Вміст (мг/л)
Мінеральні речовини
2	К	160-450
3	Na	120
4	Ca	80
5	Mg	80
6	P	140
7	S
8	CI
9	Fe	не перевищує 1
10	Cu
11	Zn
Вітаміни
1	В1	0,005-0,15
2	В2	0,3-1,3
3	С	20-50
4	Нікотинова кислота	5-20
5	Фолієва кислота	110
6	В6	0,4-1,7
7	Пантотенова кислота	0,4-1,7
8	Біотин	5
Органічні кислоти
1	Лимонна кислота	130
2	Піровиноградна кислота	60
3	Оцтова кислота	90
4	Глюконова кислота	30
5	Щавлева кислота	15
Фенольні сполуки
1	Антоцианідини	14-77
2	Эллагікова, протокатехінова, ванілінова, саліцилова, п-оксібензойна кислоти	не перевищує 1
3	Фенол, ортокрезол, кумарини	не перевищує 1
4	Катехіни	5-55
5	Эпікатехіни	9-24
6	Рутин	1-6
7	Кверцетин	5-125
8	Хлорогенова кислота	2-20
9	Кверцетрин	1
10	Кофейна кислота	2-20
11	Куінова кислота	1-5
12	Р-кумаринова кислота	1-7
13	Ферулова кислота	2-21
14	Синапиковая кислота	1-20
15	Камферол	5-20
16	Мирицитрин	1
17	Галлієва кислота	5-29
Гірки речовини
1	б-кислоти	-
2	в-кислоти	-
Ароматичні речовини
1	Монотерпени	-
2	Сескьюітерпени	-
Біогенні аміни
1	Кадаверин	1-3
2	Путресцин
3	Гістамін
4	Тирамін

Сусло практично не відрізняться від пива за якісним складом. Але кількісні склади цих субстратів сильно різняться між собою за вмістом головних та деяких мінорних компонентів пива (вуглеводи, етиловий спирт, азотовмісні сполуки, органічні кислоти та ін.). В порівнянні із пивом, сусло містить більше сахарів, амінокислот, поліпептидів, органічних кислот, речовин ліпідної природи. Проте в суслі практично відсутні етиловий спирт, диацетил та інші продукти бродіння. Цією відмінністю і пояснюється різне відношення цих субстратів до окиснювальних процесів.

1.2 Хімічні процеси окиснювального старіння пива

Існує великий об'єм емпіричних та теоретичних знань про процеси старіння пива. Найбільш добре відомий негативний вплив, що створює кисень протягом всієї технології виготовлення напою. Відповідальність за смак, що виникає у пива при його старінні, беруть на себе, в першу чергу, карбонільні сполуки, які у невеликих концентраціях сильно впливають на аромат. При цьому кисень може додатково вплинути на утворення смаку, що виникає при старінні пива в результаті [32]:

- утворення важливих з точки зору старіння речовин, що впливають на аромат пива;

- утворення речовин “попередників” цих речовин;

- зменшення вмісту антиоксидантів, в результаті чого пізніше кисень може призвести до протікання окислювальних реакцій.

До реакцій старіння пива відносяться окиснення вищих спиртів, окислювальний розпад ізогумулонів, реакція Майара та розпад Штреккера, автоокиснення жирних кислот, ферментативний розпад жирних кислот, фотоокиснення жирних кислот, вторинне автоокислення альдегідів та інші процеси.

Велика частина з перелічених вище реакцій ідуть за участю вільних радикалів, утворення яких підсилюється під впливом кисню, і відбувається, у першу чергу, в результаті каталітичних реакцій, що викликаються іонами заліза та міді [3].

На даний момент існує багато методів по підвищенню антиокислювальної здатності пива. Одним із хімічних методів є введення АО та рослинних екстрактів, що містять такі речовини.

Для цього використовують сполуки - солі сірчистої та тіосірчистої кислот, а також б-аскорбінову та ізоаскорбінову кислоти та їх солі [35, 32].

Але використання аскорбінової кислоти, що активно рекламується, як вже встановлено, призводить до утворення дегідроаскорбінової кислоти, присутність якої у пиві у високих кількостях, небажано через негативний вплив на якість напою. У той же час використання у пивоварінні відновлюючих речовин на основі сірки у великих кількостях також небажано через помітне погіршення смаку при зберіганні пива [35]. Широко пропонується використання збалансованої суміші сполук сірки з ерітроборатом натрію [35].

На даний момент часу проведено багато робіт по вивченню АОА рослинних екстрактів. При вивченні АОА екстракту деревини дуба, який використовується для виробництва вина, встановлено, що цей екстракт виявляє високу АОА у суспензіях клітин крові людини. За виявленим ефектом дубовий екстракт суттєво переважає деякі антиоксидантні біологічно активні добавки [37].

Варто підкреслити, що вивчений екстракт приглоблюючи утворення активних форм кисню, запобігає цитотоксичним ефектам вільно радикального окиснення на самих ранніх стадіях.

Виявлення АОА в екстрактах дуба, в біологічних системах, отриманого за ГОСТ Р 51299-99, відкриває перспективу досліджень, що направлені на пошук шляхів його використання у складі харчових продуктів.

