Біотехнологічний метод розмноження Paulownia ssp

Размещено на http://www.Allbest.Ru/

Інститут біоенергетичних культур і цукрових буряків

Біотехнологічний метод розмноження Paulownia ssp

Ковальчук H.С., с.н.с.,

Бордусь О.Ю., аспірант, м.н.с.

м. Київ

Анотація

Проведені дослідження з пророщування насіння в умовах in vivo впродовж 14 діб з наступною стерилізацією проростків з зародковими листочками і апікальною меристемою, що проводилась розчинами гіпохлориту натрію з концентрацією 20% і упродовж 2-5 хв. Розроблений спосіб мікроклонального розмноження павловнії з використанням в якості експлантів апікальних меристем із проростків насіння інтродукованих видів роду Paulownia Siebold & Zucc. і отримана колекція вихідних матеріалів для селекції in vitro (Paulownia tomentosa Steud., Paulownia elongate S.Y.Hu; Paulownia '950Г (Paulownia tomentosa x Paulownia fortune!); Paulownia 'Zo7' (Paulownia tomentosa x Paulownia fortune! x Paulownia kawakamii); Paulownia 'Shan thong' (Paulownia tomentosa x Paulownia fortunei).

Ключові слова: біоенергетичні рослини; павловнія; мікроклональне розмноження; фітогормони; стерилізація; біотехнологічні лінії.

Annotation

Biotechnological method of propagation of paulownia ssp

Kovalchuk N.S., Senior Research Fellow, Bordus O.Y., Junior Research Fellow, Post-graduate Student, Institute of Bioenergy Crops and Sugar Beet, Kyiv

The purpose of this study is to develop highly efficient methods of in vitro propagation of introduced species of the genus Paulownia Siebold & Zucc. for the development of bioenergy in Ukraine, obtaining a collection of raw materials for selection, replication of high-quality planting material. According to the results of the experimental studies, it was established that the germination of seeds in vivo took place for 14 days, the sterilization of the germ leaves and apical meristems was carried out with solutions of sodium hypochlorite with a mass fraction of 20% and an exposure time of 2-5 minutes.

Additional shoots were obtained on Murashige-Skuga nutrient medium with the inclusion of hormonal substances BAP 1.5 mg/dm³ in order to achieve the maximum number of internodes and rooting of cultural seedlings, nutrient media containing BAP 0.3 mg/dm³ and kinetin 0.15 mg/dm³ were added. A method of microclonal reproduction of paulownia was developed using as explants apical meristems from seed seedlings of introduced species of the genus Paulownia Siebold & Zucc. and the obtained collection of starting materials for in vitro breeding (Paulownia tomentosa Steud., Paulownia elongate S.Y.Hu; Paulownia '950Г (Paulownia tomentosa x Paulownia fortunei); Paulownia 'ZoT (Paulownia tomentosa x Paulownia fortunei x Paulownia kawakamii); Paulownia 'Shan thong' (Paulownia tomentosa x Paulownia fortunei).

The highest percentage of shoot regeneration on the medium with the addition of 1.5 mg/dm³ kinetin and 1.5 mg/dm³ BAP was characteristic of selected lines of Paulownia elongate S.Y.Hu with a shoot formation coefficient of 2 pp./ех and 'Z07' (P. fortunei x P. tomentosa x P. kawakami) with a value of 2.7 pg./ex. After transplanting to nutrient medium with BAP 0.3 mg/dm³ and gibberellic acid 0.15 mg/dm³ the best results were in Paulownia tomentosa Steud., with the formation of 7.4 shoots per plant.

Keywords: bioenergy plants; paulownia; microclonal reproduction; phytohormones; sterilization; biotechnological lines.

Постановка проблеми

Наразі рід Paulownia налічує понад 20 видів рослин (20-25 видів за даними різних авторів) родом із Китаю та Східної Азії. Більшість видів швидкоростучі із швидким збиранням врожаю, яке починається через 8 років [11]. Через 6 років рослина може досягати 20 м [10]. Деревина легка, м'яка, використовується в деревообробній галузі та в будівництві [5]. Також використовується для виробництва біомаси.

Важливою ознакою з точки зору економічних розрахунків є те, що павловнія не потребує повторного садіння, оскільки вона дає поросль на пеньках і цикл вирощування можна повторити кілька разів. Павловнію також використовували для створення лісових насаджень, для рекультивації територій після видобувних робіт. У зв'язку з цим є необхідність розробити нові ефективні способи отримання культуральної розсади в умовах in vitro.

