Бродильное производство органических кислот

2

Міністерство освіти і науки України

Дніпропетровський національний університет

Біолого-екологічний університет

Кафедра мікробіології та вірусології

Аналітичний огляд з курсу «Біотехнологія» на тему:

«Бродильне виробництво органічних кислот»

Підготувала ст.гр.БМ-05-5

Титаренко М.А.

Перевірив доктор біол. наук,

професор

Вінніков Альберт Іванович

Дніпропетровськ

2008

Содержание

Введение

1. Производство органических кислот

1.1. Бродильное производство уксусной кислоты

1.2. Получение молочной кислоты при участии молочнокислых бактерий

1.3. Производство лимонной кислоты методом ферментации

2. Получение в промышленных масштабах других органических кислот

2.1. Процесс образования глюконовой кислоты при участии бактерий

2.2. Яблочная кислота, получаемая из фумаровой кислоты или путем ферментации специфических бактерий

2.3. Представители родов Pseudomonas, Corynebacterium способны к образованию салициловой кислоты

3. Производство аминокислот при помощи бактерий и их мутантов

3.1. Производство аминокислот из биосинтетических предшественников

3.2. Синтез аминокислот с помощью ферментов

3.3. Применение аминокислот

Заключение

Перечень ссылок

Введение

Биомасса представляет собой сложную химическую систему, а большинство процессов и продуктов биотехнологии имеют биохимическую природу, будь то производство веществ, используемых как горючее, получение путем брожения продуктов питания и напитков, синтез биополимеров, использование организмов, участвующих в круговороте химических веществ на Земле, применение сложных химических соединений в медицине или сельском хозяйстве. Речь пойдет главным образом о прин-ципах, перспективах и технологии получения химической про-дукции на базе биотехнологии. Основное внимание будет уделено химическим процессам и соединениям. Корни современной прикладной микробиологии и соответст-венно биотехнологии уходят в химическую промышленность начала нынешнего века: именно тогда были разработаны основы промышленного производства ряда химических веществ (например, ацетона, этилового спирта, бутандиола, бутанола и изопропанола) из углеводов растений[2] . На смену этой важной отрасли промышленности пришла быстро развившаяся нефтехимическая промышленность. Однако сейчас запасы ископаемого сырья стали предметом конкуренции, так как оно требуется для производства химических веществ, энергии и даже пищевых продуктов; все это усугубляется повышением цен на нефть и уголь. В таких условиях применение процессов нового типа при производстве химических веществ из возобновляемой биомассы становится все более перспективным. Идет переоценка возможностей использования модернизированных процессов, по сути своей подобных разработанным в начале века[6]. В этом направлении уже сделаны первые шаги. Так, глицерол получают с помощью водорослей; активно ведется работа по изучению возможности использования лигнина древесины. С технической точки зрения это сложная проблема: решение ее откроет новый путь получения многих ценных ароматических соединений, играющих столь важную роль в современной химической промышленности.

Помимо новых способов получения химических веществ из биомассы биотехнология дает нам также более эффективные и производительные катализаторы для осуществления химических взаимопревращений. Они могут использоваться двояким путем. Во-первых, специфичность действия фермента (или ферментов) может применяться при катализе in vivo или in vitro простых, но технически трудно осуществимых превращений. Примером такого рода служит гидроксилирование стероидов при синтезе лекарственных веществ[8]. Во-вторых, с их помощью можно осуществлять полный биосинтез сложных и дорогостоящих тонких химических продуктов из простых составных частей, например образование антибиотиков в ходе вторичного метаболизма у грибов. Многообещающей областью дальнейшего развития представляется производство ценных веществ из растений [среди которых упомянем терпены (ароматические вещества) и алкалоиды (используемые при производстве лекарств)] путем массового культивирования клеток растений[1].

1. Производство органических кислот

1.1 Бродильное производство уксусной кислоты

Среди органических кислот самая важная -- уксусная. На рынок США ее ежегодно поступает около 1,4 млн. т общей стоимостью до 500 млн. долл. (без учета уксуса). В прошлом основную часть уксусной кислоты получали путем микробиологического окисления этанола, но сегодня, за исключением производства уксуса, этот процесс по экономическим соображениям не применяется. Впрочем, в результате ведущихся исследований термофильных бактерий, способных превращать целлюлозу в уксусную кислоту, а также штаммов Acetobacter и Clostridium, способных синтезировать ее из водорода и углекислого газа, этот метод, может быть, восстановит свои позиции[2]. Техническая уксусная кислота используется при выработке многих химических веществ, включая каучук, пластмассы, волокна и инсектициды. При обычном способе производства микробиологическая конверсия этанола в уксусную кислоту при участии штаммов Acetobacter и Gluconobacter идет в аэробных условиях и поэтому, строго говоря, не является процессом брожения. Уксус по праву считается важнейшим продуктом микробиологической промышленности [5].

