Особливості будови лімфоїдного компоненту осердя щурів протягом онтогенезу

Вступ. Актуальним на сьогодні питанням є дослідження серцево-судинної системи, адже її захворювання є високопатологічними та суттєво впливають на загальну смертність населення. Мор- фофункціональний стан серця напряму залежить від осердя, яке, в свою чергу, виконує ряд ключових для серця фізіологічних функцій. Осердя, маючи целомічне походження, може виконувати не тільки механічну бар'єрну функцію, але і виявляє імунні властивості через лімфоїдну тканину, асоційовану з серозними оболонками, відому як серозо-асоційовані лімфоїдні кластери (Serosa- associated lymphoid clusters). Мета. Метою дослідження є розширення уявлення про структуру лімфоїдного компоненту осердя, аналіз якісного складу цієї тканини та вивченні топографії на різних етапах післянатального онтогенезу щурів. Матеріали і методи. Дослідження проводилось на 4 вікових групах лабораторних щурів, кожна з яких включала 5 особин. Виготовлялися плівкові препарати. Зразки плівкових препаратів були піддані фарбуванню метиленовим синім, а також гематоксиліном і еозином нативно і після фіксації. Результати дослідження. Лімфоїдна тканина осердя щурів представлена переважно малими і середніми лімфоцитами, а також клітинами, що є подібними до плазматичних клітин. Особливості топографії лімфоїдної тканини осердя у ранньому і пізньому постнатальному періодах, виявлені за допомогою різних методів фарбування, свідчать про важливі аспекти морфології осердя щурів. Висновки. Аналіз лімфоїдної популяції клітин дозволив визначити їх в різних ділянках органу протягом онтогенезу, вказавши на наявність динамічних змін у лімфоїдній тканині осердя протягом післянатального періоду. Враховуючи вікові особливості структури осердя, рекомендується подальше вивчення якісного і кількісного складу серозо-асоційованих лім- фоїдних кластерів у щурів, що дозволяє отримати більш детальне розуміння імунних процесів, які відбуваються в цьому органі. Враховуючи важливість імунологічних аспектів серцево-судинної системи, отримані дані мають високий потенціал для застосування у ветеринарній та медичній практиці.

Ключові слова: серце, щури, осердя, серцево-судинна система, лімфоцит.

Зв'язок публікації з плановими науково-дослідними роботами. Експериментальне дослідження проводилося в межах науково- дослідної роботи кафедри фізіології, імунології і біохімії з курсом цивільного захисту та медицини «Морфофункціональний стан органів і їх лімфоїдних компонентів під дією внутрішніх і зовнішніх факторів», номер державної реєстрації: 0123U103988.

Summary

лімфоїдний компонент осердя

THE FEATURES OF THE STRUCTURE OF THE LYMPHOID COMPONENT OF RAT PERICARDIUM THROUGHOUT ONTOGENESIS.

Verba E.I., Kushch O. G.

Keywords: heart, rats, pericardium, cardiovascular system, lymphocyte.

Introduction. Research of the cardiovascular system is a relevant issue today, because its diseases are highly pathological and significantly affect the general mortality of the population. The morphofunctional state of the heart directly depends on the pericardium, which, in turn, performs a number of key physiological functions for the heart. The pericardium, having a coelomic origin, can perform not only a mechanical barrier function, but also exhibits immune properties through lymphoid tissue associated with serous membranes, known as serosa-associated lymphoid clusters. Objective. The purpose of the study is to expand the understanding of the structure of the lymphoid component of the pericardium, to analyze the qualitative composition of this tissue, and to study the topography at various stages of the postnatal ontogenesis of rats. Materials and methods. The study was conducted on 4 age groups of laboratory rats, each of which included 5 individuals. Film preparations were made. Samples of film preparations were stained with methylene blue, as well as with hematoxylin and eosin natively and after fixation. Results. The lymphoid tissue of the pericardium of rats is mainly represented by small and medium-sized lymphocytes, as well as cells that are similar to plasma cells. Features of the topography of the lymphoid tissue of the pericardium in the early and late postnatal periods, revealed with the help of various staining methods, testify to important aspects of the morphology of the rat pericardium. Conclusions. Analysis of the lymphoid population of cells made it possible to determine them in different parts of the organ during ontogenesis, indicating the presence of dynamic changes in the lymphoid tissue of the pericardium during the postnatal period. Taking into account the age- related features of the structure of the pericardium, further study of the qualitative and quantitative composition of serosa-associated lymphoid clusters in rats is recommended, which allows for a more detailed understanding of the immune processes that occur in this organ. Considering the importance of immunological aspects of the cardiovascular system, the obtained data have a high potential for application in veterinary and medical practice.

