Ма+,К+-АТФаза як мішень антипроліферативної дії мітоміцину С при лікуванні стриктури уретри

Размещено на http://www.Allbest.Ru/

Львівський національний медичний університет імені Данила Галицького

Nа+,К+-АТФаза як мішень антипроліферативної дії мітоміцину С при лікуванні стриктури уретри

Д.Р. Шеремета,

Д.З. Воробець

Львів, Україна

Резюме

Стриктури уретри здебільшого пов'язані з катетеризацією, трансуретальною хірургією, інфекцією сечовивідних шляхів і травмами. Для лікування чи попередження формування уретральних стриктур у постопераційний період часто застосовується протипухлинний антибіотик мітоміцин С. Він належить до групи алкілуючих агентів, що діють шляхом перехресного зшивання комплементарних ланцюгів ДНК з абсолютною специфічністю і в цьому проявляється його основна антипроліферативна дія. Незважаючи на використання мітоміцину С в медицині протягом тривалого часу, механізм його дії на регуляторні системи клітини мало відомий. З цього огляду актуальним є вивчення впливу вказаного антибіотика на іон-транспортувальні системи, зокрема Nа⁺,К⁺-АТФазу. Дослідження механізму дії мітоміцину С проводили на лімфоцитах периферичної крові практично здорових чоловіків, оскільки лімфоцити вважаються «метаболічним дзеркалом» організму та оперативно реагують на всі зовнішні та внутрішні впливи. Виявлено, що за дії різних концентрацій мітоміцину С в діапазоні 10^-5...10^-3 М величина Nа⁺,К⁺-АТФазної активності дозозалежно зростає і найвищою спостерігається при 10^-3 М концентрації, тобто зростає в 2,6 рази (р<0,01). При збільшенні концентрації АТФ в інкубаційному середовищі і в контролі, і при дії мітоміцину С спостерігалось монотонне зростання активності Nа⁺,К⁺-АТФази з виходом на плато за наявності 2,0-2,5 мМ АТФ. Для з'ясування механізму зміни Nа⁺,К⁺-АТФазної активності лімфоцитів крові при дії мітоміцину С проведено визначення основних кінетичних параметрів у координатах Лайнуівера-Берка. Встановлено, що початкова максимальна швидкість гідролізу АТФ в Nа⁺,К⁺-АТФазній реакції в лімфоцитів крові за дії мітоміцину С (10^-5 М) зростала в 2,5 раза (р<0,001).

Водночас величина константи афінності за дії 10^-5 М мітоміцину С була в 6,7 раза (р<0,05) вищою щодо контролю, що свідчить про зниження спорідненості АТФази до АТФ. Отже, зростання Nа⁺,К⁺-АТФазної активності за дії мітоміцину С, що повинно призводити до зниження концентрації йонів Ма⁺ в цитоплазмі, відбувається за рахунок збільшення числа обертів ензиму. Суттєві зміни в Nа⁺,К⁺-АТФазній активності за дії мітоміцину С можуть свідчити про задіяння цього ензиму в сигнальному каскаді, який регулює проліферацію клітин.

Ключові слова: стриктура уретри, мітоміцин С, Nа⁺,К⁺-АТФаза, лімфоцити.

Annotation

Na+,K+-ATPase as a target of the antiproliferative effect of mitomycin C in the treatment of urethral stricture

D.R. Sheremeta, D.Z. Vorobets, Danylo Halytsky Lviv National Medical University, Lviv, Ukraine

Urethral strictures are mostly associated with catheterization, transurethral surgery, urinary tract infection, and trauma. To treat or prevent the formation of urethral strictures in the postoperative period, the antitumor antibiotic mitomycin C is often used. It belongs to the group of alkylating agents that act by cross-linking complementary DNA chains with absolute specificity, and this is where its main antiproliferative effect is manifested. Despite the use of mitomycin C in medicine for a long time, the mechanism of its action on the regulatory systems of the cell is little known. In this regard, it is relevant to study the effect of this antibiotic on ion transport systems, in particular Na+,K+-ATPase.

