Покрокова методика визначення мінімальної інгібуючої концентрації гідрофобної біологічно-активної сполуки методом розведення з бульйоном

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Запорізька обласна клінічна лікарня

Покрокова методика визначення мінімальної інгібуючої концентрації гідрофобної біологічно-активної сполуки методом розведення з бульйоном

З 2007 року основним нормативним документом, який регламентував методи визначення чутливості мікроорганізмів до антибіотиків і містив референтні значення, щодо яких проводилося порівняння та визначення резистентних штамів, був Наказ Міністерства охорони здоров'я (МОЗ) України «Про затвердження методичних вказівок «Визначення чутливості мікроорганізмів до антибактеріальних препаратів» від 05.04.2007 року №167 [1]. Проте, значення щодо медично важливих збудників інфекцій, внесені до цього наказу, суттєво відрізнялися від європейських стандартів чутливості Європейського комітету з тестування антимікробної чутливості (EUCAS^ [2]. Так, згідно EUCASТ за категоріями чутливості мікроорганізмів до антибіотиків, виділяли «чутливий при підвищеній експозиції» (І), «чутливий у стандартній дозі» (S) та резистентний (R). Вже у 2018 році у МОЗ України був затверджений Наказ «Про внесення змін до додатка 4 до Методики розробки та впровадження медичних стандартів медичної допомоги на засадах доказової медицини» №1752 від 26.09.2018 року, відповідно до якого перелік джерел клінічних настанов доповнювався матеріалами EUCAST[3]. Більш того, у наступному 2019 році Кабінетом Міністрів України був затверджений «Національний план дії щодо боротьби зі стійкістю до протимікробних препаратів» [4], що привело до визнання у 2021 році низки нормативних документів, в тому числі і Наказу №167, такими, що втратили чинність [5].

Мета: Підтримання стабільності у всіх сферах життя є одним із пріоритетів сьогодення, через те, що на даний час на Україні йде війна з російською федерацією [6]. Незважаючи на те, що максимальні ресурси спрямовані на прискорення перемоги та забезпечення Збройних Сил і безпеки мирного населення, навіть у місті Запоріжжя, яке розташоване на кордоні із зоною активних бойових дій [7], було вирішено продовжити займатися науковою діяльністю та розробляти методику визначення мінімальної інгібуючої концентрації з використанням оптимальної мінімальної кількості реагентів і матеріалів.

Матеріали та методи: Метод серійних розведень (2-254 mg/L) на м'ясопептонному бульйоні [9], проведений у бактеріологічній лабораторії КНП «Запорізька обласна клінічна лікарня» ЗОР проти StaphylococcusaureusATCC25923 F-49, PseudomonasaeruginosaATCC 27863, EscherichiacoliATCC 25922, Klebsiella (Enterobacter) aerogenesта CandidaalbicansATCC 885-653 на прикладі нової біологічно активної сполуки, 4 - (5-метил - 5,6 - дигідротетразоло (1,5<| - хіназолін-5-іл) бензойної кислоти (лабораторний шифр №295), синтезованої на кафедрі Органічної і біоорганічної хімії Запорізького державного медичного університету. Тому що, нещодавно, за допомогою insilicoмолекулярного докінгу було виявлено спорідненість 5,6 - дипдротетразоло [1,5<] хЫазол^в до рибосомального 50Sбілка L2P (PDBID: 2QEX) [10], що спонукає до перевірки протимікробних властивостей ряду цих сполук.

Результати та їх обговорення: Серед стандартизованих методів визначення чутливості мікроорганізмів до антибіотиків розрізняють методи серійних розведень та дифузійні [1,8]. Методи серійних розведень базуються на прямому визначенні мінімальної інгібуючої концентрації (МІК) препарату, яка пригнічує видимий ріст досліджуваного мікроорганізму в бульйонній культурі або на щільному поживному середовищі. Для визначення величини МІК певні концентрації сполуки вносять у поживне середовище, в яке потім засівають культуру досліджуваного мікроорганізму і після інкубації оцінюють наявність або відсутність видимого росту.

Враховуючи гідрофобні властивості нових синтезованих сполук було вирішено використовувати ДМСО (диметилсульфоксид) у якості первинного розчинника субстанції згідно прикладів EUCAST[11]. Так, для дослідження протигрибкової активності останній рекомендує діапазон концентрацій 0.25 - 128 mg/L. При цьому для флюканазолу допустимий діапазон концентрацій проти C. albicansF8555: 32-128 mg/L. У нашому випадку експериментально було виявлено, що для визначення нових біологічно - активних сполук ряду 5-феніл - 5,6 - дигідротетразоло [1,5 - с] хіназолінів концентрація 2-254-mg/Lє оптимальною, бо для створення комбінаторних бібліотек з відомою invitroактивністю, наявність речовин навіть з незначною біологічною дією, покращить майбутній insilicoдизайн та аналіз кількісного зв'язку структура-активність (QSAR) протимікробних лікарських субстанцій.

