Молекулярно-генетичні дослідження ізолятів Listeria monocytogenes, виділених від різних видів тварин в Україні

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національний науковий центр «Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини»

Молекулярно-генетичні дослідження ізолятів listeria monocytogenes, виділених від різних видів тварин в Україні

Полюшко Д.П., Стегній Б.Т., Марченко Н.В., Болотін В.І.

Харків, Україна

Анотація

Визначено ПЛР-профілі 12 архівних культур лістерій, що були виділені від різних видів тварин і зберігаються в колекції мікроорганізмів ННЦ «ІЕКВМ». Встановлено, що 10 ізолятів налічують гени prs, inlB, inlA, inlC, inlJ, actA, plcB, hly, iap, що характеризує їх як високовірулетних. Ізолят L. monocytogenes 61052 не містив ген іпіА, а у L. monocytogenes Varja не виявлено гени actA та hly. За допомогою ПЛР встановлено також приналежність 11 досліджуваних культур до серотипів 4b, 4d, 4e, а також одного ізоляту до 1/2а. Отримані дані можуть бути використані для вдосконалення діагностики лістеріозів тварин в Україні за рахунок створення високоспецифічних антигенів

Ключові слова: лістеріоз, полімеразна ланцюгова реакція, фактори вірулентності

Abstract

MOLECULAR GENETIC STUDIES OF LISTERIA MONOCYTOGENES ISOLATES FROM DIFFERENT ANIMAL SPECIES IN UKRAINE

Poliushko D. P., Stegniy B. T, Marchenko N. V., Bolotin V I.

National Scientific Center “Institute of Experimental and Clinical Veterinary Medicine”, Kharkiv, Ukraine

The PCR-profiles of 12 archival cultures of listeria isolated from different species of animals and stored in the collection of microorganisms of the NSC IECVM were determined. It was established that 10 isolates have genes prs, inlB, inlA, inlC, inlJ, actA, plcB, hly, iap, which characterizes them as highly virulent. The L. monocytogenes 61052 isolate did not contain the inlA gene, and the actA and hly genes were not detected in L. monocytogenes Varja. Using PCR, it was also established that 11 studied cultures belong to serotypes 4b, 4d, 4e, as well as one isolate to 1/2a. The obtained data can be used to improve the diagnosis of animal listeriosis in Ukraine due to the creation of highly specific antigens

Keywords: listeriosis, polymerase chain reaction, virulence factors

На цей час рід Listeria включає шість видів, з яких епізоотичне та епідеміологічне значення мають L. monocytogenes та L. ivanovii. Для людини основним джерелом збудника є продукти харчування, у тому числі молочні, сире м'ясо, риба, а також свіжі фрукти та овочі [8, 12]. Також лістерії виділяють від хворих тварин, контамінованого ґрунту, поверхневих вод і деяких рослин. Тварини є носіями збудника, які виділяють його з фекаліями, молоком та плацентою. Так, близько 20 % клінічно здорового поголів'я ВРХ виділяють L. monocytogenes з фекаліями, у т.ч. підтипи, що можуть викликати спорадичні, або ензоотичні спалахи лістеріозу, призводячи до втрат серед продуктивних тварин, масових абортів та ризиків зараження персоналу в господарствах [7, 18]. Збудник викликає значне занепокоєння, оскільки смертність може сягати від 50 % до 90 % залежно від клінічної форми захворювання, виду тварини, його резистентності, тощо. L. monocytogenes вважається стійким у зовнішньому середовищі патогеном, здатним витримувати низькі температури, високу концентрацію солей і широкий діапазон pH (до 9,0) [8,11].

На цей час у бактерій роду Listeria описано 15 соматичних (О) та 5 джгутикових (Н) антигенів, за комбінацією яких L. monocytogenes розподіляють на 13 серотипів: 1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4ab, 4b, 4c, 4d, 4e і 7. Додатково серотип 4h був описаний Yin Y та іншими як гіпервірулентний варіант, що є поєднанням декількох серотипів. Близько 90 % випадків лістеріозу у людини обумовлюють серотипи 1/2a, 1/2b, 4b, та 3а [13, 17, 30].