The study of the mechanism of action of mitomycin C was carried out on peripheral blood lymphocytes of practically healthy men, since lymphocytes are considered the «metabolic mirror» of the body and promptly respond to all external and internal influences. It was found that under the influence of different concentrations of mitomycin C in the range of 10^-5...10^-3 M, the value of Na+,K+-ATPase activity increases dose-dependently and is the highest at 10^-3 M concentration, that is, it increases by 2.6 times (р<0,01). With an increase in the concentration of ATP in the incubation medium, both in the control and under the action of mitomycin C, a monotonous increase in the activity of Na+,K+-ATPase was observed, reaching a plateau in the presence of 2.0-2.5 mM ATP. In order to find out the mechanism of changes in the Na+,K+-ATPase activity of blood lymphocytes under the action of mitomycin C, the main kinetic parameters were determined in Lineweaver-Burke coordinates. It was established that the initial maximum rate of ATP hydrolysis in the Na+,K+-ATPase reaction in blood lymphocytes under the influence of mitomycin C (10^-5 M) increased by 2.5 times (р<0.001). At the same time, the affinity constant under the action of 10^-5 M mitomycin C was 6.7 times (р<0.05) higher than the control, which indicates a decrease in the affinity of ATPase to ATP.

Thus, the growth of Na+,K+-ATPase activity under the action of mitomycin C, which should lead to an decrease in the concentration of Na+ ions in the cytoplasm, occurs due to an increase in the number of revolutions of the enzyme. Significant changes in Na+,K+-ATPase activity under the action of mitomycin C may indicate the involvement of this enzyme in the signaling cascade that regulates cell proliferation.

Key words: urethral stricture, mitomycin C, Na+,K+-ATPase, lymphocytes.

Вступ

В урології досить часто зустрічаються стриктури уретри, які поділяються на чотири основні групи: ідіопатична, ятрогенна, запальна і травматична [1-4]. Однак щодо причин, то вони здебільшого пов'язані з катетеризацією, трансуретальною хірургією, інфекцією сечовивідних шляхів і травмами [5]. Рецидиви після невдалої уретропластики становлять 18-40% [6]. Для лікування чи попередження формування уретральних стриктур у постопераційний період часто застосовується протипухлинний антибіотик мітоміцин С [7-9]. В хірургії антипроліферативна активність мітоміцину С використовується для запобігання утворенню рубців у тканинах, оскільки рубцеві зміни є одним із ускладнень при оперативних втручаннях [10].

Мітоміцин С, який є антибіотиком природного походження, виділеним із Streptomyces caespitosus [9, 11], належить до групи алкілуючих агентів, що діють шляхом перехресного зшивання комплементарних ланцюгів ДНК з абсолютною специфічністю, і в цьому проявляється його основна антипро- ліферативна дія [11-13]. Він також проявляє максимальний ефект у пізній стадії інтерфази клітинного циклу G₁ та в ранній S, тому пригнічує синтез ДНК і протеїнів. Однак, завдяки своєму токсичному впливу у високих концентраціях, він має обмежене використання як антибіотик.

Незважаючи на використання мітоміцину С в медицині протягом тривалого часу, механізм його дії на регуляторні системи клітини мало відомий. Тому актуальним є вивчення впливу цього антибіотика на іон-транспорту- вальні системи, зокрема Nа⁺,К+-АТФазу.

Відомо, що іони Nа⁺,К⁺-АТФази, окрім загальновідомої ролі у підтриманні мембранного потенціалу шляхом спрямованого переносу трьох іонів натрію (назовні) і двох іонів калію (в клітину) крізь плазматичну мембрану, також можуть бути трансдуктором зовнішньоклітинних сигналів [14-16]. Сигнальними молекулами, які забезпечують активацію цієї функції АТ- Фази, є здебільшого ендогенні уабаїноподібні гормони.