1.2 Получение молочной кислоты при участии молочнокислых бактерий

В конце XIX в. началось промышленное производство молочной кислоты при участии молочнокислых бактерий Lactobacillus delbrueckii, L. leichmannii и L. bulgaricus. Это был один из первых процессов, где применялась частичная стерилизация среды нагреванием. Этот микроаэрофильный процесс осуществ-ляется при высокой температуре (45--50°). В нем используют содержащее крахмал сырье, которое предварительно обрабатывают ферментами или подвергают кислотному гидролизу. L. bulgaricus активно сбраживает лактозу и может поэтому использовать молочную сыворотку в качестве питательного субстрата[9]. В других случаях конверсии подвергается сахароза (концентрация 12--18%, вес/объем). Процесс идет 3-- 4 суток; при этом в больших количествах выделяется углекислый газ, что облегчает создание в среде оптимальных полуаэробных условий. Описаны также способы конверсии 1,2-пропандиола в молочную кислоту при помощи Arthrobacter oxydans, Alcaligenes faecalis или Fusarium solani. Эти микроорганизмы в основном образуют L( + )-изомер молочной кислоты, но некоторые штаммы L. leichmanii синтезируют D(--)-изомер. Было изучено образование молочной кислоты при непрерывном куль-тивировании. В одностадийном процессе выход в случае L. delbrueckii составлял 89 г/л в сутки[10]. При использовании препаратов молочнокислых бактерий, иммобилизованных в альгинатных гелях, степень конверсии достигала 97%. Доля L( + )-изомера составляла 90%, а время полужизни--100 суток. В этих процессах молочную кислоту получают в форме кальциевой соли; чтобы выделить конечный продукт, ее обрабатывают серной кислотой. Молочную кислоту используют в качестве добавки к безалкогольным напиткам, эссенциям, фруктовым сокам, джемам и сиропам, для декальцификации кожи в дубильной промышленности, а также при производстве пластмасс, когда L( + )-форму полимеризуют в полилактат, применяемый для производства пластиковых оберток. Соли молочной кислоты используются в медицине[6].

1.3 Производство лимонной кислоты методом ферментации

Производство лимонной кислоты методом ферментации при участии грибов также принадлежит к числу давних биотехнологических процессов; оно было налажено в 1893 г. Его развитие шло в тесной связи с разработкой многих фундаментальных аспектов микробиологии. Вначале основные проб-лемы были связаны с микробным загрязнением. В поисках их решения было найдено, что процесс можно вести при очень низких рН, и это почти не сказывается на образовании кислоты грибами. В таких условиях создавать и поддерживать стерильность гораздо проще. За 1 -- 2 недели ферментации при высоких концентрациях сахара в сырье выход достигал 60%. Наиболь-ший выход получали, когда тем или иным способом ограничивали рост мицелия[8]. Первоначальный вариант процесса основывался на поверхностной ферментации, но в 1950 г. было внесено важное изменение -- освоено глубинное культивирование. Было показано, что стабильный процесс глубинной ферментации воз-можен только в том случае, если он осуществляется в две стадии: на первой идет рост мицелия, а на второй (в несодержащей фосфор среде) -- образование лимонной кислоты. За короткий срок были разработаны схемы, основанные на использовании дешевого углеводного сырья: мелассы, крахмала и глюкозного сиропа. Наличие ионов металлов в исходном сырье приводит к резкому падению выхода; их нужно удалять либо путем осаждения гексацианоферратом, либо пропусканием через ионообменные смолы, либо применением солей четвертичного аммония[5]. Для устранения вредного влияния этих примесей широко используется также метанол и другие низшие спирты. Механизм их действия неизвестен.