Екстракти з трави м'яти, листя підбілу, плодів горобини, трави чебрецю й звіробою, отримані згідно ТУ У 18.483-98, вже тестувалися на пиві. Було встановлено, що їх введення у середині технологічної схеми виготовлення напою не тільки підвищує смакову стабільність готового напою, а також позитивно впливає на збереження гірких речовин хмелю, що в кінцевому результаті покращує смак пива [36].

1.2.1 Неферментативні процеси окиснення

До цього класу можна віднести процеси старіння пива, що йдуть без участі ферментів. Одним із таких процесів є окиснення вищих спиртів. Вони були відкриті на модельних розчинах пива. Меланоідини при окисненні спиртів є окислювачами. Відбувається перенос атому водню гідроксильної групи спирту у карбонільну групу меланоідинів, причому із спирту утворюється відповідний альдегід. Молекулярний кисень не бере участі у цій реакції безпосередньо, але він здатен її прискорювати. Ця реакція інгібується ізогумулонами та поліфенолами. Окислення вищих спиртів у темряві протікає дуже повільно і здатність спиртів вступати в реакцію із збільшенням вуглеводневого радикалу зменшується [3]. Тому при умові правильного зберігання напою таким процесом можна знехтувати.

Окислювальний розпад ізогумулонів також є небезпечним для смаку пива. Такий процес, особливо при підвищених температурах, призводить до суттєвого зменшення гіркоти напою [3].

Було встановлено, що при окислювальному розпаді ізогумулонів утворюються пропан-2-он, 2-метилпропаналь, 3,4-диметил-2-он, а також 2-метил-3-бутил-2ол [3,5]. Меланоідини тут виступають у якості антиокисників [3].

Ще одним неферментативним процесом погіршення якості пива є реакція Майара та розпад Штреккера. У цих процесах утворюються різні б-дикарбонільні сполуки, які в рамках розпаду Штреккера здатні реагувати з амінокислотами. При цьому амінокислота у ході декарбоксилювання переводиться в альдегід, у якому на один атом вуглецю менше:

Цей процес каналізується у темряві за участю слідів іонів металів. На світлі розпад йде швидше, при цьому сприятливим фактором є присутність рібофлавіна, поліфенолів та спиртів [34,3].

Альдегіди, що утворюються в реакції Майара та розпаді Штреккера, не належать до компонентів, що визначають “старіння пива”. Але розпад Штреккера вважається причиною формування хлібного смаку у пиві [4,11,14].

Автоокиснення ненасичених жирних кислот та їхніх ефірів відбувається чи не в кожному жировмісному харчовому продукті. Пиво не є виключенням.

У пиво потрапляє певна кількість жирних кислот із сировини: зерно та хміль.

Ячмінь вміщує близько 2% ліпідів, які представлені як тими, що вміщують, так і тими, що не вміщують гліцерин компонентами, а також вільними жирними кислотами.

Усі жирні кислоти, що входять до складу ліпідів, поділяють на дві групи: насичені, тобто ті, що не містять подвійних зв'язків, та ненасичені - ті, що містять подвійні зв'язки.

В ячменю головним чином містяться ненасичені жирні кислоти. У хмелю вміст ліпідів складає біля 3% сухої речовини, а вільні жирні кислоти - біля 20% його летких компонентів, що є досить значною величиною [34].

Саме ненасичені жирні кислоти та їхні етилові ефіри, що утворилися при бродінні, навіть при незначному потраплянні у пиво несуть у собі загрозу смаку напою. Тільки ненасичені жирні кислоти окиснюються досить швидко, щоб їх можна було вважати речовинами, які обумовлюють смак старого пива [4].

Так, ліноленова кислота окиснюється у 3 -4 рази швидше у порівнянні з лінолевою, а остання, у свою чергу, - у 30 разів швидше масляної кислоти. На модельних розчинах пива було встановлено, що автоокиснення жирних кислот відбувається за радикальним механізмом [5].

При цьому радикал, у більшості випадків радикал пероксиду, відщеплює атом водню від молекули жирної кислоти. Новий радикал, що утворився, реагує з молекулярним триплетним киснем з утворенням радикалу пероксиду, який відщеплює атом водню у наступної молекули жирної кислоти та трансформується у гідро пероксид жирної кислоти [3]. Оскільки лінолева кислота характеризується максимальним вмістом у ячменю в порівнянні з іншими ненасиченими жирними кислотами, тому доцільно роздивлятись автоокиснення на її прикладі.

Загальна схема процесу автоокиснення є такою:

RH + R^'O₂*> R^'OOH + R*

R* + O₂ > RO₂*

RO₂* + RH > ROOH + R*

(RH - лінолева кислота; R^'O2*- пероксирадикал)

У випадку лінолевої кислоти радикал пероксиду атакує в паралельному до подвійного зв'язку положенні молекулу жирної кислоти, найчастіше у одинадцятого атома вуглецю, оскільки тут через можливу резонансну стабілізацію карбону через п'ять атомів вуглецю водень може бути відщеплений легше за все, але атака можлива і на атоми вуглецю 8 та 4, які також знаходяться поряд із подвійним зв'язком. В результаті утворюється ціла серія гідропероксижирних кислот, причому 9 та 13-гідропероксилінолева кислота характеризується найвищою концентрацією [3]. Утворені гідропероксижирні кислоти не є стабільними і тому здатні розщеплюватися. Саме в результаті цього процесу і утворюються карбоніли старіння. Схематично для гідропероксилінолевої кислоти такий розпад може мати вигляд:

Тут зображено б-розщеплення. В залежності від того, розщеплюється молекула за варіантом А чи Б, утворюються різні продукти.

