Методы исследования аминокислот и белков: электрофорез, хроматография, изоэлектрофокусирование, центрифугирование, диализ и др.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Методы исследования аминокислот и белков: электрофорез, хроматография, изоэлектрофокусирование, центрифугирование, диализ и др.

Методы очистки белков

Центрифугирование

Чтобы очистить белок, его нужно извлечь из клетки, разрушив ее в гомогенизаторе. Затем необходимо разделить компоненты гомогената. Такого рода фракционирование клеток стало возможным только после разработки в начале 1940-х гг. «препаративной ультрацентрифуги». В ней происходит высокоскоростное вращение экстракта разрушенных клеток. Это позволяет разделить клеточные компоненты по размеру и плотности: в целом, чем крупнее частица, тем большая центрифужная сила будет на нее действовать, и тем быстрее она будет вращаться. При относительно низких скоростях седиментируют (оседают) крупные компоненты, такие как ядра, с образованием осадка на дне центрифужной пробирки; при больших скоростях и длительном времени центрифугирования можно собрать сначала маленькие замкнутые везикулы, а затем рибосомы (рис. 8.10).

Колоночная хроматография

Чаще всего белки разделяют при помощи колоночной хроматографии, при этом смесь растворенных белков пропускают через колонку, содержащую твердую пористую матрицу (сорбент). Различные белки по-разному взаимодействуют с сорбентом и задерживаются на матрице, их можно будет собрать отдельно по мере выхода из колонки (рис. 8.12). В зависимости от выбора матрицы белки можно разделить по заряду, гидрофобности, способности связывать определенный вид малых молекул или макромолекул и размеру.

В ионообменной хроматографии нерастворимый сорбент несет ионные заряды, задерживающие движение несущих противоположный заряд молекул. Сила связывания растворенных молекул с ионообменной матрицей зависит от ионной силы и pH проходящего через колонку раствора. Таким образом, для достижения эффективного разделения их можно систематически изменять.

При гель-фильтрации сорбент инертен, но содержит поры. Молекулы, которые достаточно малы для того, чтобы проникать в поры, задерживаются в них и, таким образом, движутся по колонке медленнее, чем крупные молекулы, не способные входить в поры сорбента. Доступен широкий ассортимент гранул поперечно сшитых полисахаридов (декстрана, агарозы или акриламида) с разными размерами пор, что позволяет использовать их для разделения молекул различной молекулярной массы.

В аффинной хроматографии применяется нерастворимый сорбент, ковалентно связанный со специфическим лигандом, например молекулой антитела или субстратом фермента, которые будут связывать определенный белок. Молекулы фермента, связавшиеся в таких колонках с неподвижным субстратом, можно элюировать (извлечь из адсорбента) при помощи концентрированного раствора субстрата в свободной форме. Молекулы, связавшиеся с неподвижными антителами, можно элюировать путем диссоциации комплекса антитело-антиген концентрированным раствором соли или раствором с высоким или низким pH. Аффинная хроматография позволяет достичь высокого уровня разделения однократным пропусканием раствора через колонку.

Методы анализа белков

Электрофорез в ДСН ПААГ

Белки можно разделить при помощи электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН*ПААГ). Обычно белки несут суммарный положительный или отрицательный заряд, определяемый составляющими их кислотными остатками. Наложение эл поля на содержащий белковые молекулы раствор заставляет белок двигаться со скоростью, зависящей от его суммарного заряда, размера и формы. Это свойство используют проводя электрофорез в ПААГ в присутствии ДСН. Обагащенный поперечными сшивками ПААГ используется в качестве инертной матрицы, через которую движутся белки. Гель приготавливают путем полимеризации мономеров, размер пор можно произвольно выбрать, таким образом, чтобы они были достаточно малы для замедления движения определенных молекул. Сами белки помещают в раствор, содержащий сильный отрицательно заряженный детергент - додецилсульфат натрия (ДСН). Этот детергент связывается с гидрофобными областями белков, что приводит к разрыву связей белковых молекул друг с другом или молекулами пептидов. В результате каждая молекула белка в растворе детергента находится в свободном растворенном состоянии. Помимо этого для разрыва S-S-связей в белках обычно добавляют восстанавливающий агент, например, b-меркаптоэтанол, это позволяет анализировать отдельные пептиды, входящие в состав мультисубъединичных белков. Когда смесь растворенных в ДСН белков пропускают через слой полиакриламида, каждая молекула связывает большое количество «-« заряженных молекул детергента, что маскирует собственный заряд белка и заставляет его двигаться к положительному электроду. Белки одинакового размера будут двигаться через гель с одинаковой скоростью. На более крупные белки с большим зарядом будут действовать большие электрические силы, они будут сильнее тормозиться. В сетке полиакриламидного геля, действующего как молекулярное сито, большие молекулы будут задерживать в значительно большей степени, чем малые, и в результате, сложная смесь белков разделяется на отдельные полосы белков, расположенные в зависимости от молекулярной массы молекул. Содержащиеся в большом количестве белки легко зарегистрировать путем окрашивания их геля, например, раствором кумаси (брильянтовый синий). Содержащиеся в малом количестве белки можно увидеть в геле, если добавить серебряный или золотой краситель. Данный метод широко применяют, т.к. он позволяет разделить любые типы белков, включая те, которые в нормальных условиях в воде нерастворимы, например, мембранные белки. Поскольку полипептиды разделяются по размеру, метод позволяет судить о молекулярной массе и субъединичном составе белков.