Таким чином, пропонується наступна методика визначення МІК з використанням інокулюма, що був отриманий з 3-5 однотипних, чітко ізольованих колоній, які виросли на неселективних щільних середовищах після 16-24 год. інкубації. Кінцевий об'єм суміші було обрано 2 мл для більш кращої інтерпретації результатів.

Покрокова методика визначення МІК нової гідрофобної' біологічно активної' сполуки.

• В одному штативі позначте стерильні пробірки від 1 до 8; зазначте номер досліджуваної сполуки на пробірці 1;

• 'початковий розчин сполуки №' - початковий розчин досліджуваної сполуки із зазначеним її лабораторним номером, якого вистачить для дослідження на 5 культурах;

• 'культура' - суспензія культури, розведена у 100 разів з мікробіологічної суспензії із стандартною каламутністю за МакФарландом.

• 'KC' - контроль поживного середовища (м'ясо-пептонний бульйон);

• 'KK' - контроль росту культури;

• 'ККД' - контроль росту культури з ДМСО;

• В пробірку 'початковий розчин сполуки №' додайте 9500 pLбульйону.

• В пробірку «культура» додайте 9900 pLбульйону

• В пробірку КС додайте 2000 pLбульйону.

• В пробірки 2-8 та КК додайте по 1000 pLбульйону.

• В пробірку ККД додайте 950 pLбульйону.

• В пробірку ККД додайте 50 pLДМСО.

Приготування початкового розчину: Зважте 0,0512 грам досліджуваної сполуки, додайте 5000 pLДМСО, ретельно розчиніть. З цього розчину 500 pLдодайте до підготовленої пробірки 'початковий розчин сполуки №' з бульйоном. (Концентрація початкового розчину - 512 mg/L (10 mL) для одночасного визначення на 5 культурах.)

• До пробірки 1 додайте 2000 pL «початкового розчину сполуки №». (Якщо Ви визначаєте МІК на 5 культурах, то можете додати його у кожну пробірку 1 на різних штативах.)

• Перенесіть 1000 |А з пробірки 1 у пробірку 2. Ретельно перемішайте вміст цієї пробірки та перенесіть 1000 pLу третю пробірку.

• Продовжуйте розведення так само, включаючи останню пробірку №8.

• Видаліть 1000 pLз пробірки 8, щоб в ней залишився 1 mL

Підготовка культури: Для кожної добової культури необхідно починати з її стандартної каламутності за МакФарландом та розчиняти у 100 разів у ізотонічному розчині натрій хлориду. Інокулюм слід використовувати не пізніше 15 хв. після його приготування.

• Так, до пробірки «культура» з бульйоном додайте 100 pLсуспензії бактеріальної культури (каламутність за МакФарландом бактеріальної суспензії 0,5 (1,5*10⁸ КУО/см³), та 2,0 - для C. albicans (6,0*10⁸ КУО/см³), щоб в результаті отримати 10 mLрозчину з 1,5*10⁶ КУО/см³ для бактерій, та - 6,0*10⁶ КУО/см³ для С. albicans).

• Додайте по 1000 pLрозведеної суспензії культури до пробірок 1-8, КК, ККД (щоб отримати фінальну концентрацію 7,5*10⁵ КУО/см³ для бактерій, та 3,0*10⁶ КУО/см³ для C. albicansу 2 mLсуміші).

• Інкубуйте пробірки при 35 ± 1°С протягом 24 год.

• Огляньте пробірки на наявність видимих ознак росту бактерій.

• Сфотографуйте кожен ряд десяти пробірок 1 -8, КК, КС на темному фоні у світлі, що проходить, як на прикладі (Рис. 1).

• У таблиці зазначте хрестик, де ріст мікроорганізмів (опалесценція) присутня (Табл. 1). Найвище розведення без зростання і є мінімальна інгібуюча концентрація сполуки.

Так, у нашому прикладі, МІК сполуки №295 дорівнює 32 mg/Lпроти S. aureus, 254 mg/Lпроти E. coliта С. albicans (Рис. 1,2; Табл. 1). Варто зазначити, що для азотмісних сполук у випадку прояву протигрибкової активності, МІК є найнижчою концентрацією препарату, що призводить до пригнічення росту на >50% від рівня контролю [11], тобто сполуку №295 слід дослідити детальніше методом дифузії у агар.

Таблиця 1. Приклад зведеної таблиці згідно результатів на Рис. 1.