Вступ

Вивчення серцево-судинної системи стає дедалі важливішим завданням сучасної науки, оскільки ця система і її патології займає провідне місце в статистиці смертності як в Україні, так і у всьому світі. За даними з 1990 по 2019 рік кількість летальних випадків з патологій серцево- судинної системи в Україні зросла на 7,8%, що підкреслює необхідність глибокого розуміння процесів, які відбуваються в цьому важливому органі [1].

Одним із ключових елементів цієї системи є осердя, яке відіграє не тільки структурну роль, але й має імунні функції. На жаль, дотримання досить обмеженої уваги в аспекті дослідження лімфоїдного компоненту осердя обмежує повноту нашого розуміння процесів, що відбуваються в ньому. Вже вивчено токсичний вплив солей важких металів на ембріогенез серця, проте питання морфологічних змін осердя і його лімфоїдного компоненту в експерименті залишається відкритим, вкрай цікавлячи наукове співтовариство та відкриваючи нові перспективи для подальших досліджень [2-4].

Осердя - орган середостіння, що розміщений у торакальній порожнині між лівою і правою плевральними порожнинами. Він відокремлює серце від інших органів та запобігає його зсуву, а верхній шар мезотелію виробляє спеціальну рідину, багату на гіалуронову кислоту, яка полегшує тертя листків - парієтального осердя (перикард) і вісцерального осердя (епікард) [5]. Через парієтальний листок осердя також виконується транспорт фізіологічних рідин, біологічно активних речовин і твердих наночасток.

Під час ембріогенезу утворюються дві основні порожнини тіла з первинного целому - грудна або торакальна fcavitas thoracis) і перитонеаль- на fcavitas peritonealis), між якими є поперечна перегородка (septum transversum), з якої з часом формується вентральна частина діафрагми [6,

7] . Наступним етапом у грудній порожнині формується середостіння і відбувається органогенез. Осердя як плівковий орган має структуру, близьку до первинного целому, тож подібно очеревині відіграє важливу роль в імунному захисті організму [6, 8].

Лімфоїдний компонент очеревини і великого чепця досліджувався з 1874 року, коли Л. Ранв'є вперше розпізнав невеликі скупчення лімфоїдної тканини у великому чепці і назвав їх «молочними плямами» [9]. І, дійсно, найбільша кількість молочних плям зосереджена у великому чепці [10]. Аналогічно, як в очеревині і великому чепці, і в органах грудної порожнини целомічного походження, до яких належить осердя та плевра, теж зустрічаються молочні плями, що доводить їх єдине походження з мезодермального зародкового листка [6, 8].

Лімфоїдна тканина в структурі осердя представлена серозо-асоційованими лімфоїдними кластерами (Serosa-associated lymphoid clusters) та лімфоїдними кластерами, асоційованими з жировою тканиною (Fat-associated lymphoid clusters) [11]. Незважаючи на значні досягнення у вивченні периферичних органів імунного захисту, все ще є структури, які потребують більш детального дослідження.

Мета

Метою даного дослідження є розширення уявлення про лімфоїдний компонент осердя щурів на різних етапах розвитку в онтогенезі і вивчення якісного складу лімфоїдної тканини у плівкових препаратах за допомогою різних методик фарбування.

Об'єкт і методи дослідження

Для дослідження були використані 4 групи по 5 осіб самців лабораторних щурів різного віку - 3 доби після народження, 14 днів після народження, статевозрілі особини і щури, за віком більше одного року. Всі тварини, що були відібрані до експерименту мали здоровий вигляд, не мали попередніх травм, пошкоджень. Евтаназія відібраних до експерименту тварин відбувалась за методом передозування парами хлороформу. Дослідження проведено з дотриманням біоетич- них норм згідно основних положень Закону України № 3447-IV «Про захист тварин від жорстокого поводження», Директиви ЄС про захист тварин, що використовуються з науковою метою № 63 (від 22.09.2010 р.), наказів МОЗ України № 944 від 14.12.2009 р. та МОН України № 249 від 01.03.2012 р. Під час дослідження було використано такі методи як препарування, гістологічний метод, мікроскопічний, фотографування. Виготовлялися плівкові препарати, які фарбувалися нативно метиленовим синім, а після фіксації - гематоксиліном і еозином.