Натрієва помпа також відіграє важливу роль у регуляції внутрішньоклітинної концентрації Са²⁺ ([Ca²⁺]₁). На сьогодні відомо, що між Na⁺,K⁺-AT- Фазою, Na⁺,Са²⁺-обмінником та ендоплазматичним ретикулумом у багатьох тканинах існує прямий механічний зв'язок [14, 16].

К⁺-АТФаза - це іонна помпа, що використовує вільну енергію АТФ у формуванні трансмембранних іонних градієнтів [14]. Він також служить функціональним рецептором для кардіотонічних стероїдів. Зв'язування уабаїну з Na⁺,K⁺-ATФазою може активувати передачу сигналів кальцію клітинно-специфічним способом. Внутрішньоклітинна модуляція йонів кальцію за участі Na⁺,K⁺-ATФази забезпечується здатністю помпи інтегрувати сигнали від численних білкових і небілкових молекул, включаючи транспортери іонів, канали, протеїнкінази/фосфатази, а також внутрішньоклітинні йони Na⁺ [16, 17]. Отже, запускається сигнальний каскад, який забезпечує активацію фосфорилюванням Са²⁺-каналів та інших Са²⁺-транспортуваль- них систем, що впливає на проліферацію клітин [16, 17].

Мета дослідження - вивчення впливу мітоміцину С на Na⁺,K⁺-ATФазну активність плазматичної мембрани лімфоцитів периферичної крові.

Матеріали й методи дослідження. Дослідження проводили на лімфоцитах периферичної крові практично здорових чоловіків, оскільки лімфоцити вважаються «метаболічним дзеркалом» організму та оперативно реагують на всі зовнішні та внутрішні впливи [18, 19].

Лімфоцити периферичної крові виділяли за методом Boyum A. [20]. Кров, розведену в співвідношенні 1:1 фізіологічним розчином, нашаровували у градієнті густини фікол-тріумбрасту (р = 1,08 г/см³) й центрифугували 20 хв при 500 g. Зняті інтерфазні кільця мононуклеарних клітин двічі відмивали впродовж 10 хв фізіологічним розчином [20]. Після останнього центрифугування до осаду лімфоцитів додавали невелику кількість фізіологічного розчину, ресуспензували та фарбували за допомогою трипанового синього. Підрахунок кількості живих і мертвих клітин проводили в камері Горяєва [20]. Цілісність і життєздатність лімфоцитів крові в усіх дослідах становила не менше 95%.

Для пермеабілізації мембран лімфоцитів крові та розкриття латентних ензиматичних активностей до суспензії додавали сапонін [18]. Лімфоцити крові інкубували впродовж 10 хв при помірному струшуванні у розчині, який містив сапонін у концентрації 0,2% (оптимальна концентрація).

Na⁺,K⁺-ATФазну активність лімфоцитів крові визначали, реєструючи процес гідролізу АТФ за накопиченням Р. Після зупинки ензиматичної реакції суспензію центрифугували (10 хв, 1500 g) і в отриманому супернатанті, який не містив протеїну, визначали вміст неорганічного фосфору Р_. за методом W. Rathbun, V. Betlach [14]. Вміст протеїну у лімфоцитарній суміші визначали за модифікованим методом Лоурі.

Варіаційно-статистичне опрацювання даних здійснювали з використанням програмного пакета для персональних комп'ютерів Microsoft Excel. Достовірність змін встановлювали за t-критерієм Стьюдента. Критичні рівні достовірності під час перевірки статистичних гіпотез у дослідженнях брали рівними 0,95, 0,99 та 0,999. Результати представлені як середнє арифметичне (M) ± стандартна похибка середнього (m).