Основними факторами патогенності L. monocytogenes служать поверхневі інвазини (InlA, ПіВ, ПіС, InlJ), лістеріолізин О (hly), бактеріальний поверхневий білок (ActA), специфічна фосфоліпаза С (plcA та plcB) та р60 - білок пов'язаний з інвазією, що кодується геном iap. Всі перелічені фактори регулюються білком PrfA, окрім р60 [20, 29]. Таке розмаїття викликане високими адаптаційними можливостями збудника, його здатністю набувати стійкість через передачу генетичного матеріалу інших видів бактерій [9]. Завдяки своїм властивостям лістерії можуть забруднювати широкий спектр харчових продуктів, що вимагає постійного моніторингу [15]. лістерія мікроорганізм антиген

Метою досліджень було охарактеризувати архівні штами та ізоляти Listeria monocytogenes за допомогою молекулярно-генетичних методів.

Матеріали та методи. Для дослідження були обрані 12 архівних штамів та польових ізолятів L. monocytogenes з колекції мікроорганізмів ННЦ «ІЕКВМ», що були раніше типовані бактеріологічними методами (табл. 1).

Таблиця 1 -- Перелік штамів L. monocytogenes, що використовували в дослідженні

Для відновлення з ліофільного стану і культивування лістерій використовували м'ясо - пептонний агар та середовище Мартена з додаванням 1 г глюкози на 100 мл середовища.

Екстракцію ДНК проводили за допомогою набору «Indispin Pathogen Kit» згідно з інструкцією виробника. Реакцію ампліфікації проводили за допомогою комерційного набору для ПЛР «Thermo Scientific Dream Taq Green PCR MasterMix». Перелік використаних у дослідженні праймерів наведений у табл. 2.

ПЛР проводили відповідно протоколів з використанням ампліфікатора виробництва компанії Biometra. В якості негативного контролю використовували деіонізовану воду.

Продукти ампліфікації піддавали електрофоретичному аналізу (110В, 300 мА) в 1,5 % агарозному гелі протягом 60 хв. Визначення довжини утворених ампліконів проводили за допомогою маркера молекулярної ваги Fast Gene 100 bp DNA Ladder RTU Nippon genetics Europe GmbH за допомогою системи візуалізації BioradGelDoc Universalhood II (USA).

Результати і обговорення. Було проаналізовано 12 культур L. monocytogenes, що зберігаються в ліофільно висушеному стані в умовах колекції мікроорганізмів лабораторії вивчення бруцельозу. Так, на першому етапі перевіряли наявність генів prs та inlB (рис. 1, 2). Дані маркери широко використовуються для детекції лістерій методом ПЛР [6, 19]. Ген prs є загальнородовим маркером, присутнім у всіх видах роду Listeria, окрім L. rocourtiae, та який кодує фермент фосфорибозилпірофосфатсинтетазу, [16]. Ген inlB є видоспецифічним для monocytogenes і кодує один з мембранних білків інтерналінів, завдяки яким збудник проникає в клітини господаря. Ключова роль інтерналіну В (InlB) полягає в тому, що він індукує фагоцитоз, переважно клітин гепатоцитів, а також бере участь у формуванні біоплівок [28].

Отримані результати показують, що всі ізоляти лістерій містять зазначені гени, що підтверджує попередні результати типування збудників бактеріологічними методами.

Також нами було проведено дослідження щодо наявності інших маркерів патогенності лістерій з групи інтерналінів, а саме іпіА, inlC та inlJ (рис. 3). На відміну від іпіВ, ці гени кодують поверхневі білки, які індукують фагоцитоз в макрофагах, ентероцитах та епітеліальних клітинах, адсорбуючись на поверхні цих клітин [26].

Таблиця 2 -- Послідовності праймерів, що були використані під час досліджень

Рис. 1. Електрофорез продуктів ампліфікації специфічної ділянки гена prs (350 п.н.) культур L. monocytogenes: M - маркер молекулярної ваги; 1-12 культури L. monocytogenes; N - деіонізована вода.