Рисунок 1. Лімфоцити в субмезотеліальному шарі парієталь- ного листка осердя щура (вік - 3 доби). Нативне фарбування гематоксиліном і еозином. Плівковий препарат, занурення в середовище гліцерин-желатину, збільшення 10x100.

Рисунок 2. Скупчення лімфоцитів в субмезотеліальному шарі парієтального листка осердя щура (вік - 3 доби). Нативне фарбування метиленовим синім. Плівковий препарат, занурення в середовище гліцерин-желатину, збільшення 10x100.

Забір плівкових препаратів осердя здійснювався за допомогою скляної палички, покритої дезінфікованим нітриловим матеріалом для покращення зчеплення досліджуваної тканини з інструментом. Взятий матеріал був розділений на шматочки, розміром 1x1 см², що закріплювалися на предметному склі дезінфікованою безворсовою ниткою для подальшої фіксації та фарбування.

Нативне фарбування зразків відбувалось барвником метиленовий синій та гематоксиліном і еозином. Метиленовий синій тримали протягом 3 хвилин і змивали фізіологічним розчином. Для фарбування гематоксиліном і еозином використовували гематоксилін Карацци протягом 15 хвилин, а також 1% водний розчин еозину впродовж 1 хв. Пофарбовані препарати занурювали в середовище гліцерин-желатину.

Другу групу забраного для дослідження матеріалу фіксували у 10% розчині формальдегіду протягом 1 доби. Наступним етапом було промивання зразків проточною водопровідною водою впродовж 3 годин і проведення їх через висхідну батарею спиртів (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 96,6%, 100%) з повторною фіксацією в абсолютному етиловому спирті. Для подальшого фарбування використовували гематоксилін Ка- рацци протягом 15 хвилин і диференціювали 1% розчином хлороводневої кислоти. Фарбування 1% спиртовим розчином еозину тривало 15 секунд. Пофарбовані зразки занурювали в середовище гліцерин-желатину.

Результати дослідження

У першій віковій групі тварин - 3-а доба після народження - проводили забір матеріалу для нативного фарбування метиленовим синім, а також за методом гематоксилін і еозин. При мікроскопії плівкових препаратів, пофарбованих гематоксиліном і еозином візуалізувалися клітини, завбільшки 5-7 мкм зі значною кількістю ексцентричної базофільної цитоплазми і профарбованим ядром в центрі, діаметром 1-2 мкм, за їх морфологією, можна припустити, що це лімфоцити (Рис. 1). Ділянка з цією групою клітин знаходиться у вентральній частини осердя, біля грудини. На препаратах з інших ділянок органу таких угрупувань, практично, не було, проте були поодиноко розташовані клітини, що подібні до плазматичних клітин на значній відстані одна від одної.

Метод фарбування гематоксиліном і еозином дозволяє побачити клітини з великою кількістю цитоплазми, однак ядра клітин профарбовуються недостатнім чином через шар мезотеліальних клітин. При фарбуванні зразків метиленовим синім ядра клітин є краще профарбовані, що дало змогу детальніше візуалізувати клітини. Таким чином можна зробити висновок, що сполука барвника метиленовий синій має кращу проникну здатність крізь поверхневий шар мезотеліальних клітин при нативному фарбуванні препаратів. На Рисунку 2 показані достатньо великі клітини, діаметром 12-15 мкм і профарбованим ядром 3-4 мкм завбільшки. Особливістю даної лімфоїдної тканини є те, що вона виявляється саме в краніальній ділянці осердя щура.

Фарбування зразків осердя другої групи тварин віком 14 діб після народження також проводилось нативно гематоксиліном і еозином. В апікальній і краніальній ділянках осердя спостерігаються скупчення лімфоцитів, проте важко диференціювати всі побачені клітини через ущільнений поверхневий шар мезотелію (Рис. 3). Важливо звернути увагу на те, що у щурів, віком 14 днів лімфоїдна тканина зустрічається не тільки в краніальній частині осердя, а також в апікальній, ближче до тимуса.

