Бумажная и тонкослойная хроматография

Бумажная и тонкослойная хроматография

Содержание

История хроматографии

Физико-химические основы тонкослойной хроматографии

Распределительная хроматография на бумаге

Тонкослойная хроматография

Сорбенты

Растворители

Подготовка пластин

Техника нанесения исследуемых растворов

Хроматографирование

Восходящая тонкослойная хроматография

Нисходящая тонкослойная хроматография

Горизонтальная тонкослойная хроматография

Радиальная тонкослойная хроматография

Сушка пластин

Идентификация разделенных веществ

Физические методы идентификации

Значение Rf

Цветные реакции

Сравнение со свидетелем

Физико-химические методы идентификации

Список использованной литературы

История хроматографии

Открыл хроматографию русский ученый, Михаил Семенович Цвет. Он родился 14 мая 1872 г. в небольшом итальянском городе Асти. Его мать - итальянка, отец - уроженец Чернигова, видный государственный служащий. Цвет окончил Женевский университет, в котором получил степень доктора ботаники (1896). После приезда в Россию, Цвету пришлось заново защитить сначала магистерскую диссертацию (1902), а затем и докторскую (1910). Значительную часть своей жизни (1903 - 1916) Цвет провел в Варшаве, а последующие годы (1916 - 1918) - в Москве, Нижнем Новгороде, Тарту. Умер он в Воронеже в 1919 г.

Открытие хроматографии относится к периоду между 1900 и 1903 годами. Исследуя пигменты растений, Цвет пропустил раствор смеси очень мало различающихся по цвету пигментов через трубку, заполненную адсорбентом - порошкообразным карбонатом кальция, и промыл затем .адсорбент чистым элюентом. Отдельные компоненты смеси при этом разделились с образованием цветных полос. Разделение Цвет проводил в колонке, показанной на рисунке 1. Смесь веществ А, Б и В - природных пигментов, первоначально находящихся в зоне е, - разделяется.

Рис. 1.

Хроматографическое разделение пигментов хлорофилла М.C. Цветом:

а - адсорбент;

б - колонка;

в - приемник;

г - делительная воронка;

д - вата.

Смесь веществ А, Б и В, сначала находящихся в зоне е, разделяется при элюировании растворителем элюентом Д на отдельные зоны, движущиеся с разными скоростями к выходу из колонки.

Основные итоги исследований по развитию созданного им варианта хроматографии Цвет изложил в книге “Хромофиллы в растительном и животном мире” (1910).

Цвет разработал аппаратуру для жидкостной хроматографии, впервые осуществил хроматографические процессы при пониженном давлении и при некотором избыточном давлении, разработал рекомендации по приготовлению эффективных колонок. Термин «хроматография» также был предложен М.С. Цветом в 1906 г. Он образовал его из двух греческих слов «цвет» и «писать».

В 1931 г. Р. Куну (Германия), А. Винтерштейну (Германия) и Э. Ледереру (Франция), работавшим в химической лаборатории Института императора Вильгельма по медицинским исследованиям в Гейдельберге, удалось выделить этим методом a- и b-каротин из сырого каротина и тем самым продемонстрировать ценность открытия Цвета .

Важным этапом в развитии хроматографии стало открытие советскими учеными Н.А. Измайловым и М.С. Шрайбер метода хроматографии в тонком слое (1938), позволяющего проводить анализ с микроколичеством вещества .

В 1940 году А. Мартином и Р. Сингом (Англия) был открыт вариант жидкостной распределительной хроматографии на примере разделения ацетильных производных аминокислот на колонке, заполненной силикагелем, насыщенным водой, с использованием хлороформа в качестве растворителя . Далее Мартин и А. Джеймс осуществили вариант газовой распределительной хроматографии, разделив смеси на смешанном сорбенте из силикона и стеариновой кислоты (1952 - 1953).

Заметный вклад в развитие хроматографического метода внес Г. Шваб (Германия), явившийся основателем ионообменной хроматографии (1937 - 1940). Исключительное значение имело создание в 1956 году М. Голеем (США) капиллярного варианта хроматографии , при котором сорбент наносится на внутренние стенки капиллярной трубки, что позволяет анализировать микроколичества многокомпонентных смесей .