Возможно, они как-то влияют на цитоплазматическую мембрану[4]. В 60-х годах для производства лимонной кислоты был предложен новый процесс на основе н-парафинов (С_э-₃о) и штаммов Corynebacterium, Arthrobacter и Brevibacterium, но рыночной продукции с его помощью получено не было. Изучалось также образование лимонной кислоты дрожжами Candida. Они синтезируют смесь лимонной и изолимонной кислот в соотношении, зависящем как от генетических факторов, так и от условий ферментации. Было найдено, что ключевую роль здесь играет аконитат-гидролаза: мутанты с малой активностью этого фермента продуцировали больше лимонной кислоты. Растущие на углеводородах дрожжи также способны синтезировать лимонную кислоту из глюкозы. Гриб Trichoderma vlride образует большое количество цитрата из глюкозы; это позволяет вырабатывать лимонную кислоту из целлюлозы. С помощью некоторых видов Penicillium можно вести ферментацию с образованием Ls-алло-изолимонной кислоты, диастереомера изолимонной кислоты[8].

В промышленном производстве лимонной кислоты в основном используется Aspergillus niger, но применяется также и А. wentii. Процесс ферментации очень сложен, так как лимонная кислота является продуктом первичного метаболизма этих грибов, и любое сколько-нибудь существенное выделение этого промежуточного соединения обмена веществ в окружающую среду свидетельствует о сильном нарушении метаболизма, воз-никающем вследствие его дисбаланса или генетических нарушений. Рост грибов обычно регулируют путем изменения состава среды (Р, Mn, Fe, Zn)[1]. Субстрат должен легко усваиваться; негидролизованные полимеры обычно не используют, так как в этом случае внеклеточный гидролиз будет лимитировать скорость всего процесса.

Сверхпродукция лимонной кислоты является ответной реакцией на недостаток фосфата, но при выраженной нехватке металлов лимитирующим фактором не обязательно является фосфат. Роль металлов при этом до конца еще не понята. Оптимум рН составляет 1,7--2,0; в более щелочной среде происходит образование заметных количеств щавелевой и глюконовой кислот. Таким образом, тщательный контроль за культуральной средой позволяет обойти регуляторные системы обмена и создает оптимальный фон для образования лимонной кислоты. Видимо, в этих условиях стимулируется гликолиз и обеспечивается неограниченное поступление углерода в реакции промежуточного метаболизма. Уровень накопления цитрата зависит при этом от поступления оксалоацетата[7].

При недостатке марганца активность ферментов цикла трикарбоновых кислот уменьшается, что в свою очередь подавляет анаболизм. Такое нарушение обмена приводит к повышению концентрации аммонийных ионов внутри клеток, и они могут смягчать ингибирующее влияние цитрата на фосфофруктокиназу. Кроме того, марганец, видимо, как-то влияет на биохимические свойства поверхности клеток и морфологию гиф. Поскольку в процессе потребляется много кислорода, возможно повторное окисление цитоплазм этического NADH без образования АТР. В нем участвует альтернативная, а не основная цепь дыхательных реакций. В результате без сколько-нибудь выраженного изменения обмена возникает метаболическая «утечка» (Них) через гликолиз. Эта утечка, происходящая при участии конститутивной пируваткарбоксилазы и некоторых ферментов цикла трикарбоновых кислот, а также необычная кинетика действия ферментов, участвующих в метаболизме оксалоацетата, приводят к увеличению внутриклеточной концентрации цитрата[5]. Последний способствует дальнейшему накоплению цитрата путем ингибирования изоцитратдегидрогеназы.

В промышленном производстве лимонной кислоты применяется несколько вариантов процесса. Традиционным твердофазным вариантом является процесс Коджи; он имеет много общего с процессом поверхностной ферментации. Глубинная ферментация с технической точки зрения сложнее, чем поверхностная, но возможна в разных вариантах: периодическом с подпиткой и непрерывном[1]. Периодическая ферментация используется при работе с глюкозосодержащими субстратами, а ее вариант с подпиткой чаще применяется при переработке мелассы. Непрерывное культивирование, дающее наибольший выход продукта, также возможно, но применение этого способа в промышленности в обозримом будущем маловероятно. Для процесса характерно два максимума скорости: роста и образования продукта. На первом этапе образуется значительное количество продукта, зависящее от скорости роста. На втором этапе рост отсутствует, а предельное количество образующегося продукта определяется концентрацией биомассы. В конце ферментации массу мицелия отделяют фильтрованием и промывают. Затем при рН<3,0 осаждают щавелевую кислоту в форме оксалата кальция. Богатый белком мицелий можно использовать на корм скоту. Лимонную кислоту осаждают из жидкой фазы в форме кальциевой трехзамещенной соли в комплексе с четырьмя молекулами воды. Осадок отфильтровывают, промывают и свободную кислоту получают путем обработки сульфатом кальция[5]. Далее ее очищают при помощи активированного угля и ионообменных смол. Можно также экстрагировать кислоту растворителем.