Рис. 2. Електрофорез продуктів ампліфікації специфічної ділянки гена inlB (272 п.н) культур L. monocytogenes: M - маркер молекулярної ваги; 1 -12 культури monocytogenes; N - деіонізована вода.

Встановлено, що всі культури містили досліджувані фактори патогенності, окрім ізоляту L monocytogenes 61052, який не містив ген /n/А. Цей ізолят був виділений від ВРХ.

Третій етап дослідження був спрямований на виявлення генів h/y, iap та actA (рис. 4). Для цього проводили мультиплексну ПЛР для одночасного виявлення зазначених генів. Перший з них відповідає за синтез лістеріолізину O (LLO) - білка, що є відповідальним за стійкість збудника до фагосом і внутрішньоклітинне розмноження лістерій.

Рис. 3. Електрофорез продуктів ампліфікації ділянок генів /n/А (800 п.н.), /n/С (517 п.н.) та in/J (238 п.н) культур L. monocytogenes. M - маркер молекулярної ваги; 1-12 культури L. monocytogenes; N - деіонізована вода.

Рис. 4. Електрофорез продуктів ампліфікації ділянок генів actA (431 п.н.), h/y (372 п.н.) та iap (205 п.н) культур L. monocytogenes: M - маркер молекулярної ваги; 1 -12 культури L. monocytogenes; N - деіонізована вода.

Роль позаклітинного білку p60, що кодується геном iap, полягає у інвазії фагоцитів і також у розмноженні лістерій. [29]. Актиновий білок (ActA) є найбільш поширеним поверхневим секреторним бактеріальним білком, виявленим в інфікованих клітинах, який приймає участь у внутрішньоклітинному розмноженні лістерій і передачі збудника від клітини до клітини. [21]. Відповідно до отриманих результатів тільки ізолят, отриманий від абортплоду собаки, не містив гени actA та h/y, що свідчить про його послаблені вірулентні властивості. Також досліджували наявність гена p/cB (рис. 5), що є відповідальним за синтез специфічних фосфоліпаз С для підсилення лістеріолизину О, що в свою чергу сприяє більш ефективному лізису вакуолей фагоцитів [2, 27]. Виходячи з отриманих результатів всі лістерії мали ген p/cB. Отже, за проведеними дослідженнями встановлено ПЛР-профілі культур L. monocytogenes, що зберігаються в колекції ННЦ «ІЕКВМ» (табл. 3).

Для виявлення факторів вірулентності, що пов'язані з окремими фрагментами гена prs: /mo0737, /m1118, ORF2819 та ORF2110, проводили мультиплексну ПЛР (рис. 6). Ці фактори забезпечують надійне прикріплення бактерій до чутливих клітин. Також на основі зазначених маркерів було запропоновано методику визначення серотипу збудника, оскільки встановлення цього серологічними методами потребує вартісних моноклональних сироваток [14]. Так, якщо виявляють тільки ген /mo0737, то такий ізолят відносять до серотипу 1/2а або 3a, а наявність тільки гена ORF2819 -- до 1/2b, 3b або 7. До серотипів 1/2c або 3с можна віднести лістерії, в яких виявлено гени /mo0737 та /mo1118, а якщо ORF2819 та ORF2110 -- до 4b, 4d або 4e [4, 7, 23].

За результатами цих досліджень встановлено, що тільки ізолят від ВРХ можна віднести до серотипу 1/2а або 3a, а всі інші мають однаковий профіль, який включає ділянки генів ORF2819 та ORF2110, тобто їх можна віднести до серотипів 4b, 4d або 4e.

Культури лістерій також досліджували за альтернативною методикою, яка включає детекцію генів f/aA (lm_0690), LMOSLCC2372_0308 та LMLG_0742. Ген f/aA кодує флагелін - джгутиковий протеїн, що дозволяє уникати протизапального ефекту викликаного контактом з Toll-like receptor (TLR), тим самим забезпечуючи виживання та подальше розмноження збудника. Наявність цього гена свідчить про належність лістерії до серотипу 1/2а або 3a. Гени LMOSLCC2372_0308 та LMLG_0742 кодують гіпотетичні протеїни, функції яких ще не повністю визначені. За цими генами можна визначити приналежність до серотипу 1/2с або 3а відповідно [1].