Вестерн-блоттинг

Специфические белки можно обнаружить путем гибридизации их с антителами. Определенный белок можно идентифицировать после фракционирования в ПААГ путем экспонирования всех присутствующих в геле белков к специфическому антителу, связанному с радиоактивным изотопом, легко регистрируемым ферментом или флуоресцентным красителем. Для удобства все разделенные белки, находящиеся в геле сначала переносят путем промокания (блоттинга) на нитроцеллюлозную бумагу или нейлоновую мембрану. После помещения мембраны на гель налагают сильное электрическое поле, которое заставляет белки выходить из геля и переходить на мембрану, затем мембрану вымачивают в растворе меченого антитела, что позволяет обнаружить нужный белок.

Масс-спектрометрия

Клеточные биологи и биохимики часто сталкиваются с задачей идентификации одного или нескольких белков, полученных путем их очистки. Поскольку геномы наиболее распространенных экспериментальных организмов расшифрованы, существуют каталоги всех синтезируемых в этих организмах белков, это упрощает задачу идентификации неизвестного белка или набора неизвестных белков. Так, теперь лишь необходимо сравнить некоторые из содержащихся в образце аминокислотных последовательностей с известными генами. В настоящее время для этого почти повсеместно применяют масс-спектрометрию в сочетании с компьютерным поиском по базам данных. Динамика заряженных частиц под действием электрического и магнитного полей в вакууме подчиняется строгим законам. Этот принцип используют в массспектрометрии для разделения ионов в зависимости от отношения их массы к заряду. Это невероятно чувствительный метод. Для него требуется очень малое количество вещества, и он позволяет определять точную массу интактных белков и пептидов, полученных путем ферментативного или химического расщепления. Полученные массы очень точны; часто ошибка меньше чем одна миллионная. Наиболее распространенный вид данного метода -- это матричноактивированная лазерная десорбция/ионизация с времяпролетным масс-анализатором (MALDI-TOF). При этом подходе содержащиеся в образце белки сначала расщепляют до коротких пептидов. Эти пептиды затем смешивают с органической кислотой и высушивают на металлической или керамической подложке. Затем образец облучают лазером, и пептиды покидают подложку в виде ионизированного газа, в котором каждая молекула несет один или более положительных зарядов. Ионизированные пептиды ускоряются в электрическом поле и летят в сторону детектора. Их масса и заряд определяют время, за которое они достигнут детектора: большие пептиды движутся медленнее, а частицы с большим зарядом -- быстрее. Анализируя такие ионизированные пептиды, несущие единственный заряд, можно определить точную массу содержащихся в исходном образце пептидов. Полученную информацию затем используют для поиска по геномным базам данных, в которых содержатся массы всех белков и их предполагаемых пептидных фрагментов, полученные из последовательности генома организма (рис. 8.21, а). Более того, используя одновременно два масс-спектрометра, можно напрямую определить аминокислотную последовательность отдельных пептидов в сложной смеси. Как описано выше, образец белка сначала расщепляют на пептиды меньшего размера, затем разделяют при помощи масс-спектрометрии. Каждый пептид затем фрагментируется еще больше за счет столкновения с высокоэнергетическими атомами газа. Этот метод фрагментации в основном направлен на разрушение пептидных связей, что приводит к образованию «лестницы» фрагментов, отличающихся на одну аминокислоту. Во втором масс-спектрометре эти фрагменты разделяют и определяют их массу. Анализируя эти различия в массах, можно восстановить аминокислотную последовательность пептида (рис. 8.21, б).