В конце 60-х гг. резко возрос интерес к жидкостной хроматографии. Появилась высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ).

Физико-химические основы тонкослойной хроматографии

Основой тонкослойной хроматографии является адсорбционный метод, хотя также встречается метод распределительной хроматографии.

Адсорбционный метод основан на различии степени сорбции-десорбции разделяемых компонентов на неподвижной фазе. Адсорбция осуществляется за счет ван-дер-вальсовских сил, являющейся основой физической адсорбции, полимолекулярной и хемосорбцией. Для эффективных процессов сорбции-десорбции необходима большая площадь, что предъявляет определенные требования к адсорбенту. При большой поверхности разделения фаз происходит быстрое установление равновесия между фазами компонентов смеси и эффективное разделение. Впервые метод тонкослойной хроматографии заявил о себе как "Бумажная тонкослойная хроматография", которая основывалась на распределительном методе разделения компонентов.

Тонкослойная хроматография

В этом методе хроматографирование веществ происходит в тонком слое сорбента, нанесенного на твердую плоскую подложку. Разделение в этом методе в основном происходит на основе сорбции-десорбции.

Использование различных сорбентов, позволило значительно расширить и улучшить этот метод.

Современная хроматографическая пластинка представляет собой основу из стекла, алюминия или полимера (например политерефталат). В связи с тем, что стеклянная основа становится менее популярной (часто бьется, нельзя разделить пластинку на несколько частей не повредив слой сорбента, тяжелая по весу), наибольшее распространение получили пластины, в качестве основ которых используют алюминиевую фольгу или полимеры.

Для закрепления сорбента применяют гипс, крахмал, силиказоль и др., которые удерживают зерна сорбента на подложке. Чем меньше диаметр зерен сорбента, тем качественнее (идентификаци дороже) пластинка. Толщина слоя может быть различна (100 и более мкм), но самый важный критерий - слой должен быть равномерный по толщине в любом месте хроматографической пластинки.

Распределительная хроматография на бумаге

В связи с тем, что используемая в этом методе хроматографическая бумага содержат в порах воду (20-22%), в качестве другой фазы используются органические растворители.

Использование хроматографии на бумаге имеет ряд существенных недостатков: зависимость процесса разделения от состава и свойств бумаги, изменение содержания воды в порах бумаги при изменении условий хранения, очень низкая скорость хроматографирования (до нескольких суток), низкая воспроизводимость результатов.

Сорбенты

Силикагель - гидратированная окись кремния, образующаяся при действии минеральных кислот на силикат натрия и сушкой образовавшегося золя. После размалывания золя используют фракцию определенной зернистости (указанную на пластинке, обычно 5-20 мкм).Силикагель является полярным сорбентом, у которого в качестве активных центров служит группы -ОН. Он легко сорбирует на поверхности воду и образует водородные связи.

Окись алюминия. Окись алюминия является слабо основным адсорбентом и используется в основном для разделения соединений слабоосновного и нейтрального характера. Недостатком пластин на окиси алюминия является обязательная активация поверхности перед использованием в сушильном шкафу при высокой температуре (100-150 ⁰С) и низкая, по сравнению с силикагелем адсорбционная емкость слоя.

Кизельгур - адсорбент, полученный из природных минералов: диатомовых земель. Сорбент обладает гидрофильными свойствами, но более низкой адсорбционной емкостью слоя по сравнению с силикагелем.

Кремнекислый магний менее полярный чем силикагель и обычно используется в случаях, когда более полярные адсорбенты не дали эффективного разделения.

Целлюлоза - тонкослойные пластины с нанесенной целлюлозой очень эффективны для разделения сложных органических молекул. Адсорбент представляет собой в основном шарики целлюлозы диаметром до50 мкм, закрепленные на носителе крахмалом. Но как и в бумажной хроматографии, подъем фронта растворителя происходит очень медленно.

В ионообменных хроматографических пластинках в качестве адсорбента используют ионообменные смолы, содержащие четвертичный аммоний или активные сульфогруппы, участвующие в ионном обмене. Тонкослойная хроматография с такого типа пластинками, проводится с подвижными фазами содержащими сильные кислоты или щелочи. Данные пластинки эффективны для разделения высокомолекулярных и амфотерных соединений. Помимо вышеперечисленных существуют множество веществ, используемых как сорбенты.