Рис. 5. Електрофорез продуктів ампліфікації ділянки гена plcB (792 п.н.) культур L. monocytogenes: M - маркер молекулярної ваги; 1-12 культури L. monocytogenes; N - деіонізована вода.

Рис. 6. Електрофорез продуктів ампліфікації ділянки генів lmo0737 (691 п.н.), lmo1118 (906 п.н.), ORF 2819 (471 п.н.) та ORF 2110 (597 п.н.) культур L. monocytogenes: M - маркер молекулярної ваги; 1 -12 культури L. monocytogenes; N - деіонізована вода.

Таблиця 3 -- Результати ПЛР з досліджуваними ізолятами L. monocytogenes на виявлення відповідних таргентних ділянок.

Примітки: (+) - утворення специфічного амплікону; (-) - відсутність утворення специфічного амплікону.

Цю методику використовували для визначення серотипу ізоляту L. monocytogenes 61052, який на попередньому етапі за вмістом окремих генів віднесли до серотипа 1/2а або 3a. Результати цих досліджень показано на рис. 7. Таким чином, спостерігали чітке утворення амплікону розміром 538 п.н., що вказує на наявність гена lm_0690 та належність ізоляту до серотипу 1/2а. Інші специфічні ділянки генів LMOSLCC2372_0308 та LMLG_0742 виявлені не були. За даною методикою також було досліджено решта культур лістерій, що були віднесені до серотипу 4b (4d, 4e). Виявилося, що вісім з них містили специфічну ділянку ділянці гена LMLG_0742 (рис. 8). Оскільки зазначена методика була розроблена для диференціації виключно серотипів 1/2а, 3а та 1/2с, наявність цієї ділянки в геномі наших архівних культур потребує додаткових досліджень. Разом з тим, раніше вже повідомлялося про те, що серотип 4b може мати нетиповий профіль за ПЛР [5, 10]. Отже, було виявлено, що 10 культур лістерій містять всі основні гени вірулентності, та належать до серотипу 4b (або 4d, або 4e) (табл. 4). Ще один ізолят, віднесений до цього серотипу та отриманий з абортплоду собаки, не має гени actA та hly або мутації не дозволяють повноцінно синтезувати їх in vitro обраними праймерами, що може бути предметом для подальших досліджень.

Рис. 7. Електрофорез продуктів ампліфікації ділянок окремих генів lm_0690, LMOSLCC2372_0308 та LMLG_0742 культури L. monocytogenes 61052: M - маркер молекулярної ваги; S - зразок ДНК культури; N - деіонізована вода.

Рис. 8. Електрофорез продуктів ампліфікації ділянки гена LMLG_0742 (388 п.н.) культур L monocytogenes: M - маркер молекулярної ваги; 1-12 культури L. monocytogenes; N - деіонізована вода.

Патогенність L. monocytogenes доведена, зокрема за наявність групи інтерналінів, бактеріальних поверхневих білків відповідаючих за входження збудника в клітини, зокрема фаго- та гепатоцити і розповсюдження між клітинами.

Група, для якої збудники представляють потенційну загрозу, включає ДРХ, ВРХ, свиней, переважно вагітних самок, молоді тварини віком від 1,5 до 5 місяців, ослаблені неповноцінною годівлею чи хворобою тварини, а також різноманітні птахи, дрібні ссавці та навіть риба [3].

Таким чином, встановлено належність однієї культури лістерії до серотипу 1/2а, а інших - до 4b ( або 4d, або 4e). Необхідно зазначити, що поліморфізм та виникнення мутацій у послідовностях генів сприяє адаптації до несприятливих факторів та може призводити до ослаблення вірулентності L. monocytogenes [24].

Таблиця 4 -- Узагальнюючі дані за результатами ПЛР з метою визначення серотипу лістерій

Примітки: * - LMOSLCC2372_0308; # - LMLG_0742; (+) - утворення специфічного амплікону; (-) - відсутність утворення специфічного амплікону.