протипухлинний антибіотик мітоміцин уретральний стриктура

Результати дослідження та їх обговорення

Вивчення АТФ-гідролазних систем, зокрема Na⁺,K⁺-АТФази плазматичної мембрани при патологічних процесах чи механізмах дії лікарських препаратів є актуальним, оскільки Na⁺ прямо чи опосередковано регулює низку внутрішньоклітинних процесів [14, 15]. Na⁺,K⁺-АТФаза здійснює відповідне перенесення йонів Na⁺ і K⁺ крізь мембрану проти їх електрохімічних градієнтів і таким чином формує мембранний потенціал та підтримує внутрішньоклітинний гомеостаз цих йонів.

У результаті проведених досліджень встановлено, що Na⁺,K⁺-ATФазна активність лімфоцитів практично здорових осіб становила (6,3±0,4) мкмоль Р./хв на 1 мг протеїну (рис. 1). Проте абсолютні значення Na⁺,K⁺-ATФаз- ної активності відрізняються від інших даних, що може бути обумовлено значною варіабельністю активності Na⁺,K⁺-ATФази в медико-біологічних дослідженнях, а також різними методологічними підходами, які використовуються при визначенні активності Na⁺,K⁺-ATФази.

Рис. 1. Вплив мітоміцину С на Na⁺,K⁺-АТФазну активність лімфоцитів крові (M ± m, n = 8).

Примітка: *р<0,05; **р<0,01 стосовно контролю (за відсутності мітоміцину С).

За дії різних концентрацій мітоміцину С в діапазоні 10'...10^-3 М величина Na⁺,K⁺-АТФазної активності дозозалежно зростала і найвищою була при 10^-3 М концентрації - (16,2±2,3) мкмоль Р./хв на 1 мг протеїну (р<0,05), тобто в 2,6 раза. Ці результати щодо зростання АТФазної активності при дії мітоміцину С узгоджуються з даними, отриманими дослідниками раніше на інших об'єктах [21].

Зміни Na⁺,K⁺-ATФазної активності лімфоцитів крові свідчать про порушення функціональної активності імунокомпетентних клітин. Це може зумовлюватися різними впливами на біомембрану загалом і на Na⁺,K⁺-AT- Фазу зокрема зі сторони мітоміцину С. Отож припустимо, що важливим механізмом дії мітоміцину С, який широко використовується для запобігання та лікування стриктур уретри [22], може бути такий, в який задіяна Ха'.К'-АТФаза.

Зміни активності Nа⁺,К⁺-АТФази також можуть опосередковуватись через інші регуляторні системи клітини, в яких задіяні внутрішньоклітинні месенджери - іони Са²⁺, NO, цАМФ.

Проте патофізіологічні механізми, що призводять до АТФ-гідролазної дисфункції, остаточно не з'ясовані. Для з'ясування механізмів, які лежать в основі цих змін, проведено кінетичний аналіз АТФ-гідролазної реакції за участі Na⁺,K⁺-ATФази лімфоцитів крові при дії мітоміцину С.

Відомо, що Nа⁺,К⁺-АТФаза каталізує енергозалежне транспортування одновалентних йонів Nа⁺ і К⁺ через цитоплазматичну мембрану проти їх електрохімічного градієнта. Для цього ензим використовує енергію гідролізу АТФ [8]. Тому зміни концентрації АТФ в інкубаційному середовищі впливатимуть на швидкість АТФ-гідролазної реакції.

Для з'ясування залежності швидкості Na⁺,K⁺-ATФазної реакції від концентрації АТФ лімфоцити крові інкубували в стандартному середовищі, що містило АТФ у діапазоні концентрацій від 0,1 до 2,5 мМ (за сталої концентрації йонів Mg²⁺ 5 мМ). При збільшенні концентрації АТФ в інкубаційному середовищі спостерігалось монотонне зростання активності Na⁺,K⁺-ATФази з виходом на плато за наявності 2,0-2,5 мМ АТФ (рис. 2).