Растворители

В тонкослойной хроматографии, в качестве подвижной фазы используют либо чистые вещества либо смеси веществ в определенном соотношении.

Подбор подвижной фазы (системы) проводится по следующим правилам:

· Выбирают такую систему, в которой разделяемые компоненты имеют небольшую растворимость (если растворимость вещества высокая, то вещества будут перемещаться с фронтом, при низкой растворимости - оставаться на старте). При распределительной хроматографии или при использовании обращенных фаз, растворимость веществ должна быть выше в подвижной фазе, чем в неподвижной.

· Состав системы должен быть постоянным и легко воспроизводимым.

· Растворитель или компоненты системы не должны быть ядовитыми или дефицитными.

· Система должна полностью разделять вещества близкого строения, причем различия в Rf должно быть не менее 0,05.

· Система не должна вызывать химические изменения разделяемых компонентов.

· В выбранной системе анализируемые вещества должны иметь различные значения Rf и распределяться по всей длине хроматограммы. Желательно, чтобы значения Rf лежало в пределах 0,05-0,85.

· При выборе системы также необходимо учитывать природу разделяемых веществ.

Чем сильнее растворитель сорбируется на сорбенте, тем дальше продвинутся вперед компоненты исследуемой смеси.

Для вытеснения (элюирования) веществ смеси, удерживаемых сорбентом, должен применяться растворитель, адсорбирующийся прочнее, чем эти вещества.

Элюотропный ряд растворителей.

Техника нанесения исследуемых растворов

Как оказывается, нанесение исследуемого вещества не такая сложная операция, но вместе с тем, она очень влияет на получаемые результаты хроматографирования.

Поэтому необходимо всегда помнить ряд моментов, серьезно влияющие на результаты разделения.

Наиболее важным является концентрация наносимых веществ. В ТСХ принято наносить концентрации растворов около 1%. Но с другой стороны чувствительность метода позволяет определять вещества с гораздо меньшими концентрациями.

Так при правильно подобранной концентрации форма разделенных веществ такая же, как и форма нанесенной на линии старта. Если разделенные пятна имеют большие размеры, чем пятно на старте, то нанесенная концентрация слишком велика. Появление "хвостов", неправильная форма разделенных пятен на пластинке тоже может говорить о высокой концентрации, но может быть вызвана неправильно подобранной хроматографической системой, либо химическим взаимодействием разделяемых компонентов.

Подбором количества нанесенного вещества и системы растворителей можно добиться полного разделения на одной пластинке до десяти компонентов в исследуемых веществах. Нанесение пятен проводят на "линии старта" 1-2 см от нижнего края пластинки. Это необходимо для того, чтобы при опускании пластинки в систему не происходило растворение в ней образцов, а все нанесенное вещество подверглось хроматографированию.

Нанесение растворов проводят либо микрошприцом, либо отградуированными капиллярами. Размер наносимого пятна не должен превышать 4 мм. Это связано с тем, что при большем размере пятна, происходит изменение формы под действием физических сил, да и границы разделенных компонентов могут перекрываться.

Нанесение на пластины исследуемых веществ не должны сопровождаться разрушением сорбента (что довольно сильно влияет на качество разделения), поэтому капля должна наноситься касанием иглы или капилляра о слой сорбента, а не надавливанием. Расстояние между наносимыми пятнами должно быть около 2 см.

Иногда при хроматографировании на пластинках наблюдается краевой эффект, в результате чего пятна располагаются не на одной линии а имеют вид подковы, либо по диагонали. Для устранения этого эффекта каждое пятно можно "снабдить" своей дорожкой, отделив нанесенный образец от других путем удаления линии сорбента. Это лучше всего делать под линейку острым предметом но осторожно, чтобы не удалить слишком много сорбента.

После нанесения исследуемых веществ на пластинку, необходимо добиться полного удаления растворителей, так как даже небольшое содержание растворителя в исследуемом веществе может повлиять на разделение и даже изменить состав хроматографической системы.

Удаление растворителей обычно проводят естественной сушкой пластин 5-10 мин.

Виды ТСХ

· Восходящая тонкослойная хроматография

· Нисходящая тонкослойная хроматография

· Горизонтальная тонкослойная хроматография

· Радиальная тонкослойная хроматография.