Виходячи з цього, відсутність або наявність тих чи інших генів вірулентності може бути інструментом для підтвердження потенційної патогенності досліджуваних штамів, оцінки ризиків спалаху захворювання в господарствах, потенційного зараження людини через харчові продукти, отримані від інфікованих тварин [22, 25].

Раніше повідомлялося, що в Україні рівень захворюваності на лістеріоз серед тварин значно зріс у період 2011-2015 рр. При цьому випадки реєстрували в 10 областях (найбільший відсоток припадав на Житомирську та Дніпропетровську області) [31]. Ця тенденція може бути обумовлена відсутністю надійних вакцин проти лістеріозу та несвоєчасним виявленням джерела інфекції, що спонукає до більш детального вивчення циркулюючих ізолятів, проведення постійного моніторингу щодо лістеріозу тварин і розроблення дієвої системи контролю цієї інфекції.

Висновки

1. Охарактеризовано 12 архівних культур L. monocytogenes з використанням молекулярно-генетичних методів. Встановлено, що всі культури містять фактори вірулентності inlA, inlB, inlC, inlJ, actA, pIcB, hly, iap, окрім двох - L. monocytogenes Varja, яка не містила inlA, та L. monocytogenes 61052, в якої не було виявлено actA і hly.

За допомогою відповідних протоколів ПЛР встановлено належність однієї культури лістерії до серотипу 1/2а, а інших - до 4b (або 4d, або 4e). Отримані дані можуть бути використані для вдосконалення діагностики лістеріозів тварин в Україні за рахунок створення високо специфічних антигенів.

Список літератури

1. Al-Ali H. J. (2018). Molecular detection ofserotype groups of Listeria monocytogenes isolated from gallbladder of cattle and sheep in Iraq. Veterinary World. 2018. Vol. 11, No 4. P 431-436.

2. Alberti-Segui C., Darren R., Higgins E. Differential function of Listeria monocytogenes listeriolysin O and phospholipases C invacuolar dissolution following cell-to-cell spread. Cellular Microbiology. 2007. Vol. 9. P. 179-184.

3. Al-Ghanim A., Abbas B. Detection of Listeria monocytogenes in frozen food using a specific inlB virulence gene. Journal of Physics: Conference Series. 2021. Vol. 66. P 328-333.

4. Boukili M. et al. Prevalence, characterization and antimicrobial resistance of Listeria monocytogenes isolated from beef meat in Meknes city, Morocco. Germs. 2020. Vol. 10, No 2. P 74-80. DOI: https://doi.org/10.18683/germs. 2020.1180.

5. Camargo A. C. et al. Molecular Serogrouping of Listeria monocytogenes from Brazil Using PCR. Journal of Food Protection. 2016. Vo. 79, No 1. P 144-147.

6. Cao X. et al. Isolation and characterization of Listeria monocytogenes from the blackheaded gull feces in Kunming, China. Journal of Infection and Public Health. 2018. Vol. 11. P 59-63.

7. Doumith M. et al. Differentiation of the major Listeria monocytogenes serovars by multiplex PCR. Journal of Clinical Microbiology. 2004. Vol. 42, No 8. P 3819-3822.

8. Gandhi M., Chikindas M. L. Listeria: A foodborne pathogen that knows how to survive. International Journal of Food Microbiology. 2007. Vol. 113, No 1. P 1-15.

9. Hingston P et al. Genotypes associated with Listeria monocytogenes isolates displaying impairedor enhanced tolerancesto cold, salt, acid, or desiccation stress. Frontiers in Microbiology. 2017. Vol. 8 P 369-378.

10. Huang B. et al. Observation of a new pattern in serogroup-related PCR typing of Listeria monocytogenes 4b isolates. Journal of Clinical Microbiology. 2011. Vol. 49. P 426-429.

11. Johnson J. et al. Natural atypical Listeria innocuastrains with Listeria monocytogenes pathogenicity genes. Applied and Environmental Microbiology. 2004. Vol. 70, No 7. P 4256-4258.

12. Kasalica A. et al. Listeria monocytogenes in milk and dairy products. Biotechnology in Animal Husbandry. 2011. Vol. 27, No 3. P 1067-1082.