Розщеплення з позиції Б енергетично вигідно. З одного боку утворюється ненасичений альдегід, а з іншого - жирна кислота, що складається з короткого ланцюгу. Радикал гідро пероксиду (ОН*), що утворився, є надзвичайно активним і може відщеплювати водень практично від усіх органічних молекул, оскільки виграш в енергії в результаті утворення зв'язку О-Н у будь-якому випадку більше енергії, яка необхідна на розщеплення зв'язку С-Н.

Іони важких металів створюють каталітичну дію на процеси окиснення. Окрім того, реакції окиснення ненасичених жирних кислот сприяє підвищена температура, низьке значення рН та наявність окисників.

Можна роздивитись утворення радикалів у формі реакцій Фестона та Хабера Вайса на прикладі пероксиду водню.

Реакція Фентона:

Fe²⁺ + H₂O₂ > Fe³⁺ + OH* + OH^?

Fe³⁺ + H₂O₂ > Fe²⁺ + O₂*^? + 2H⁺

Разом: 2H₂O₂ > OH* + OH^? + O₂*^? + 2H⁺

Реакція Хабера-Вайса:

Cu²⁺ + O₂*^?> Cu⁺ + O₂

Cu⁺ + H₂O₂ > Cu²⁺ + OH* + OH^?

Разом: O₂*^? + H₂O₂ > O₂ + OH* + OH^?

Пероксид водню окислює іони заліза (II) до заліза (III), причому утворюється гідроксильний радикал та іон гідроксилу. Далі залізо (III) реагує з наступною молекулою пероксиду водню з утворенням двох протонів і одного супероксидного радикалу. Мідь (II) реагує з су пероксидом з утворенням міді (I) та кисню.

Мідь (I) розщеплює молекулу пероксиду водню на іон гідроксила та гідроксильний радикал. Радикали, що утворилися, є надзвичайно активними та можуть призвести до зародження нових ланцюгів окиснення.

Поряд із автоокисненням ненасичених карбонових кислот іде процес фотоокиснення цих речовин. У фотоокисненні збуджений сенсибілізаторами синглетний кисень реагує не потребуючи каталізаторів. Цей процес майже не залежить від температури. Продуктами цих процесів є гідропероксикислоти та альдегіди, що утворюються при розкладі таких кислот [3].

Ця реакція залежить тільки від кількості кисню в субстраті та від наявності сенсибілізаторів, таких як рибофлавін (вітамін В₂), хлорофіл, похідні порфіріну та інші барвники. Взаємодія із синглетним киснем відбувається набагато швидше реакції з триплетним киснем, тому захисту пива від світла придають велике значення.

Було встановлено в пиві утворення різних насичених, а також однократно та двократно ненасичених альдегідів при фотоокисненні олеїнової та лінолевої кислот [22].

Ненасичені альдегіди, що утворюються при окисненні ненасичених жирних кислот, здатні окиснюватися далі. Так, при вторинному автоокисненні ненасичені альдегіди переводяться у насичені з більш коротким вуглеводневим радикалом. Було встановлено, що, наприклад, з транс-2-ноненалу можуть утворитися пентонал, гексонал, гептанал та октанал [5]. Цим пояснюються повідомлення різних авторів про те, що концентрація транс-2-ноненалу, який утворюється на початку старіння, при глибокому окисненні поступово зменшується [3].

Усі вищеперелічені неферментативні окиснювальні процеси можуть бути зароджені металами змінної валентності. Ці процеси, на даний момент, широко вивчені. Оскільки залізо присутнє майже у всіх природних об'єктах, тому розгляд більш доцільно проводити на прикладі залізо ініційованого окислення. Так, залізо сприяє на стадії зародження ланцюгу за схемою [38]:

У випадку наявності в системі відновників з підходящим редокспотенціалом (аскорбінова кислота та ін.) відбувається регенерація Fe³⁺ до Fe²⁺ за схемою:



Відновлене залізо знову здатне зароджувати ланцюги окиснення.

1.2.2 Ферментативне окиснення

Окиснювальні процеси не починаються в готовому пиві, вони вже відбуваються при виробництві солоду та сусла. Ячмінь містить складну ферментативну систему. Активність цих ферментів сильно зростає при пророщуванні зерна. У цей час відбувається часткове розщеплення ліпідів під дією ліпаз. Дія ліпаз спрямована на складноефірну групу між гліцерином та високомолекулярними жирними кислотами. Утворені вільні карбонові кислоти здатні окиснюватися набагато легше, ніж їхні ефіри. Ферментом, що зумовлює окиснення ліпідів, є ліпоксигеназа. Під дією цього ферменту у присутності кисню повітря ненасичені жирні кислоти (олеїнова, лінолева, ліноленова) перетворюються у гідро пероксиди, які здатні розпадатися на різних стадіях виробництва пива з утворенням карбонілів [3;34].

Так, під дією ліпоксигенази утворюється такий діальдегід, як нонадінал, що відповідає за появу “огіркового” запаху солоду. Оптимальна умова дії ліпоксигенази рН 6,0 та температура 28 - 30⁰С. Під час виготовлення сусла ліпоксигеназа активується і при значній кількості кисню відбувається активне утворення продуктів окиснення жирних кислот.