Як можна бачити з рис. 2, у всьому діапазоні досліджуваних концентрацій субстрату активність Na⁺,K⁺-ATФази лімфоцитів крові при дії мітоміцину С була вищою порівняно з величиною за відсутності мітоміцину С.

Рис. 2. Концентраційна залежність впливу АТФ на Na⁺,K⁺-ATФазну активність (M±m, n = 8).

Для з'ясування механізму зміни Na⁺,K⁺-ATФазної активності лімфоцитів крові при дії мітоміцину С проведено визначення основних кінетичних параметрів у координатах Лайнуівера-Берка (рис. 3).

Рис. 3. Лінеаризація концентраційних кривих впливу АТФ на Na⁺,K⁺-ATФазну активність лімфоцитів крові при дії мітоміцину С в координатах Лайнуівера-Берка, (M±m, n = 8).

Шляхом інтерпретації отриманих даних обчислено максимальну швидкість Na⁺,K⁺-активованого, Mg²⁺-залежного гідролізу АТФ та константу афінності Na⁺,K⁺-ATФази до АТФ (рис. 4 і рис. 5). Встановлено, що початкова максимальна швидкість гідролізу АТФ в Na⁺,K⁺-ATФазній реакції в лімфоцитів крові за дії мітоміцину С (10^-5 М) зростала в 2,5 раза. Так, значення початкової максимальної швидкості гідролізу АТФ лімфоцитами крові в контролі становило (7,1±0,7) мкмоль Р./хв на 1 мг протеїну. Початкова максимальна швидкість гідролізу АТФ за дії 10^-5 М мітоміцину С дорівнювала (17,5±1,8) мкмоль Р/хв на 1 мг протеїну.

Рис. 4. Початкова максимальна швидкість гідролізу АТФ в Na⁺,K⁺-ATФазній реакції при дії мітоміцину С (10^-5 М), (M±m, n = 8).

Примітка: ***р<0,001 стосовно контролю (за відсутності мітоміцину С).

Водночас величина константи афінності за дії 10^-5 М мітоміцину С була в 6,7 рази вищою щодо контролю. Так, значення константи афінності в контролі становили (0,14±0,05) мМ, а при дії мітоміцину С - (0,66±0,09) мМ, що свідчить про зниження спорідненості АТФази до АТФ. Отримані величини константи афінності знаходяться в субмілімолярному діапазоні концентрацій, що відповідає фізіологічній концентрації [Mg АТФ] у цитоплазмі.

Рис. 5. Константа спорідненості (К_АТФ) На⁺,К⁺-АТФази до АТФ при дії мітоміцину С (10^-5 М), (M±m, n = 8).

Примітка: *р<0,05 стосовно контролю (за відсутності мітоміцину С).

Отже, за умов впливу мітоміцину С на Na⁺,K⁺-ATФазну активність її зростання відбувається за рахунок збільшення числа обертів ензиму, але не за рахунок зростання спорідненості.

Висновки

1. Мітоміцин С спричиняє зростання Na⁺,K⁺-ATФазної активності в клітинах, що повинно призводити до зниження концентрації Na⁺ в цитозолі.

2. Зростання Na⁺,K⁺-ATФазної активності за дії мітоміцину С відбувається за рахунок збільшення числа обертів ензиму.

3. Суттєві зміни в Na⁺,K⁺-ATФазній активності за дії мітоміцину С можуть свідчити про задіяння цього ензиму в сигнальному каскаді, який регулює проліферацію клітин.

Посилання

1. Abdeen B.M, Badreldin A.M. Urethral Strictures. StatPearls [Internet]. 2022;17:1-15.

2. Palminteri E., Berdondini E., Verze P., De Nunzio C., Vitarelli A., Carmignani L. Contemporary urethral stricture characteristics in the developed world. Urology. 2013;81(1):191-196.

3. Maciejewski C., RourkeK. Imaging of urethral stricture disease. Transl. Urol. 2015;4(1):2- 9.

4. Rourke K.F., Welk B., Kodama R. et al. Canadian Urological Association guideline on male urethral stricture. Can. Urol. Assoc. J. 2020;14(10):305-316.