Восходящая тонкослойная хроматография

Этот вид хроматографии наиболее распространен и основан на том, что фронт хроматографической системы поднимается по пластинке под действием капиллярных сил. Для этого метода используется наиболее простое оборудование, так как в качестве хроматографической камеры можно использовать любую емкость с плоским дном и плотно закрывающейся крышкой, в которую свободно помещается хроматографическая пластинка.

Метод восходящей тонкослойной хроматографии имеет ряд своих недостатков. Например, скорость поднятия фронта по пластинке происходит неравномерно, т.е. в нижней части она самая высокая, а по мере поднятия фронта уменьшается. Это связано с тем, что в верхней части камеры насыщенность парами растворителя меньше, поэтому растворитель с хроматографической пластинки испаряется интенсивнее, следовательно уменьшается его концентрация и скорость движения замедляется. Для устранения этого недостатка по стенкам хроматографической камеры до начала хроматографирования прикрепляют полоски фильтровальной бумаги, по которым поднимающаяся хроматографическая система насыщает парами камеру по всему объему.

Недостатком также можно считать необходимость следить за фронтом растворителя, так как возможно "убегание" лини фронта растворителя до верхнего края. В таком случае определить значение Rf уже невозможно.

Радиальная тонкослойная хроматография

Радиальная тонкослойная хроматография заключается в том, что в центр пластинки наносится исследуемое вещество и туда же подается система, которая движется от центра к краю пластинки.

Нисходящая тонкослойная хроматография

Этот метод хроматографии основан на том, что фронт хроматографической системы опускается по пластинке в основном под действием сил тяжести , т.е. фронт подвижной фазы движется сверху вниз.Для этого метода в верхней части хроматографической камеры крепится кювета с хроматографической системой из которой с помощью фитиля на хроматографическую пластинку поступает растворитель, который стекает, и происходит хроматографирование исследуемого образца.

К недостаткам этого метода можно отнести усложнение оборудования. Этот метод используется в основном в бумажной хроматографии.

Горизонтальная тонкослойная хроматография

Этот метод наиболее сложен в аппаратурном оформлении но наиболее удобен. Так, в хроматографической камере пластинка размещается горизонтально и подача системы происходит на один край пластинки с помощью фитиля. Фронт растворителя движется в противоположную сторону. Есть еще один прием, позволяющий предельно упростить камеру. Для этого хроматографическую пластинку на алюминиевой основе слегка изгибают и помещают в камеру. В данном случае система будет поступать с двух сторон одновременно. Для этой цели подходят только пластины с алюминиевой подложкой, так как пластиковая и стеклянная основа "несгибаема", т.е. не сохраняет форму.

К достоинствам этого метода можно отнести то, что в горизонтальной кювете насыщение парами системы происходит гораздо быстрее, скорость движения фронта постоянная. А при хроматографировании с двух сторон, фронт не "убегает"

Сушка пластин

После процесса разделения исследуемых веществ, пластинки сушат. Это тоже немаловажный процесс, так как при наличии на пластинке даже следов растворителя, возможно получить неправильные результаты хроматографирования.

Если хроматографическая система имела в своем составе только легкокипящие компоненты, то достаточно естественной сушки в течении 3-5 минут. Если же в состав системы входят высококипящие жидкости (спирты, вода, органические кислоты и т.д.), сушку пластин нужно проводить не менее 10 мин или помещать пластинку в сушильный шкаф.

Идентификация разделенных веществ

Высушенная пластинка является хроматограммой исследуемых веществ. Если вещества являются окрашенными, то идентификация начинается с определения цвета разделенных веществ.

Однако часто разделяемые вещества бесцветны и простое визуальное сравнение невозможно.

Для тонкослойной хроматографии существует несколько видов качественного анализа (идентификации) разделенных веществ:

· Визуальные методы и определение Rf разделенных веществ.

· Цветные реакции.

· Сравнение со свидетелями.

· Физико-химические методы идентификации.

Физические методы идентификации

Визуальные методы используются в основном, для определения местоположения пятен разделенных веществ на хроматографической пластинке. Для этого пластинку рассматривают как в видимом свете, так и используя ультрафиолетовый свет (в основном свет с длиной волны 366 и 254 нм)

Это первый этап идентификации, на котором определяется качество подобранных условий и полученных результатов хроматографирования.