Разделение молекул белков методом изоэлектрического фокусирования

Метод изоэлектрического фокусирования основан на изменении суммарного заряда молекулы белка в зависимости от pH окружающего раствора. При низком pH (высокой концентрации H+) карбоксильные кислотные группы белков не заряжены (-COOH), а их содержащие азот основные группы заряжены полностью (например, -NH3 +). В результате большинство белков в таких условиях будут нести положительный суммарный заряд. При высоком pH карбоксильные кислотные группы заряжены отрицательно (-COO-), а основные группы не заряжены (например, -NH2), поэтому большинство белков несут отрицательный заряд. Каждый белок имеет характерную изоэлектрическую точку, то есть pH, при котором он не несет суммарного заряда и, следовательно, не движется в электрическом поле. При изоэлектрическом фокусировании белки электрофоретически разделяют в узкой трубке полиакриламидного геля, в котором при помощи смеси специальных буферных растворов задают pH. Каждый белок движется в градиенте до места, соответствующего его изоэлектрической точке, и останавливается там.

Поверхностный плазмонный резонанс (SLR)

Этот метод позволяет охарактеризовать широкий спектр молекулярных взаимодействий, включая связывание антигена с антителом, лиганда с рецептором, белков с ДНК, углеводами, малыми молекулами и другими белками.) Метод обнаруживает взаимодействия, контролируя отражение луча света от границы раздела между водным раствором потенциально связывающихся молекул (показаны зеленым) и поверхностью биодатчика, на которую нанесен иммобилизованный белок-«наживка» (показан красным). Раствору белков-«добычи» разрешено обтекание иммобилизованного белка-«наживки». Связывание молекул-«добычи» с белками-«наживкой», а также распад комплекса при их отмывании буферным раствором, приводит к регистрируемому изменению резонансного угла. Эти изменения, наблюдаемые в реальном времени, отражают образование и распад молекулярных комплексов.

Рентгеновская кристаллография - основной метод расшифровки трехмерной структуры молекул, включая белки, в атомном разрешении.

Пояснения к рисунку: белок разделение хроматография молекула

(а) Узкий пучок параллельных рентгеновских лучей направляют на высокоупорядоченный кристалл. (б) Здесь показан кристалл белка рибулозо1,5-бифосфаткарбоксилазы, фермента, играющего центральную роль в фиксации CO2 при фотосинтезе. Атомы кристалла рассеивают некоторые лучи, и рассеянные волны усиливают друг друга в определенных точках, регистрируемых в качестве дифракционных пятен (в). Эта дифракционная картина и аминокислотная последовательность белка могут быть использованы для получения атомной модели (г).

Ядерная магнитно-резонансная (ЯМР) спектроскопия

Ядерную магнитно-резонансную (ЯМР) спектроскопию много лет широко используют для анализа структуры небольших белков или белковых доменов. В отличие от рентгеноструктурного анализа, для ЯМР не нужен кристаллический образец. Все, что необходимо, -- это небольшой объем концентрированного раствора белка, помещаемый в сильное магнитное поле. Определенные ядра атомов, в особенности водородные ядра, обладают магнитным моментом или спином. Спин ориентируется вдоль направления сильного магнитного поля, но его можно перевести в хаотическое возбужденное состояние под воздействием радиочастотных импульсов электромагнитного излучения. Когда возбужденные ядра водорода возвращаются в исходную ориентацию, они испускают радиочастотное излучение, которое можно измерить и выразить в виде спектра. Природа испускаемого излучения зависит от окружения каждого атома водорода, и если одно ядро возбуждено, то оно будет влиять на поглощение и испускание других близлежащих ядер. Затем при помощи искусного применения базового метода ЯМР можно различить сигналы водородов различных аминокислотных остатков и измерить малые смещения в этих сигналах, происходящие, если эти ядра водородов лежат достаточно близко для взаимодействия. Поскольку величина этих смещений указывает на расстояние между взаимодействующими парами водородных ядер, метод ЯМР способен давать информацию о расстояниях между частями белковой молекулы. Совмещение этих данных с аминокислотной последовательностью позволяет рассчитать трехмерную структуру белка.

Размещено на Allbest.ru