У лимонной кислоты приятный кислый вкус, она хорошо растворима в воде. Ее широко используют в пищевой, фармацевтической и косметической промышленности. Эфиры лимонной кислоты применяются в производстве пластмасс. Поскольку лимонная кислота связывает (хелатирует) металлы, ее используют для их очистки[4]. В составе детергентов она легко разруша-ется живыми организмами, и ею заменяют фосфаты.

2. Получение в промышленных масштабах других органических кислот

Процессы, основанные на микробиологической ферментации, разработаны и для получения ряда других органических кислот. Среди них -- глюконовая кислота и ее производные, яблочная, виннокаменная, салициловая, янтарная, пировиноградная и соевая кислоты. Хотя некоторые из них и поступают на рынок, в нынешних условиях в большинстве случаев такое производство экономически невыгодно[1].

2.1 Процесс образования глюконовой кислоты при участии бактерий

D-глюконовая кислота и ее б-лактон представляют собой простые продукты окисления (дегидрогенизации) глюкозы. Еще в начале 20-х годов было налажено промышленное производство этой кислоты из глюкозы при участии Aspergillus niger. Нейтрализация кислоты позволяла получать боль-шой выход продукта. В погруженных культурах за 48 ч конверсия субстрата составляла 90%. Исследования на полупромышленных установках показали, что если ферментацию вести при повышенном давлении, то выход кислоты за 24 ч составляет 95% от теоретического при использовании раствора глюкозы с концентрацией 150 -- 200 г/л. Процесс можно вести в полунепрерывном режиме, заново используя мицелий (до девяти раз подряд) [8]. Более того, концентрацию глюкозы можно довести до 350 г/л, если для удаления кислоты использовать комплексообразование с соединениями бора и получать боро-глюконат кальция. Однако для осуществления этого процесса нужны особые, устойчивые штаммы. От него отказались после того, как было выяснено, что эта соль неблагоприятно влияет на кровеносные сосуды животных. Контроль за рН осуществляли путем добавления углекислого кальция либо едкого натра[9]. Было найдено, что образование глюконата прямо связано c количеством глюкозооксидазы в среде. Этот фермент в промышленном масштабе получают методом ферментации.

Натриевая соль глюконовой кислоты используется для извлечения металлов. Когда рH процесса контролируют с помощью едкого натра, получают именно эту соль. Был разработан непрерывный процесс ее производства, при котором выход натриевой соли из 35%-ного (вес/объем) раствора глюкозы составляет 95%. Предпринимались попытки применить при брожении иммобилизованные системы (как целые клетки, так и глюкозооксидазу)[2]. Натриевая соль глюконовой кислоты в присутствии едкого натра играет роль ловушки кальция и поэтому используется в составе щелочных средств для мытья бутылок. Она также способна связывать ионы железа в широком диапазоне рН и как препятствующий отложению железа агент применяется в составе щелочных препаратов для борьбы со ржавчиной. Кальциевые и железные соли глюконовой кислоты применяются как пероральные и внутривенные препараты в медицине, а чистая кислота -- как моющее средство в молочной промышленности. Глюконолактон находит применение как медленно действующий подкислитель в составе пекарских порошков, при переработке мяса и в других отраслях пищевой про-мышленности.

Процесс образования глюконовой кислоты при участии бактерий нашел ограниченное применение лишь в некоторых странах Востока. Например, так называемый «чайный гриб» (ассоциация дрожжей, уксуснокислых и глюконовокислых бактерий) превращает подслащенный заваренный чай в напиток, содержащий смесь этих кислот. Малая эффективность реакций окисления глюкозы, идущих при участии бактерий, определяется тем, что одновременно с главным процессом идет образование 2-оксоглюконовой, 5-оксоглюконовой и диоксоглюконовой кислот[2]. Для выработки этих кислот, которые могут служить субстратами для дальнейшей биологической или химической переработки, были разработаны специальные процессы. Так, 5-оксо-глюконовую кислоту можно гидрогенизировать в ходе химической реакции и получить L-идоновую кислоту, которая в свою очередь служит субстратом в ферментативной реакции синтеза 2-оксогулоновой кислоты. Такие превращения можно осуществить и чисто биологическим путем: при помощи видов Acetobacter глюкозу переводят в 2,5-диоксоглюконовую кислоту, которая превращается в 2-оксогулоновую кислоту при участии Corynebacterium или Brevibacterium в ходе двух- или одностадийного процесса на основе смешанных культур этих бактерий[8]. Выход продукта, правда, невелик. 2-Оксогулоновая кислота -- весьма ценный продукт, так как ее метиловый эфир в щелочных условиях легко превращается в аскорбиновую кислоту.