На стадії бродіння дріжджі відновлюють утворені карбоніли та гідропепекиси у відповідні спирти, які є безпечними для смаку напою. При розпаді гідроксикислот після бродіння утворені карбонільні речовини залишаються у пиві та погіршують його смак. Окрім ферментативних процесів окиснення з безпосередньою участю ферментів, можна виділити процеси, де ініціаторами є метали перемінної валентності (Fe), а ферменти виконують допоміжну роль. Як вже було описано у не ферментативних процесах, залізо ініціює ланцюги окиснення за схемою:

У випадку наявності в системі ферментів, де коферментом є НАДФН₂ іони заліза відновлюються ланцюгом переносу електронів за наступною схемою [41;42]:

Глибина окиснювальних процесів за наведеною схемою буде залежити від кількості ферментів, що здатні відновлювати Fe³⁺ до Fe²⁺.

2. Експериментальна частина

2.1 Газоволюмометричний метод

Одним із простих і розповсюджених методів вивчення кінетики рідиннофазних реакцій окиснення органічних речовин є метод вимірювання кількості поглиненого кисню. Газоволюмометричний метод дозволяє вимірювати швидкість окиснення з великим ступенем точності при малих глибинах перетворення, коли впливом продуктів окиснення на кінетику реакції можна знехтувати.

Існують різні варіанти газоволюмометричних установок, загальний принцип їхньої дії полягає у вимірюванні швидкості поглинання кисню при постійному тиску. Визначення кінетичних параметрів процесу інгібованого окиснення: період індукції, константу швидкості реакції з пероксильними радикалами, коефіцієнт інгібування і ряд інших кінетичних характеристик проводили на установці для автоматичної реєстрації і запису поглинання кисню "Кулон-1" з фотоелектронним датчиком заводу інституту хімічної фізики РАН (рис.2.1).

Установка складається з реакційної судини (1), зануреної в термостатовану ячейку (2), термостатованої газової бюретки (3), електролітичної ячейки з платиновими електродами (електроліт - насичений розчин щавлевої кислоти) (4), регулятора тиску (5), заповненого ундеканом, і манометра (6), фотоелектроннного датчика (8), підсилювача датчика (9), стабілізатора струму (10). Перед початком досліду бюретка, регулятор тиску і реакційна судина з речовиною, що окиснюється, заповнюються до атмосферного тиску киснем. Для проведення окиснення реакційна судина нагрівається до певної температури за допомогою термостата, при безперервному перемішуванні, після двоххвилинного прогріву з'єднується з бюреткою і регулятором тиску. Фотоелектронний датчик через стабілізатор струму з'єднаний з електролітичною ячейкою. Під час реакції кисень з бюретки надходить у реакційну судину, при цьому тиск у системі падає, і в зв'язку з цим включається електролітична ячейка. Газ, що виділився з ячейки, підвищує тиск у термостатованому об'ємі і піднімає рівень ундекану в бюретці, у результаті чого тиск у системі вирівнюється. Швидкість просування меніска ундекана в бюретці пропорційна швидкості реакції.

Рис. 2.1 Схема газоволюмометричної установки: 1 - реакційна судина; 2- термостат; 3 - газова бюретка; 4 - електролітична ячейка; 5 - регулятор тиску; 6 - манометр; 7 - термостатований об'єм; 8 - фотоелектронний датчик; 9 - підсилювач датчика; 10 - стабілізатор струму.

Сила струму на електролізері складала 0.2 А. Установка дозволяє вимірювати швидкість поглинання кисню - від 10^-7-10^-8 моль-л^-1•с^-1 і більше. Об'єм реакційної суміші дорівнює 5 мл, частота перемішування - 8-100 с^-1. Вимірювання проводили в кінетичній області при тиску кисню 1 атм. і температурі 310К.

2.2 Хемілюмінесцентний метод

Одним з методів вивчення кінетики хімічних реакцій може бути вимірювання хемілюмінесценції, тобто світіння, яке супроводжує хімічні процеси. Хемілюмінесценція виникає в екзотермічних елементарних актах реакцій, тому її характеристики закономірно пов'язані з характеристиками реакцій. Детальне вивчення закономірностей хемілюмінесценції в реакціях, які йдуть з участю вільних радикалів, показало, що світіння виникає в елементарних актах рекомбінації вільних радикалів за схемою:

RO₂* + RO₂* > [ROOOOR] > R=O^* + O₂ > R=O + hх

Як видно, світіння виникає при квадратичній рекомбінації пероксирадикалів і його інтенсивність(І) пропорційна швидкості цього процесу:

I = ?₆k₆[RO₂*]²,

де ?6 - квантовий вхід світіння, тобто ймовірність перетворення енергії, що виділилася в результаті рекомбінації радикалів, в енергію кванта світла.

На рис 2.2 приведена схема приладу для вивчення реакцій рідкофазного окиснення за хемілюмінесценцією. Прилад складається з реакційного сосуду 1, який знаходиться у світлонепроникній камері 2 і до якого під'єднана система продувки газу 3, охолодження 4 та термостатування 5, фотопомножувача ФЕУ-6, що захищений кожухом 7, підсилювача постійного струму (У1-7) 8, високовольтного випрямлювача стабілізатора (ВС-22) 9 та автоматичного електронного потенціометра (ЕПП-0,9М) 10. Світіння, яке виникає в процесі окиснення, через світлофільтр 11 спрямовується на зовнішній торець світлопроводу 12, а далі потрапляє на фотопримножувач, де світловий сигнал перетворюється у постійний струм, який через виносний каскад електрометричного помножувача потрапляє в електрометричний підсилювач 8 та реєструється за допомогою автоматичного потенціометра 10. Більш детально прилад описується в роботі [43].