Так, определив качество хроматографирования (отсутствие "хвостов" разделяемых веществ или перекрытие их пятен, правильную форму и размеры, отсутствие слияния хроматографических дорожек и т.д.) и признании пригодным проведенного разделения для дальнейшего исследования, определяют Rf выявленных пятен.

Значение Rf

Одним из основных показателей в ТСХ является показатель Rf. Этот параметр является аналогией времени удерживания и зависит как от свойств разделяемых веществ, состава подвижной фазы и сорбента, так и от физических параметров.

Определение значения Rf проводят как отношение расстояния прошедшего веществом к расстоянию, прошедшего фронтом растворителя. Значение Rf - величина безразмерная и имеет значение от 0 до 1.

На значение Rf не влияет расстояние пройденное фронтом растворителя, однако во многих методиках описывается прохождение фронта на расстояние 10 см. Это используется только для облечения расчетов Rf.

На практике, в начале определяют расстояние прошедшее фронтом растворителя: от линии старта (а не от края пластинки) до места, где находился фронт в момент окончания хроматографирования. Затем определяют расстояние от линии старта до пятна разделенного вещества. Во тут и оказывает влияние размер пятна! Ведь если пятно имеет круглую форму и небольшой размер, то полученное Rf имеет четкое значение. А если полученное пятно имеет большой размер или неправильную форму, то при определении Rf такого пятна, ошибка может достигнуть 0,1.

В случае распределительной хроматографии коэффициент распределения вещества и его Rf связано соотношением:

где Sп и Sн -площади поперечных сечений подвижной и неподвижной фазы. Как мы видим, Коэффициент распределения, при постоянном отношении Sп/Sн есть величина пропорционально зависящая от Rf , и может быть определена через него.

Цветные реакции

Цветные реакции в тонкослойной хроматографии используются чрезвычайно широко. Они служат не только для определения местоположения разделенных компонентов (обработка серной кислотой, парами йода), но и определения как класса веществ, так и идентификации (при наличии индивидуальных реакций).

При совпадении всех качественных реакций и совпадении полученных значений Rf вещества в трех различных системах с литературными данными, вещество идентифицировано. Хотя, для более точной идентификации вещества необходимо дополнительное подтверждение исследованием другим физико-химическим методом.

Сравнение со свидетелем

При проведении исследований веществ с предполагаемым составом, применяют метод хроматографирования со свидетелем - известным веществом. Этот метод используется кода трудно выдержать условия хроматографирования, нет литературных данных Rf для данной системы или адсорбента, использование градиентного метода и т.д. Да и при проведении цветных реакций можно сравнить не только цвета, но и оттенки исследуемых веществ и свидетелей, что также немаловажно.

Физико-химические методы идентификации

Прелесть тонкослойной хроматографии состоит в том, что после хроматографирования каждое разделенное вещество можно в дальнейшем исследовать другими методами гораздо проще. И дело тут не в том, что другие методы хроматографирования не могут этого. Дело тут в сложности выделения и материальных затратах на специальные приспособления, у которых только одна задача - выделить вещество.

В тонкослойной хроматографии есть только одна трудность - снять слой сорбента и вымыть из него вещество. В дальнейшем можно его исследовать с использованием ИК и УФ-спектрометрии, рентгено-структурными методами, ЯМР и т.д.

Список использованной литературы

1. Основы аналитической химии. В 2 кн. Ю.А. Золотов, Е.Н. Дорохова, В.И. Фадеева и др.; Под ред. Ю.А. Золотова. - М.: Высш. шк., 1996.

2.Кнорре Д.Г., Крылова Л.Ф., Музыкантов В.С. Физическая химия. - М.: Высш. шк., 1990.

3. Алесковский В.Б., Бардин В.В., Булатов М.И. Физико-химические методы анализа. Практическое руководство.- Л.: Химия, 1988.

5.Учебные материалы по курсу "История и методология химии" ( химфак МГУ)

6. Краткая химическая энциклопедия. Гл. редактор И. Л. Кнунянц М.: Советская энциклопедия, 1961.