Виннокаменная кислота является обычным побочным продуктом виноделия. Однако ее можно получать и путем микробной трансформации 5-оксоглюконовой кислоты. Штаммы, способные превращать глюкозу в 5-оксоглюконат через глюконат, могут путем дальнейшей ферментации образовывать тартрат[9]. Для этой цели обычно используют мутанты Acetobacter и Gluconobacter. Виннокаменную кислоту можно вырабатывать также из транс- или цыс-эпоксиянтарной кислоты. Соли ее (тартраты) находят широкое применение в пищевой промышленности, но методы биотехнологии в ее производстве обычно не исполь-зуются[9].

2.2 Яблочная кислота, получаемая из фумаровой кислоты или путем ферментации специфических бактерий

Яблочную кислоту, которая применяется в качестве подкислителя в пищевой промышленности, можно получать из фумаровой либо путем ферментации при участии видов Paracolobactrum, либо с помощью иммобилизованной фумаразы. Описаны также способы ее получения из н-парафинов при помощи дрожжей и из этанола при участии Schizophyllum cotnmune[1].

Итаконовую кислоту, идущую на производство пластмасс и красителей, получают с высоким выходом путем ферментации глюкозы с участием грибов из рода Aspergillus. Совсем недавно на основе биотехнологии из углеводных субстратов, а также Сі2-і4-парафинов при участии Candida hydrocarbofurmarica получали 2-оксоглутаровую кислоту, но на смену этому способу пришло каталитическое окисление бензола.

Большинство органических кислот, вырабатываемых с помощью микробов, является продуктом переработки пищевого сырья; исключение составляют кислоты, производимые из н-парафинов. О возможности использования других видов углеводородного сырья как потенциального источника более ценных органических соединений говорится уже давно, но лишь немногие процессы используются сегодня для получения промышлен-ной продукции[5]. Так, из нафталина при помощи микробов вырабатывают салициловую кислоту и другие окисленные его производные. Об этом в последние двадцать лет писали не раз (Cain, 1980; Tangnu, Ghose, 1980, 1981).

2.3 Представители родов Pseudomonas, Corynebacterium способны к образованию салициловой кислоты

К числу бактерий, способных вырабатывать салициловую кислоту (рис. 4.4) при росте в средах с нафталином, принадлежат многие виды Pseudomonas, Achromobacter и Corynebacterium. Запатентован способ выработки о-гидроксибензальпировиноградной кислоты и 1,2-дигидро-1,2-дигидроксинафталина при участии видов Nocardia. Большинство диких штаммов бактерий, расщепляющих нафталин, при хорошей аэрации в про-стых солевых средах редко образует салицилат в концентрации, превышающей 1%, но путем изменения сред и отбора подходящих штаммов могут быть получены и более высокие выходы[4].

Одним из основных факторов, влияющих на выход, является доступность субстрата, и накопление салицилата происходит лишь при постоянном присутствии нафталина: это угнетает дальнейшие окислительные превращения. Механизм деградации зависит от относительной концентрации нафталина и салициловой кислоты. Сложность заключается в том, что полиароматический нафталин плохо растворим в воде, в среде ферментации он обычно присутствует в виде тонкой взвеси. Добавление эмульгаторов типа Span 80, Span 20, лецитина, кефалина и дру-гих поливиниловых спиртов существенно увеличивает накопления салицилата, так как при этом повышается доступность субстрата. Обычно используют чистый нафталин, но салицилат можно получать и из неочищенных нафтафракций. Примеси (алкилнафталины, тиофен, бензотиофен и крезолы) этому не мешают[7].