Рис. 2.2 Схема хемілюмінесцентної установки: 1-реакційний сосуд; 2-світлонепроникна камера; 3-продувка газом в реакційний сосуд; 4-оборотній холодильник; 5-вводи термостату; 6-фотопомножувач; 7- кожух фотопомножувача; 8- підсилювач постійного струму; 9-високовольтний стабілізатор; 10-електронний потенціометр; 11-світлофільтр; 12-світлопровод; 13-виносний каскад електрометричного підсилювача.

3. Газоволюмометричне дослідження окиснювального старіння пива (обговорення результатів)

Пиво здатне старіти, в результаті протікання в ньому різноманітних окиснювальних процесів. Оскільки відомо, що окиснення головних компонентів напою йде за участю вільних радикалів, це дало змогу застосувати для вивчення цих процесів хемілюмінесцентного (ХЛ) методу, який засновано на вимірюванні інтенсивності світіння, що виникає при рекомбінації радикалів, утворених в результаті окиснення.

У попередній роботі досліджена хемілюмінесценція пива при його окисненні в присутності ініціатору радикальних процесів (Na₂S₂O₈) при підвищеній температурі. Це дозволило зробити певні висновки щодо природи та механізму процесів старіння, що протікають в досліджуваній системі.

У продовженні вивчення процесів старіння пива був апробований для цих цілей метод газоволюмометрії (ГВ). Метод дозволяє фіксувати кількість поглиненого кисню субстратом, що досліджується (пиво, сусло чи модельна суміш окремих компонентів напою). Застосування методу газоволюмометрії потребувало спеціальної підготовки проби пива чи сусла. Перед дослідом із досліджуваних відганялися легколетючі компоненти під вакуумом (СО₂; спирт; диметилсульфід; ацетальдегід та ін.). Для можливості співставлення результатів, отриманих газоволюмометричним методом із результатами хемілюмінесцентних досліджень, які були проведені раніше, в цій роботі серію експериментів проводили в умовах ідентичних доумов хемілюмінесцентних дослідів (70⁰С; 7% Na₂S₂O₈; аліквота пива 5 мл.). Кінетична крива окиснення пива, отримана методом хемілюмінесценції у вищезазначених умовах має вигляд, представлений на рис.3.1



На кривій чітко спостерігається два максимуми (h₁; h₂) різної інтенсивності. Другий максимум з'являється через певний проміжок часу - період індукції (ф). Інтенсивність світіння в періоді індукції значно менша і характеризується величиною h₃. При дослідженні окислювальних процесів в такому ж зразку пива газоволюмометричним методом була встановлена кінетика поглинання кисню, представлена кривою на рис.3.2.

Попередньо було встановлено, що зразок пива в створених умовах без додавання персульфату натрію кисню не поглинає. Такий вигляд газоволюмометричної кривої додатково свідчить про протікання процесів за участю кисню. Слід підкреслити, що на газоволюмометричній кривій є період індукції повільного окиснення, який відповідає періоду індукції отриманому хемілюмінесцентним методом. Така відповідність результатів свідчить про те, що ХЛ- світіння обумовлене окиснювальними процесами за участю кисню, а величина ф характеризує стабільність пива до процесів окиснення. Наявність світіння (h₃) на ХЛ кривій у періоді індукції говорить про незначний перебіг в цей час окиснювальних процесів. Це досить вдало корелюється з тим фактом, що на газоволюмометричній кривій в періоді індукції також спостерігається поглинання кисню.

Додавання антиоксидантів або екстрактів, що містять такі речовини, у випадку ХЛ метода дослідження призводило до збільшення періоду індукції (ф). Аналогічний ефект спостерігається в газоволюмометричних дослідах, що можна побачити з рис.3.3:

Виявлена антиоксидантна активність екстракту деревини дуба узгоджується з літературними даними, щодо наявності в ньому речовин з антиоксидантними властивостями[36;37].

Було проведено серію аналогічних дослідів з суслом. Вони показали, що хемілюмінесцені та газоволюмометричні криві ідентичні по вигляду з кривими для пива. Це свідчить про головний внесок в окиснювальні процеси пива компонентів сусла (ненасичені карбонові кислоти, білки, вільні амінокислоти, вищі спирти та ін.). У зв'язку із цим можна вважати доцільним вивчати процеси окиснення (старіння) пива на прикладі сусла.

Було встановлено, що кінетичні криві окиснення сусла (охмеленого та неохмеленого), та газоволюмометрична крива окислення пива, яке було виготовлене з досліджуваного сусла, мають однаковий характер (рис.3.4).

Отримані результати свідчать, щодо більш повільного окислення охмеленого сусла в порівнянні з неохмеленим. Це цілком логічно пояснюється головною відмінністю цих двох субстратів. Охмелене сусло містить певну кількість речовин з антиоксидантними властивостями (феноли хмелю). Ці речовини здатні уповільнювати окислення. Неохмелене сусло містить таких речовин значно менше, і тому легше піддається окисленню. Період індукції окислення для пива, в порівнянні із суслом, є значно вищим. Аналогічні результати були отримані і хемілюмінесцентним методом. Встановлено, що хемілюмінесцентні криві окислення пива та сусла також різняться за періодами індукції (рис.3.5).