13. Nightingale K. Listeria monocytogenes: knowledge gained through DNA sequence-based subtyping, implications, and future considerations. Journal of AOAC International. 2010. Vol. 93, No 4. P 1275-1286.

14. Kerouanton A. et al. Evaluation of a multiplex PCR assay as an alternative method for Listeria monocytogenes serotyping. Journal of Microbiological Methods. 2010. Vol. 80, No 2. P 134-137.

15. Leong D., Alvarez-Ordonez A., Jordan K. (2014). Monitoring occurrence and persistence of Listeria monocytogenes in foods and food processing environments in the Republic of Ireland. Frontiers in Microbiology. 2014. Vol. 5. P. 436.

16. Liu D. et al. A multiplex PCR for species- and virulence-specific determination of Listeria monocytogenes. Journal of Microbiological Methods. 2007. Vol. 71, No 2. P 133-140.

17. Lopez-Valladares G. et al. Human isolates of Listeria monocytogenes in Sweden during half a century (1958-2010). Epidemiology & Infection. 2014. Vol. 142. P 2251-2260.

18. Matereke L., Okoh A. Listeria monocytogenes virulence, antimicrobial resistance and environmental persistence. A Review. Pathogens. 2020. Vol. 9, No 7. P 528.

19. Momtaz H., Yadollahi S. Molecular characterization of Listeria monocytogenes isolated from fresh seafood samples in Iran. Diagnostic Pathology. 2013. Vol. 8. P 149.

20. Moors M. A. et al. Expression of listeriolysin O and ActA by intracellular and extracellular Listeria monocytogenes. Infection and Immunity. 1999. Vol. 67, No 1. P 131-9.

21. Moors M. A. et al. Expression of listeriolysin O and ActA by intracellular and extracellular Listeria monocytogenes. Infection and Immunity. 1999. Vol. 67, No 1. P 131-139.

22. Muchaamba F. et al. Different shadesof Listeria monocytogenes: strain, serotype, and lineage-based variability in virulence and stress tolerance profiles. Frontiers in Microbiology. 2022. Vol. 12 P 792-811.

23. Nho S. W. et al. Identification of high-risk Listeria monocytogenes serotypes in lineage I (serotype 1/2a, 1/2c, 3a and 3c) using multiplex PCR. Journal of Applied Microbiology. 2015. Vol. 119, No 3. P 845-852.

24. Orsi R., Bakker H., Wiedmann M. Listeria monocytogenes lineages: Genomics, evolution, ecology, and phenotypic characteristics. International Journal of Medical Microbiology. 2011. Vol. 301, No 2. P 79-83.

25. Parussolo L. et al. Detection of virulence gene sandanti microbial suscepti bilityprofile of Listeria monocytogenes isolates recovered fromartisanal cheese producedin the Southern regionof Brazil. Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 2021. Vol. 93, No 3. P 207-208.

26. Portnoy D. A. et al. Capacity of listeriolysin O, streptolysin O, and perfringolysin O to mediate growth of Bacillus subtilis within mammalian cells. Infection and Immunity. 1992. Vol. 60, No 7. P 2710-2717.

27. Quereda J. J. et al. Role in virulence of phospholipases, listeriolysin O and listeriolysin S from epidemic Listeria monocytogenes using the chicken embryo infection model. Veterinary Research. 2018. Vol. 49. P 13.

28. Wisniewski P et al. Antimicrobial resistance and virulence characterization of Listeria monocytogenes strains isolated from food and food processing environments. Pathogens. 2022. Vol. 11, No 10. P 1099.

29. Wuenscher M. D. et al. The iap gene of Listeria monocytogenes is essential for cell viability, and its gene product, p60, has bacteriolytic activity. Journal of Bacteriology. 1993. Vol. 175, No 11. P 3491-3501.

30. Yin Y et al. A hybrid sub-lineage of Listeria monocytogenes comprising hypervirulent isolates. 2019. Nature Communications. Vol. 10, No 1. P 4283.

31. Уховська Т М. та ін. Моніторинг лістеріозу тварин та засоби його профілактики. Ветеринарна медицина. 2017. Т 103 С. 222-226.

Размещено на Allbest.ru