В ходе ферментации рН быстро падает, так что нужно использовать сильно забуференные среды с высокой концентрацией фосфата либо добавлять мочевину или углекислый кальций. Для максимального накопления салицилата необходимы ионы различных металлов. Сообщалось, что выход можно еще более повысить, если внести в среду особые добавки: органические и неорганические производные алюминия или бора, пантотеновую кислоту и ряд других веществ[7]. Ферментация регулируется накапливающимся продуктом, а не субстратом; удаление салицилата из среды снимает его ингибирующее влияние на рост и приводит к дальнейшему образованию салициловой кислоты. Продукт отделяют двумя способами. Для этого используют анионообменную смолу (типа амберлит IRA-400), которую либо вносят прямо в среду, либо помещают в диализный мешок; при этом салициловая кислота адсорбируется смолой. Культуральную жидкость можно пропускать через колонку с ионообменной смолой, смонтированную около ферментера. При этом концентрация продукта в ферментере все время поддерживается на низком уровне, что многократно увеличивает выход (до 6 раз); возрастает полнота извлечения продукта. Альтернативный спо-соб удаления продукта -- диализная ферментация. Применение этого процесса на небольшой опытной установке позволило увеличить выход салицилата от 10 до 206 г/л. Преимущество метода состоит в том, что удается избежать неблагоприятного воздействия ионообменных смол; с другой стороны, приходится использовать большие объемы жидкой среды, что снижает концентрацию в ней продукта[1]. Применяются и другие, более традиционные способы отделения продукта, например экстракция растворителем. Производство салицилата путем ферментации также страдает от фаговой инфекции, и приходится вести рабо-ту по селекции устойчивых к фагам мутантов.

Показано, что деградация нафталина и салицилата микроорганизмами нескольких родов детерминируется плазмидами. Так, за превращение нафталина в салицилат ответственна плазмида NAH: она несет гены ферментов, осуществляющих этот процесс (нафталиноксигеназы, 1,2-диоксинафталиноксигеназы, дегидрогеназы салицилового альдегида). Таким образом, у многих микроорганизмов, использующих нафталин, генетическая информация для осуществления этого процесса закодирована в плазмиде, но это бывает не всегда. В ходе использования таких плазмид создаются предпосылки для встраивания соответствующего генетического материала в хромосомы клеток хозяина, что превращает штаммы в продуценты салицилата[2]. Способность использовать или окислять нафталин обычно за-крепляется при росте на нафталине, салицилате или его аналогах, таких как бензоат или аминобензоат. Описаны интересные процессы сопутствующего окисления: мутантные штаммы Pseudomonas pntida, выращенные на среде с глюкозой, которая служит единственным источником углерода и энергии, способны окислять нафталин до дигидрокси-1,2-дигидронафталина и 1,2-гидроксинафталина на основе индукции ферментов нафталином или другими соединениями-индукторами, происходящей после завершения роста. Первое из этих соединений после кислотной дегидратации превращается в а-нафтол -- важное моноокисленное производное нафталина (рис. 4.4).

3. Производство аминокислот при помощи бактерий и их мутантов

Все аминокислоты, из которых состоят белки, являются" L-а-амино- (или имино-) кислотами. Они находят применение как пищевые добавки, приправы, усилители вкуса, как сырье в парфюмерной и фармацевтической промышленности и при производстве других веществ[4]. Их можно получать как из природных продуктов (главным образом при гидролизе белков рас-тений), так и путем химического, микробиологического или ферментативного синтеза. Если химический синтез дает продукт-рацемат, который требует дальнейшей обработки, то последние два метода позволяют получить оптические чистые аминокислоты.

Секретом большинства производственных процессов с участием микроорганизмов, о которых говорится в этой главе, является изменение условий среды: именно за счет этого достигается синтез избыточных количеств желаемого продукта. Необходимого дисбаланса метаболизма можно добиться путем эмпирического изменения таких факторов, как концентрация субстрата, рН, концентрация продукта, или же путем установ-ления критических уровней содержания других веществ (ионов металлов, органических добавок) в среде. При переводе биологических процессов образования аминокислот на коммерческую основу были выработаны новые способы желаемых изменений метаболизма у организмов-продуцентов, направленных на увеличение выхода промежуточных продуктов, образование которых в иных условиях находится под строгим метаболическим контролем[3].