Таку суттєву різницю у періодах індукції між суслом та пивом можна пояснити тим, що сусло містить достатню кількість речовин проокиснювальної природи (гідро перекиси та ін.). Ці речовини з'являються в суслі в процесі його виготовлення в результаті термічних навантажень (варка сусла та кип'ятіння з хмелем). Також накопиченню цих речовин сприяє вільний доступ кисню до сусла. Пиво, на відміну від сусла, пройшло процеси бродіння. Дріжджі, які при цьому використовуються, мають ярко виражені відновлюючи властивості. За рахунок такого впливу дріжджів відбувається відновленні речовин проокинювальної природи до продуктів, що є безпечними для антиокиснювальної стійкості напою. Окрім цього, пиво в результаті надтонкого фільтрування містить значно меншу кількість речовин білкової природи та ліпідів, які здатні легко окиснюватися і тим самим спровоковувати окиснення інших компонентів.

Варто відмітити, що як у випадку газоволюмометричного методу дослідження, так і у випадку хемілюмінесценції, було встановлено, що криві окиснення охмеленого та неохмеленого сусла відрізняються на незначну величину. Це пояснюється тим, що при виготовленні сусла даного виробника (ЗАО “Сармат”) був використаний не безпосередньо хміль, а СО₂ - екстракт хмелю. Такий екстракт містить достатню кількість гірких та ароматичних речовин хмелю, проте вміст речовин фенольної природи в ньому зовсім невеликий. Цей факт широко описується в літературі [36]. Додатково це було встановлено у минулій роботі спектрофотометричним методом при вимірюванні окиснювально-відновлювальної здатності пива та пива з додаванням такого екстракту.

Порівняння газоволюмометричних та хемілюмінесцентних кривих окиснення пива та сусла дає змогу зробити висновок, що контроль за вмістом речовин анти- та проокиснювальної природи в пиві на кожному етапі його виготовлення (особливо на стадії виготовлення сусла) є важливим для отримання напою з високими антиокиснювальними можливостями.

Наступним етапом роботи було вивчення здатності компонентів пива до ферментативного окиснення газоволюмометричним методом. У якості досліджуваного субстрату використовувалося виключно сусло. Можливість процесів ферментативного окиснення встановлювалася в умовах залізо ініційованого окиснення. Залізо (II) сприяє зародженню ланцюгів за схемою [38]:

У випадку наявності в системі ферментів, де коферментом є НАДФН₂, відбувається відновлення іонів Fe³⁺ до Fe²⁺. Це призводить до нового зародження ланцюгів окиснення під дією Fe²⁺. Глибина перебігу таких реакцій залежить від наявної кількості ферментів, що здатні відновити Fe³⁺ до Fe²⁺.

Досліди проводили при температурі 37⁰С та С(Fe²⁺) = 5 •10^-3 моль/л. Заздалегідь було встановлено, що в аналогічних умовах розчин заліза (II) в концентрації 5 •10^-3 моль/л у фосфатному буфері кисню не поглинає.

Газоволюмометричні криві поглинання кисню охмеленим та неохмеленим суслом у присутності Fe²⁺ мають вигляд, наведений на рис. 3.6.

Отримані результати свідчать щодо наявності процесів ферментативного окиснення компонентів сусла. Більшість ферментів, як відомо, є активними в інтервалі температур 20 - 40⁰С. Для остаточного доказу протікання ферментативного окиснення компонентів сусла, було проведено експеримент при 50⁰С та незмінних інших параметрах. Кінетична крива поглинання кисню в цих умовах представлена на рис. 3.7.

У порівнянні з аналогічним дослідом при температурі 37⁰С швидкість поглинання кисню при 50⁰С зменшилася. Це означає, що підвищення температури пригнічує ферментативне окиснення в результаті дезактивації ферментів, що здатні відновлювати Fe³⁺ до Fe²⁺. Поглинання кисню (рис. 3.7 кр. 2) при дезактивації ферментів можна пояснити одночасним протіканням як ферментативного, так і не ферментативного окиснення, ініційованих Fe²⁺.

Для перебігу реакцій не ферментативного окиснення компонентів пива необхідні речовини неферментної природи з підходящим редокспотенціалом (аскорбінова к-та) для відновлення Fe³⁺ до Fe²⁺. Глибина цих процесів, як і у випадку ферментативного окиснення, залежить від кількості таких речовин.

Для перевірки впливу цих речовин на кінетику окиснення сусла було проведено дослід на можливість протікання аскорбатзалежного окиснення.



Отримані результати (рис. 3.8) доводять можливість протікання реакцій відновлення Fe³⁺ до Fe²⁺ аскорбіновою кислотою, що призвело до більш глибокого окиснення сусла. Аналіз результатів показав, що такі відновники як аскорбінова кислота здійснюють подвійну роль. З одного боку, вони здатні регенерувати Fe³⁺ до Fe²⁺ і, таким чином, підтримувати реакції окиснення. З іншого, якщо концентрація у пиві заліза не перевищує ПДК (ПДК_Fe=1 мг/л), аскорбінова кислота здатна діяти як синергісти натуральних антиоксидантів. Це додатково говорить щодо важливості контролю за вмістом у пиві та суслі речовин, що є ініціаторами окиснювальних процесів (кисень, метали змінної валентності, перекиси та ін.)