У третій групі тварин - статевозрілі щури - при мікроскопії візуалізуються поодинокі та попарно розташовані клітини, що нагадують за своєю морфологією малі і середні лімфоцити. Вони знаходяться здебільшого вздовж судин (Рис. 4). Проте в деяких випадках дані клітини зустрічаються далеко від будь-яких судин або в формі скупчень у правій і лівій частинах осердя. На препаратах цієї вікової групи додатково візуалізуються невеликі клітини з добре профарбованим ядром. Найчастіше вони зустрічаються також вздовж судин. На зразках, що пройшли фіксацію і висхідну батарею спиртів клітини візуалізуються чіткіше, тож можна зробити висновок, що такий метод фарбування плівкових препаратів є більш доцільним.

Рисунок 3. Середні лімфоцити на апікальній ділянці лівої частини осердя щура (вік - 14 днів). Нативне фарбування гематоксиліном і еозином.

Плівковий препарат, занурення в середовище гліцерин-желатину, збільшення 5x100.

Рисунок 4. Лімфоїдна тканина в осерді статевозрілого щура. 1 - судина, 2 - незрілі лімфоцити. Фарбування гематоксиліном і еозином після фіксації. Плівковий препарат, занурення в середовище гліцерин-желатину, збільшення 12x100.

Рис. 5. Поодинокі плазматичні клітини і лімфоцити осердя щура (вік - більше 1 року). 1 - плазматична клітина,

2 - незрілі лімфоцити. Фарбування за методом гематоксиліну і еозину після фіксації у формаліні та проведення через висхідну батарею спиртів. Плівковий препарат, занурення в середовище гліцерин-желатину, збільшення 5x100.

Результати нативного фарбування зразків осердя щурів 4 вікової категорії - статевозрілі щури віком більше 1 року - показали, що субме- зотеліальний шар, в якому знаходяться лімфоїдні клітини майже не візуалізується. У зразках, що були пофарбовані після фіксації лімфоцити візуалізуються чіткіше, проте можна помітити, що вони знаходяться в двох площинах, що говорить про потовщення і субмезотеліального шару (Рис. 5). За своєю морфологією виявлені клітини подібні до лімфоцитів та плазматичних клітин. Топографія лімфоїдної тканини, асоційованої з осердям у щурів 4 вікової групи майже не відрізняється від 3 групи - лімфоцити виявляються в краніальній частині осердя у підсерцевому просторі. Лімфоцити малого та середнього діаметру поодиноко розташовані на значній відстані один від одного.

Обговорення одержаних результатів

Лімфоїдна тканина, асоційована з серозною оболонкою осердя представлена клітинами, які описувалися і іншими авторами: малими та середніми лімфоцитами, плазматичними клітинами, що дифузно розташовані по всій площі органу [12, 13].

Протягом онтогенезу відмічається особливість переважного розташування лімфоцитів на третю добу життя у вентральній і краніальній ділянці осердя, а на 14 добу життя - лімфоїдна тканина має найбільшу щільність в краніальній і апікальній частинах органу. Даний факт, вірогідно, пов'язаний з міграцією лімфоцитів через судинну систему серця. Після статевого дозрівання і на пізніх етапах онтогенезу переважною локалізацією дифузної лімфоїдної тканини є краніальна частина осердя, проте поодинокі лімфоцити розташовані по всій площі органу. Розташування лімфоїдної тканини саме у краніальній частині осердя, біля діафрагми підіймає питання міграції лімфоцитів між осердною порожниною та перитонеальною.

Доцільним є використання різних методик фарбування плівкових препаратів осердя щурів на різних етапах післянатального онтогенезу. Для фарбування плівкових препаратів осердя щурів віком до 14 днів від народження найопти- мальнішою методикою є нативне фарбування зразків метиленовим синім через те, що цей барвник кращу проникну здатність крізь поверхневий шар мезотеліальних клітин. При проведенні гістологічних досліджень зразків осердя статевозрілих щурів доцільно фіксувати їх у розчині формальдегіду з подальшим проведенням через батарею спиртів перед фарбуванням й використовувати барвники гематоксилін і еозин.

Висновки

1. У зв'язку з особливостями вікових змін в структурі осердя доцільно вивчати серозо-асоційовану лімфоїдну тканину, у щурів раннього післянатального періоду на нативних плівкових препаратах з фарбуванням метиленовим синім з наступним зануренням в гліцерин- желатин. З віком, доцільно виготовляти фіксовані препарати з проведенням через висхідну батарею спиртів і фарбуванням гематоксиліном і еозином.