Для производства аминокислот бактерии стали использоваться с начала 50-х годов. Штаммы их постоянно улучшали генетическими методами, выделяя ауксотрофные мутанты и мутанты с измененными регуляторными свойствами. Чтобы обеспечить образование аминокислот в больших количествах, в любом случае необходимо изменить систему регуляции обмена. Для этого можно либо стимулировать потребление субстрата в некоторых путях биосинтеза и выделение аминокислот в среду, либо подавить побочные реакции и процессы деградации аминокислот.

Производство таких аминокислот как L- глутамат, L- валин, L- глутамин, L- пролин, при участии диких штаммов бактерий основано либо на использовании присущих этим бактериям особенностей метаболизма, либо на стимуляции образования аминокислот в ответ на изменение условий внешней среды. Образовывать аминокислоты могут бактерии многих родов: Corynebacterium, Вacillus, Aerobacter, Microbacterium, Escherichia), причем они настолько продуктивны, что производство становится рентабельным. Так, вид Corynebacterium выращиваемый на этаноле или ацетате при наличии достаточного количества биотина в среде способны синтезировать до 30 г/л глутамата. Для накопления этой аминокислоты важным условием является полное или частичное подавление активности альфа- кетоглутаратдегидрогеназы. Образование продукта увеличивается при добавлении бета- лактамных антибиотиков ( пенициллина, цефалоспорина С), поверхностно- активных веществ и жирных кислот и липидов. Путем изменения условий среды процесс ферментации, в ходе которого образуется L- глутамат, может быть переключен на синтез L- глутамина или L- пролина. При ысокой концентрации биотинов и ионов аммония создаются благоприятные условия для образования L- пролина, а при больших количествах аммония и ионов цинка в слабо кислой среде усиливается синтез L- глутамина[9].

Ауксотрофные мутанты не могут образовывать ингибиторы соответствующего метаболического пути, работающие по принципу обратной связи, так как у них отсутствует определенная ключевая ферментативная реакция. Поэтому при выращивании мутантного штамма в среде с минимальной концентрацией необходимого питательного ингридиента они способны образовывать избыточные количества вещества- предшественника или близких к нему метаболитов блокированной реакции. Так, первые реакции у коринебактерий ингибируются по механизму обратной связи самим конечным продуктом, и образование соответствующих ферментов подавляется L- аргинином. У цитруллинового ауксотрофа этой бактерии отсутствует фермент, называемый орнитин- карбамоилтрансферазой, который катализирует превращение орнитина в цитруллин на одном из промежуточных этапов биосинтеза L- аргинина. Синтез аргинина не идет, что приводит к снятию ингибирования по принципу обратной связи со всех ферментов этого пути и накоплению избытка орнитина[10]. Ауксотрофные мутанты находят применение и в тех случаях, когда необходимо синтезировать соединения, являющиеся конечными продуктами разветвленных цепей метаболических реакций.

3.1 Производство аминокислот из биосинтетических предшественников

Использование предшественников при производстве аминокислот позволяет успешно обходить метаболический контроль, осуществляющийся по механизму обратной связи и репрессии. Рассмотрим процесс синтеза L лейцина из L- треонина через альфа- кетоглутарат. Первый фермент в этом пути биосинтеза у Serratia marcescens ингибируется L- изолейцином по механизму обратной связи. При добавлении в среду D- треонина происходит индукция D- треонингидратазы, которая L- изолейцином не ингибируется и поэтому синтез L- изолейцина из D- треонина может миновать метаболический контроль[2].

3.2 Синтез аминокислот с помощью ферментов

Для определения роли и преимуществ применения ферментов при синтезе аминокислот необходимо рассмотреть 5 классов ферментов[6]:

1. Гидролитические ферменты ( гидролазы), например L- альфа- амино- капролактам- лиаза ( синтез L- лизина) или 2- амино-тиазолин- 4- карбоксилатгидолаза ( синтез L- цистеина). Чтобы можно было использовать неочищенные ферменты, целые клетки обрабатывают поверхностно- активными веществами, вызывающими изменения проницаемости. Кроме того, могут быть получены мутанты, у которых искомый продукт не вовлекается более в обмен веществ.

2. Лиазы. Эти ферменты часто используются в реакциях дзаминирования. Так, для образования L- аспарта из фумарата аммония может использоваться аспартаза или аммиак- амилаза. В качестве доноров аммония могут , кроме того, выступать гидразин или гидроксиламин.