Види роду Paulownia розмножують насінням або кореневими живцями. Насінина має повільний темп росту у порівнянні з кореневими чи здерев'янілими живцями, та розсадою, отриманою в культурі in vitro [10]. Отже, це основна причина того, чому пошук нового ефективного методу розмноження важливий. Стерильна культура in vitro має багато можливостей: від розмноження меристемної тканини до прямого соматичного ембріогенезу з міжвузль рослин і листкових експлантів [1; 9; 13]. Також є інформація про опосередкований спосіб розмноження з калюсу [7].

Загальновизнано, що контроль морфогенезу, на який впливає кілька факторів, а саме генетичне походження, види тканин та експлантів, компоненти поживного середовища, регулятори росту та власне поживне середовище визначають успішність регенерації in vitro [11; 13]. Через недостатню кількість інформації про використання методів введення насіння в стерильні умови in vitro, дослідження має інноваційний характер.

Аналіз останніх досліджень та публікацій. В дослідженнях українських вчених представлені дані про введення в стерильну культуру in vitro експлантів, у вигляді частини пагону чи пазушної бруньки (А Подгаєцький та ін. 2020), також в дослідженнях турецьких вчених (М. Ozaslan та ін. 2014) були використані кореневі живці. Проте в цих морфологічних структурах є значна кількість спор, які викликають грибкові захворювання, що себе проявляють в умовах поживного середовища, і через наявність грубих покривних тканин, стерилізація їх повинна бути із збільшеною концентрацією стерилізуючих речовин або збільшеною тривалістю експозиції.

За інформацією дослідників Л. Штерева та ін. (2014), при пророщуванні насіння в умовах in vitro було встановлено, що для стерилізації необхідно не менше 30%-ий розчин натрію гіпохлориту з упродовж 15хв з максимальним виходом стерильного матеріалу 98%. Через вплив натрію гіпохлориту на насіння, за 15 хвилин виникають негативні наслідки, що впливають на проростання і термін життєздатності введених експлантів [11 ].

Окремі етапи мікроклонального розмноження павловнії наведено у працях: С. San Jose, J. Cernadas & E. Corredoira (2013), A. Chunchukov, S. Yancheva (2015), де описані і процеси стерилізації введеного матеріалу в умови in vitro.

Постановка завдання та мети дослідження. Мета роботи - розроблення ефективного способу введення експлантів інтродукованих видів і гібридів Paulownia ssp. та їх розмноження в умови поживних середовищ in vitro.

Об'єкт дослідження - мікроклональне розмноження рослин видів та гібридів роду Paulownia ssp.

Предмет дослідження - введення експлантів рослин в умови поживних середовищ та розмноження розсади видів і гібридів Paulownia ssp.

Основні завдання дослідження:

1. Визначення схожості насіння Paulownia ssp., що будуть використовуватися для введення в умови in vitro;

2. Визначення ефективності стерилізації експлантів та їх приживлюваність;

3. Визначення оптимального вмісту гормональних речовин в пагоноутворення та збільшення кількості поживному середовищі для ефективного підвищення коефіцієнту розмноження шляхом одновузлових сегментів.

Матеріали та методи дослідження

Місце проведення досліджень. Дослідження були проведені в лабораторії цитогенетики Інституту біоенергетичних культур і цукрових буряків.

Експериментальний матеріал. В даному дослідженні використано 5 видів та сортів павловнії - Paulownia: `Shang Thong' (Р. fortune х Р. tomentosa), `9501' (Р. tomentosa х Р. fortune!), Paulownia elongata S.Y.Hu, 'Z07' (P. fortune! x P. tomentosa x P. kawakami), Paulownia tomentosa Steud..

Насіння сіяли по 30 шт у 4-разовій повторюваності в чашки Петрі на зволожений фільтрувальний папір і впродовж 14 діб пророщували за температури 24-26°С із інтенсивністю освітлення 1 500 Lux. Обліки проводили на 7-й, 10-й і 14-й день.

Методика введення в культуру in vitro. В якості експлантів використані проростки насіння павловнії, від яких відокремлювали зелену частину із зародковими листочками і апікальною меристемою, що у порівнянні з насіниною має нижчу інфікованість. Експланти висаджували на поживні середовища в стерильних умовах ламінар-боксів після оброблення експлантів в 20% розчині натрію гіпохлорит впродовж 2-5 хвилин і триразовим промиванням у стерильній дистильованій воді.

Щоб отримати експланти для введення в умови in vitro представників Paulownia ssp. насіння пророщували в умовах in vivo на вологому фільтрувальному папері. Зображення насіння та їх проростків показані на рисунку 1.