Для встановлення механізму, за яким іде окиснення компонентів сусла, проводились досліди по вивченню впливу антиоксидантів радикально-ланцюгових процесів (іонол) на кінетику старіння даного субстрату. Результати представлені на рис. 3.9.

Отримані результати свідчать, що іонол уповільнює окислення сусла. Це означає, що залізоініційоване окиснення компонентів сусла за участю ферментів йде за радикально-ланцюговим механізмом. Також встановлювалася можливість впливу антиоксидантів на аскорбатзалежне окиснення сусла. Результати цих спостережень зображені на рис. 3.10.

Вище приведені залежності (рис. 3.10) свідчать про те, що і аскорбатзалежне залізо ініційоване окиснення є радикально-ланцюговим процесом.

Наступним етапом було встановлення компонентів сусла, що підлягають у зазначених умовах окисненню. Для цього дослідження проводили на модельних сумішах компонентів сусла (розчини у фосфатному буфері з рН=5,4). Головними компонентами сусла (пива), що здатні легко окиснюватися є ліпіди, речовини білкової природи, амінокислоти та ін. При встановленні відношення таких речовин до окиснення при температурі 37⁰С (С(Fe²⁺)= 5 •10^-3 моль/л) було встановлене наступне:

- сахара (глюкоза, фруктоза, сахароза) не поглинають кисню в заданих умовах;

- вільні амінокислоти (фенілаланін, цистеїн, гліцин) в концентраціях, у яких вони наявні в суслі та пиві, дуже слабо поглинають кисень;

- ненасичені карбонові кислоти (лінолева кислота) в концентраціях, наявних в суслі, поглинають кисень з великою швидкістю.

Криві поглинання кисню суслом та модельною сумішшю лінолевої кислоти у фосфатному буфері зображені на рис. 3.11

На газоволюмометричній кривій модельного розчину лінолевої кислоти є період індукції. Крива поглинання кисню суслом такого періоду не має. Відмінність можна пояснити тим, що на початкових стадіях окиснення розчину лінолевої кислоти відбувається накопичення пероксидів (первинних продуктів окислення), які в результаті розпаду, автоматично прискорюють окиснювальні процеси. В суслі такі речовини є, тому воно окиснюється без періоду індукції. Варто відмітити, що після періоду індукції газоволюмометрична крива розчину кислоти виходить приблизно на один рівень з газоволюмометричною кривою сусла. Це означає, що головний внесок у процеси окиснення сусла та пива вносять саме ненасичені карбонові кислоти.

Проведені досліди дозволили остаточно встановити, що процеси окиснювального старіння пива йдуть за радикально-ланцюговим механізмом. Це дозволило визначити шляхи гальмування таких процесів інгібіторами окиснення з метою антиокиснювальної стабілізації напою.

Наявність ферментативного окиснення компонентів сусла, яке іде також за радикально-ланцюговим механізмом, дозволяє сподіватися, що ефективними можуть бути класичні антиоксиданти фенольної природи.

Газоволюмометричне дослідження процесів окиснення сусла з урахуванням результатів отриманих у попередній роботі хемілюмінесцентним методом, дозволило остаточно ідентифікувати речовини, які відповідальні за прискорення процесів старіння пива (гідроперекиси, метали змінної валентності, кисень, підвищений рівень ненасичених жирних кислот). Це дає змогу зробити висновок, що при мінімізації таких речовин в суслі та пиві, та при збільшенні кількості речовин, які мають виражену антиокиснювальну активність, буде отриманий напій, стійкий до процесів старіння.

Висновки

1. Застосовано газоволюмометричний метод для дослідження процесів окиснення сусла та пива. Співставлень отримані результати з попередніми результатами, отриманими хемілюмінесцентним методом.

2. Встановлена можливість перебігу залізоініційованого ферментативного і неферментативного окиснення компонентів сусла (пива).

3. Доведено, що процеси окиснення пива та сусла перебігають за радикально-ланцюговим механізмом.

4. Підтверджено, що головний вклад у процеси окиснення пива і сусла вносять ненасичені жирні кислоти.

5. Для гальмування небажаних окиснювальних перетворень компонентів сусла і пива необхідно зменшувати кількість речовин-ініціаторів окиснення (залізо, перекиси, ненасичені жирні кислоти і т. ін.) та збільшувати концентрацію антиоксидантів (природні феноли).

Використана література

1. Химический состав пищевых продуктов / Под ред. М.Ф. Нестерина // М.: Пищевая промышленность, 1979 -250С.

2. Иванова Е. Г. Изменение липидов в процессе пивоварения и их влияние на вкусовую стабильность пива // Пиво и напитки.- 2003.- №3.- С.12-13.

3. К. Вакербауэр, Р. Хардт Реакция с радикалами и стабильность вкуса пива// Brauwelt Мир пива.- 1997.- №.- 4.-С.38-42.

4. Мейльгард М. Затхлый вкус пива, вызванный карбонилами// Дайджест Brew. Dig. 47,1972.- С.52,54,56,57,62.

5. Хашимото Н.Кураиво Пути образования летучих альдегидов во время хранения бутылочного пива// Научно-исследовательский отчет лаборатории фирмы Kirin Brew, 18,1- 11,1975.