3. Ферменты, содержащие пиридоксальфосфат. Это обычные коферменты, участвующие в метаболизме аминокислот. Они катализируют множество реакций: рацемизацию, трансаминирование, декарбоксилирование, реакции замещения и элиминации и являются своего рода универсальными. По- видимому, роль этих коферментов состоит в активации аминокислот, что облегчает их взаимодействие с апоферментом.

4. Дегидрогеназы аминокислот, например лейцин- и аланин- дегидрогеназы. Они катализируют обратимые реакции дезаминирования. Их применяют в непрерывных процессах синтеза аминокислот из соответствующих кето- аналогов. В мембранном реакторе дегидрогеназы аминокислот удерживаются ультрафильтрующей мембраной и используют в своей работе один и тот же пул НАДН, который сохраняется в реакторе, так как ковалентно связан с полиэтиленгликолем.

5. Глутаминсинтаза. Этот фермент катализирует АТФ- зависимую реакцию аминирования глутамата, которая была сопряжена со сбраживанием сахара дрожжами. Высвобождающаяся при брожении энергия используется для синтеза глутамина[6].

3.3 Применение аминокислот

Аминокислоты находят применение во многих сферах:

а) их используют в качестве пищевых добавок. Так, лизином, триптофаном и треонином обогащают растительные белки, а метионин включают в блюда из сои.

б) при выработке пищевых продуктов аминокислоты находят применение в роли усилителей вкуса и добавок. Благодаря выраженному мясному вкусу широко используется L- энантиомер мононатриевой соли глутаминовой кислоты. Глицин добавляют как подсластитель, бактериостатическое вещество и антиоксидант.

в) аминокислоты применяются в медицине ( вливание), а некоторые их аналоги используются для лечения психических заболеваний.

г) в химической и фармацевтической промышленности аминокислоты широко используются как предшественники в производстве детергентов, полиаминокислот ( из них делают синтетические волокна и пленки) , полиуретана и химикатов для сельского хозяйства[8].

Заключение

Биотехнология уже сегодня имеет большое экономическое и социальное значение, поскольку человек не может бесконечно долго черпать ресурсы природы. В данном аналитическом обзоре рассматриваются бродильные производства органических кислот имеющие значительные экономические преимущества. Например, среди органических кислот самая важная -- уксусная. На рынок США ее ежегодно поступает около 1,4 млн. т общей стоимостью до 500 млн. долл. (без учета уксуса); Было рассмотрено промышленное производство молочной кислоты при участии молочнокислых бактерий Lactobacillus delbrueckii, L. leichmannii и L. bulgaricus. Полученную таким образом молочную кислоту используют в качестве добавки к безалкогольным напиткам, эссенциям, фруктовым сокам, джемам и сиропам. Соли молочной кислоты используются в медицине. А производство лимонной кислоты методом ферментации при участии грибов также принадлежит к числу давних биотехнологических процессов; были разработаны схемы, основанные на использовании дешевого углеводного сырья: мелассы, крахмала и глюкозного сиропа - что на сегодняшнее время имеет очень актуальное значение. Полученная таким образом лимонная кислота имеет приятный кислый вкус, хорошо растворима в воде. Ее широко используют в пищевой, фармацевтической и косметической промышленности. Процессы, основанные на микробиологической ферментации, разработаны и для получения ряда других органических кислот. Среди них -- глюконовая кислота и ее производные, яблочная, виннокаменная, салициловая, янтарная, пировиноградная и соевая кислоты. Хотя некоторые из них и поступают на рынок, в первичных условиях в большинстве случаев такое производство было экономически невыгодно.

Перечень ссылок

1. Быков В.А., Крылов И.А. « Микробиологическое производство биологически активных добавок и препаратов», М: 1987, 142с.

2. Гусев М.В., « Общая микробиология», М: 1987, 383с.

3. Под ред. Егорова Н.С. « Промышленная микробиология», М: 1989, 686с.

4. Под редакцией академика Баева А.А. « Биотехнология , принципы и применение», М. 1988, ст.480.

5. Печуркин Н.С., Брильков А.В. « Популяционные аспекты биотехнологии», М: 1990, 173с.

6. Рычков Р.С., Попов В.Г. « Биотехнологические перспективы развития», М: 1984, 154с.

7. Сассон А.Р. « Биотехнология», М: 1987, 342с.

8. Хиггинс И. « Биотехнология, принципы и применение», М: 1988, 480с.

9. Шлегель Г. « Общая микробиология», М: 1987, 566с.