Поживне середовище. Підібрано середовища на базі середовищ Мурасіге і Скуга [8] з добавлянням цукрози ЗО г/ дм³, мезоінозиду 0,1 г/дм³ і в різних пропорціях БАП, кінетину та гібереліну для пагоноутворення і формування сегментів для оптимального коефіцієнту розмноження павловнії.

Рис. 1. Насіння Paulownia tomentosa Steud.: а) викладене насіння в чашці Петрі; б) загальний вигляд насінини та с) проросток насіння з зародковими листочками і апікальною меристемою за 36. 7*12,5 стереомікроскопу «МБС-11»

експлант гібрид paulownia схожість приживлюваність

Умови інкубування. Режим освітлення - 16/8 годин, інтенсивність світла - 1500 Lux при використанні люмінесцентних ламп холодного білого світла, температурний режим - 24-8°С.

Аналіз даних. Для встановлення достовірності досліджень і підібраної вибірки для аналізу проводили розрахунок величини похибки репрезентативності тр, що у відсотках дозволяє контролювати суттєвість досліду за методикою статистичного аналізу. Середня похибка репрезентативності тр у відсотках визначалась за формулою:

де Р - відсоток досліджуваного показника; п - обсяги дослідження кожного селекційного номера.

Виклад основного матеріалу дослідження

Для отримання первинних експлантів для введення в культуру in vitro представників видів та гібридів роду Paulownia насіннєвий матеріал пророщували в умовах in vivo на зволоженому фільтрувальному папері.

Результати схожості та життєздатності насіння викладені в табл.1.

Таблиця 1

Показники пророщування насіння Paulownia ssp. в умовах in vivo

За даними таблиці 1 найвища схожість насіння була в Paulownia tomentosa і сягала до 83%. Значення решти зразків змінювались від 30% і до 57%. Частка інфікованого насіння при пророщуванні змінювалась від 1,7% до 8,3%.

Після садіння на поживні середовища стерилізованих експлантів проводили облік життєздатних культуральних рослин. Дані розрахунку ефективності стерилізації наведено в табл. 2.

Відсоток стерильного матеріалу дещо відрізнявся і залежав від сорту. Найменший відсоток був у виду Paulownia elongata із значенням 79%, і схожі між собою Paulownia tomentosa, Р. `Shang Thong' та Р. 'Z07' значеннями 83%, 85% та 85% відповідно. Найбільший вихід стерильних експлантів був характерний для Р. `950Т із значенням 99%.

Таблиця 2

Ефективність стерилізації насіння Paulownia ssp. в умовах in vitro

Для пагоноутворення і утворення більшої кількості сегментів уведені експланти культивували на поживних середовищах на основі протоколу Мурасіге-Скуга з різним умістом фітогормонів. Склад базового поживного середовища наведено в табл. 3.

Таблиця 3

Склад середовища Мурасіге і Скуга для розмноження рослин в культурі in vitro (на 1 дм³ розчину)

продовження табл. 3

Для впливу на процес пагоноутворення використовували проростки насіння з зародковими листочками і апікальними меристемами. Для досягання утворення бокових пагонів в умовах першого пасажу досліджували поживні середовища з додаванням БАП, кінетину та гібереліну в різних концентраціях, для зменшення негативного впливу утворення калусу в області ризогенезу під дією фітогормонів, що впливає на життєздатність рослин в ґрунтових умовах. Облік культуральних рослин проводили через 4 тижні після садіння і результати занесені в табл. 4.

Таблиця 4

Ефективність пагоноутворення Paulownia ssp. в різних модифікаціях поживних середовищ на основі Мурасіге і Скуга

Ефективність пагоноутворення раховували як відношення кількості утворених бокових пагонів до кількості введених експлантів. Найвища ефективність пагоноутворення спостерігалась в гібриду Р. 'Z07' із значенням 2,7 на середовищі з БАП 1,5 мг/дм³ та кінетином 1,5 мг/дм³. Такий високий показник був спричинений індукцією пагонів не лише із пазушних бруньок, а й з морфогенного калюсу. Також на безгормональному середовищі показник був досить високий - 1,6 паг/експлант, що означає високу пагоноутворюючу здатність гібриду без впливу гормональних речовин.

Найкращі результати у досліджуваних зразків були на поживному середовищі з БАП 1,5мг/дм³ та кінетином 1,5мг/дм³ і змінювались в межах 1,3-2,7 пагонів на експлант.