2. Лімфоїдна тканина, асоційована з осердям представлена дифузно розташованими лімфоцитами малого, середнього діаметру і клітинами, подібними до плазматичних клітин.

3. З віком змінюється топографія лімфоїдної тканини, асоційованої з осердям - в ранньому післянатальному періоді спостерігається більша щільність лімфоцитів у вентральній та краніальній ділянці осердя, в старшому віці більша кількість лімфоцитів на стандартну одиницю площі спостерігається в краніальному відділі органу.

Особистий внесок авторів

Верба Є. І. - збір та узагальнення даних, аналіз та інтерпретація результатів, написання рукопису; Кущ О. Г. - концепція та дизайн, редагування рукопису, остаточне затвердження рукопису.

Конфлікт інтересів

Конфлікт інтересів відсутній.

References

1. Hans Rosling Center for Population Health. Global Burden of Disease [Internet]. Seattle: Hans Rosling Center for Population Health; 2021. Available from: https://healthdata.org/results/gbd_summaries/2019/ischemic-heart-disease-level-3-cause

2. Shatorna VF, Lomyga LL. Zminy pokaznykiv embriotoksychnosti khlorydu kadmiyu pry kombinovanomu vvedenni z suktsynatamy tsynku ta midi v khronichnomu eksperymenti na shchurah [Markers of connective tissue degradation in the small intestine of g rats undergoing surgical trauma replicated under experimental post-traumatic stress disorder]. Aktual'ni problem suchasnoyi medytsyny: Visnyk Ukrayins'koyi medychnoyi stomatolohichnoyi akademiyi. 2023;23(4):247-252. (Ukrainian).

3. Nefiodova OO, Halperin OI, Shatorna VF, Shevchenko IV, g Demidenko YuV, Prydyus IO, et al. Eksperymental'ne vyznachennya nakopychennya v sertsi embrioniv soley kadmiyu ta yih vplyvu na emriogenez shchura [Experimental determination of ¹⁰the accumulation of cadmium salts in the heart of the embryo of rat and their effect on rat cardiogenesis]. Medychni perspektyvy.2020;25(3):8-16. doi:10.26641/2307-0404.2020.3.214628

(Ukrainian). 11.

4. Nefiodov OO, Bilyshko DV, Kushnariova KA, Shevchenko OS, Shatorna, VF, Kefeli-Yanovska OI et al. Vyznachennya vplyvu kadmiyu na pokaznyky embriohenezu pry izoliovanomu vvedenni ta v kombinaytsiyi z tsytratamy selenu ta hermaniyu [Determining 12. the effect of cadmium on embryogenesis in isolated administration and in combination with selenium and germanium citrates]. Medychni perspektyvy. 2020;25(1):24-31. (Ukrainian). 13

5. Michailova KN, Usunoff KG. Serosal membranes (Pleura,Pericardium, Peritoneum): normal structure, development and experimental pathology. Berlin: Springer Science and Business Media; 2006. 144 p.

6. Panasco MS, Pelajo-Machado M, Lenzi HL. Omental and pleural milky spots: different reactivity patterns in mice infected with Schistosoma mansoni reveals coelomic compartmentalisation. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 2010;105:440-4. doi: 10.1590/s0074-02762010000400014

Ranvier L. Du developpement et de l'accroissement des vaisseaux sanguins. Arch Physiol Norm Path. 1874;6:429-49.

Liu M, Silva-Sanchez A, Randall TD, Meza-Perez S. Specialized immune responses in the peritoneal cavity and omentum. Journal of Leukocyte Biology. 2021;109(4):717-29. doi: 10.1002/JLB.5MIR0720-271RR

Kuper CF, Pieters RH, van Bilsen JH. Nanomaterials and the Serosal Immune System in the Thoracic and Peritoneal Cavities. International Journal of Molecular Science. 2021 ;22(5):2610. doi: 10.3390/ijms22052610 Treuting PM, Dintzis S, Montine KS. Comparative anatomy and histology: a mouse, rat, and human atlas. 2nd ed. Cambridge: Elsevier Inc. Academic Press; 2018. 570 p.

Maynard RL, Downes N. Anatomy and histology of the laboratory rat in toxicology and biomedical research. Cambridge: Elsevier Inc. Academic Press; 2019. 378 p.

Размещено на Allbest.ru