5. Smith T.G. Current management of urethral stricture disease. Indian J. Urol. 2016;32:27- 33.

6. Vanni A.J., Zinman L.N., Buckley J.C. Radial urethrotomy and intralesional mitomycin C for the management of recurrent bladder neck contractures. J. Urol. 2011;186(1):156-160.

7. Noureldin Y.A., Abdallah Fathy A., Ahmed S. et al. Intralesional injection of mitomycin C following internal urethrotomy of de novo bulbar urethral stricture: New experience using a novel adjustable-tip needle. Arab. Journal of Urology. 2021;19(4):473-479.

8. Park J.J., Kuo T.L., Chapple C.R. Mitomycin C in the treatment of anterior urethral strictures. Nature Reviews Urology. 2018;15:717-718.

9. Kurt O., Gevher F., Yazic C.M. et al. Effect of mitomycin - C and triamcinolone on preventing urethral strictures. Int. Braz. J. Urol. 2017;43(5):939-945.

10. Sinitsky M.Y., Kutikhin A., Tsepokina A. et al. Mitomycin C induced genotoxic stress in endothelial cells is associated with differential expression of proinflammatory cytokines. Mutation Research. 2020;858-860.

11. Lee Y.J., Park S.J., Ciccone S.L., Kim C.R., Lee S.H. An in vivo analysis of MMC-induced DNA damage and its repair. Carcinogenesis. 2006;27(3):446-53.

12. Al-Otaibi W.A., Alkhatib M.H., Wali A.N. Cytotoxicity and apoptosis enhancement in breast and cervical cancer cells upon coadministration of mitomycin C and essential oils in nanoemulsion formulations. Biomed. Pharmacother. 2018;106:946-955.

13. Granada J.F., Ensenat D., Keswani A.N. et al. Single perivascular delivery of mitomycin C stimulates p21 expression and inhibits neointima formation in rat arteries. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2005;25:2343-2348.

14. Pirahanchi Y., Jessu R., Aeddula N.R. Physiology, sodium potassium pump. StatPearls [Internet]. 2023;13:1-7

15. Clausen M.V., Hilbers F., Poulsen H. The Structure and function of the Na,K-ATPase isoforms in health and disease. Front Physiol. 2017;8:371.

16. Pivovarov A.S., Calahorro F., Walker R.J. Na⁺/K⁺-pump and neurotransmitter membrane receptors. Invertebrate Neuroscience. 2019;19(1):1-7.

17. Tian J., Xie Z-J. The Na/K-ATPase and calcium signaling microdomains. Physiology (Bethesda). 2008;23:205-211.

18. Фафула Р.В., Ефремова У.Р., Мельник О.В., Воробець З.Д., Кулачковський О.Р. Методологічний підхід до вивчення ензиматичного спектру лімфоцитів при патологічних станах з використанням детергента сапоніну (ультраструктурне дослідження). Вісник проблем біології та медицини. 2012;4(96):163-166.

19. Orakpoghenor O., Avazi D.O., Markus T.P., Olaolu O.S. Lymphocytes: A Brief Review. Sci J Immunol Immunother. 2019;3(1): 004-008.

20. Лаповець Л., Луцик Б. Лабораторна імунологія. К.: Арал, 2004. 173 c.

21. Wakizaka A., Imai H., Aiba N., Okuhara E. Enhanced ATPase activity in liver cell nuclei induced by administration of mitomycin C to rats. Jpn J Cancer Res. 1989;80(12):1206-11.

22. Pranata F.H., Hidayatullah F., Kloping Y.P. et al. The efficacy and safety of mitomycin C intra urethral injection to prevent recurrent urethral stricture: A systematic review and meta-analysis. Ann Med Surg (Lond). 2022;77:103576.

Размещено на Allbest.Ru