В першому пасажі використовували БАП і кінетин, який забезпечує утворення додаткових бокових пагонів для всіх зразків із наступним етапом пересадки на середовище у концентраціях гормонів БАП 0,3 мг/дм³ і кінетину 0,15мг/дм³ для формування сегментів і покращення ефективності мікроклонального розмноження для отримання культуральної розсад

Рис. 2. Рослини-регенеранти Paulownia на поживному середовищі для індукції пагонів

Висновки

Новий спосіб мікроклонального розмноження представників роду Paulownia, з використанням у якості експлантів зародкових листочків і апікальних меристем із проростків насіння на штучних поживних середовищах in vitro, гіпохлориту натрію для отримання культуральної розсади, макро- і мікросолей на базовому середовищі Мурасіге-Скуга характеризується тим, що пророщування насіння проводиться в умовах in vivo вродовж 14 діб.

Процес стерилізації проростків відбувається 20% розчином натрію гіпохлорит упродовж 2-5 хвилин, а отримані додаткові пагони на поживному середовищі з включенням фітогормонів БАП 1,5 мг/дм³ і кінетину 1,5 мг/дм³ значно збільшує вихід сегментів на один експлант in vitro, що може досягати на одну рослину до 7,4 сегментів.

References

1. Paulownia (Paulownia tomentosa Steud.) wood. 2010.

2. Bergmann B.A., Moon H.K. In vitro adventitious shoot production in Paulownia. Plant Cell Reports. 1997. №16. P. 315-319.

3. Enjalric F., Carron M. P., Lardet L. Bacterial and bacteria-like contaminants of plant tissue cultures: a symposium in the CEC crop productivity programme. International Symposium on Bacterial and Bacteria like Contaminants of Plant Tissue Culture, 1987-09-23/1987-09-25, Cork (Irlande), 1988. P. 57-65.

4. Statystychnyi analiz ahronomichnykh danykh v paketi Statistica 6.0. / Ermentraut E.R., Prysiazhniuk О., Shevchenko I.L. Metodychni vkazivky. K.: Polihraf Konsaltynh, 2007. 55 s.

5. Giri С.C., Shyamkumar B. and Anjaneyulu C. Progress in Tissue Culture, Genetic Transformation and Applications of Biotechnology to Trees: An Overview. Trees. 2004. №18. P. 115-135.

6. Hakan M., Akyildiz H., Sahin K. Some technological properties and uses of (data somatic 127 embryogenesis and synthetic seed production from Paulownia elongata. Plant Cell. 2003. №22. P. 16-24.

7. Leifert C., Ritchie J.Y. & Waites W. M. Contaminants of plant-tissue and cell cultures. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 1991. №7. P. 452-469.

8. Murashige T., Skoog F.A. Revised Medium for Rapid Growth and Bioassays with Tobacco Tissue Cultures. Physiol.Plant. 1962. №15. P .473-497.

9. Ozaslan M., Can C., Aytekin T. Effect of explant source on in vitro propagation of Paulownia tomentosa Steud. Biotechnology & Biotechnological Equipment. 2005. №19. P. 20-26.

10. Pozoga, M., Olewnicki, D., Jabtohska, L. In Vitro Propagation Protocols and Variable Cost Comparison in Commercial Production for Paulownia tomentosa x Paulownia fortune Hybrid as a Renewable Energy Source. Appl. Sci. 2019. №9, 2272.

11. Shtereva L., Vassilevska-lvanova R., Karceva T., Kraptchev B. Micropropagation of six Paulownia genotypes through tissue culture. Journal of Central European Agriculture. 2014. Vol. 15, no. 4. Pp. 147-156.

12. Lisovyi M.M., Hryhoriuk В.P., Matskevych О.V. Biotekhnolohichni, fiziolohichni ta ekolohichni osoblyvosti rozmnozhennia hibrydu pavlovnii (Paulownia) v kulturi in vitro. Inovatsiini ahrotekhnolohii: materialy vseukrainskoi naukovoi konferentsii, 28 bereznia. Uman, 2018. S. 16-17.

13. Matskevych О.V., Lisovyi M.M. Osoblyvosti rozmnozhennia hibrydu Pavlovnii (Paulownia) in vitro. Biotekhnolohiia: zvershennia ta nadii. Zbirnyk tez VI Mizhnarodnoi naukovo-praktychnoi konferentsii, prysviachenoi do 120-richchia NUBIP Ukrainy (14-16 lystopada 2017 roku, m. Kyiv). Komprynt. C. 218-219.

14. Chunchukov A., Yancheva S. Micropropagation of Paulownia species and

hybrids. Annuaire de I'Universite de Sofia "St. KlimentOhridski". 2015. Vol. 100. P. 223-230.

15. San Jose, M.C., Cernadas, M.J., & Corredoira, E. Histology of the regeneration of Paulownia tomentosa (Paulowniaceae) by organogenesis. Revista De Biologfa Tropical. 2014. №62(2). P. 809-818.

Размещено на Allbest.Ru