6. HASHIMOTO,N.:Rep.Rs.La6.Com. 31, 1988, S. 99.

7. Кунце В. Правильное пиво - как его сварить? // Пиво и напитки.- 2001.- №2.

8. С. Горал Новое направление в стабилизации пива// Brauwelt Мир пива.- 1999.- №5.- С.27.

9. BASAROVA, G.: Brauwissenschaft 27.1974, S.244.

10. MARZISS, L. MEHLTRETTER, A.: Brauwissenschaft 24. 1971, S. 273.

11. Блокманс, Машелен, Деврю А.: Источники определенных соеденений карбонилов, образующихся в результате старения пива // Материалы 17-го конгр. Евр. пивов. конв., 279 - 291, Берлин 1979.

12. DROST, B. W. etal.: I. Amer. Soc. Brew. Chem. 48, S.124.

13. BAMFORT, C. W., MULLER, R. E., WALKER, M. D.: I. Amer. Brew. Soc. Chem. 51, 1993, S. 79.

14. Машелен Роль фотохимических реакций для устойчивости вкуса пива // Cerevisia 5, 107, 110, 1980.

15. HASHIMOTO, N., ESHIMA, T.: I Amer. Soc. Brew. Chem. 35, 1977, S.145.

16. Косса Т., Барри Д., Трессль Р. Ароматические вещества солода и их вклад в аромат пива // Mschr. Brauerei 32, 249 - 252, 254, 1974.

17. Стенрооз Л., Уонг П., Зиберт К. Источники образования 2-ноненала в нагретом пиве // MBAA Techn. Qart 13. 227-232, 1976.

18. BELDEROK, B.: I. Inst. Brew. 74, 1968, S 333.

19. AMAHA, M., HORIUCHI, T.: Soc. Brew. Japan 74, 1971, S 273.

20. Эстербауэр Х., Шауэнштайн Е. Изомеры тригидроксиоктадеценовых кислот в пиве: доказательство их существования и их количественное определение // Lebensm. Unters. Foorsch. 164, 255-259, 1977.

21. NARZISS, L., MEHLTRETTER, A.: Drauwissenschaft 24, 1971, S.273.

22. Тресль Р., Барри Д. Образование альдегидов в результате окисления липидов и их значение как компонентов, нарушающих вкус пива // Материалы 19-го конгр. Евр. повов. Конв., 525-532, Лондон 1983.

23. Торопцева А.М., Белгородская К.В., Бондаренко В.М. Лабораторный практикум по химии и технологии высокомолекулярных соеденений // Под. ред. проф. А.Ф. Николаева. Л., Химия, 1972, стр 416.

24. EILS, H. G., JUNEMANN, A.: PROC. 26thEBC, MAASTRICHT, 1967, S367.

25. ANNES, B.J., REED, R.j.r.:J. Inst. Brew.91, 1985, s.456.

26. NOEL, S.,COLLIN, S.:Proc, 25^th EBC, Bressels, 1995, S.483.

27. LERMUSIEAU, G, et al.: I Amer. Soc. Brew. Chem. 57,1999, S.29.

28. WAINWRIGHT, T.: I. Inst. Brew. 79, 173, S.451.

29. COLLIN, S. et al.: Proc. 27^th EBC, Bressels, 1995, s.483.

30. TRESSL, R. Et al.: I Agric. Food Chem. 28, 1978, S.1426.

31. Ван Де Меерше, Блокманс, Деврю А., Маншелейн Образование транс-2-ноненала при фотоокислении гидроксиоктадеценовых кислот // Материалы 17-го конгр. Евр. Пивов. конв., 27-41, Берлин,1979.

32. Тим О'Рурк Роль кислорода в пивоварении // Пиво и напитки - 2003. - №2, С. 24 - 26.

33. Влияние кислорода на стабильность вкуса на разных стадиях производства пива // Brauwelt Мир пива - 2001.- №4, С. 40 - 41.

34. Иванова Е.Г. Изменение липидов в процессе пивоварения и их влияние на вкусовую стабильность пива // Пиво и напитки - 2003.- №3, С. 12 - 14.

35. Иванова Е.Г., Киселева Л.В., Ленец Н.Г. Антиоксиданты для улучшения вкуса и стабильности пива // Пиво и напитки - 2004.- №2, С. 25.

36. Напій вищої проби // Харчова і переробна промисловість - 2002.- №4, С. 22 - 23.

37. Бушина И.А. Изучение антиоксидантной активности экстракта дубового // Хранение и переработка сельхозсырья - 2003.- №11, С. 60 - 62.

38. Владимиров Ю.А., Аргаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах // М.: Наука, 1972.- 252с.

39. Рыбакова Е.В. Ионная хроматография универсальная методика для анализа пива // Пиво и напитки - 2004.- №2, С. 42 - 43.

40. Савчук С.А., Кобелев К.В. Применение новых хроматографических методов в исследовании пива // Пиво и напитки - 2003.- №1, С. 15 - 20.

41. Барабой В.А., Сутковой Д.А. Окислительно - антиоксидантный гомеостаз в норме и патологии // К.: Чернобыльинформ, 1997.- Т.1. - 204 с.

42. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия // М.: Медецина, 1983. - 752с.

43. Шляпинтох В.Я., Карпухина О.Н., Постников Л.М. Хемилюминесцентные методы исследования медленных химических процессов // М.: Наука, 1966.- 300с.