Окисні процеси у клітинах гранульози фолікулів яєчника корів за фолікулярного росту

Размещено на http://www.allbest.ru/

Інститут біології тварин НААН

Державний науково-дослідний контрольний інститут ветеринарних препаратів та кормових добавок

Окисні процеси у клітинах гранульози фолікулів яєчника корів за фолікулярного росту

Ю.В. Боднар, канд. с.-г. наук,

Н.В. Кузьміна, канд. біол. наук,

Д.Д. Остапів, д-р с.-г. наук,

О.І. Чайковська, канд. біол. наук,

Р.Д. Остапів, канд. біол. наук

Анотація

У статті наведені результати досліджень дихальної активності та відновної здатності клітин гранульозного шару фолікулів яєчника корів за фізіологічного стану фолікулярного росту. Після забою корів відбирали яєчники фізіологічного стану фолікулярного росту й оцінювали розмір фолікулів. Клітини гранульозного шару аспірували з малих (< 4 мм), середніх (4-7 мм) і великих (> 7 мм) фолікулів та визначали: інтенсивність поглинання кисню полярографічно, відновну здатність - потенціометрично. В якості позаклітинного акцептора електронів використовували Кз[Бе(СП)б]. Встановлювали частку кисню, що споживається аеробним гліколізом, використанням інгібітора натрію фториду, НАДзалежною ланкою ланцюга транспорту електронів мітохондрій - аміталом, а термінальною (цитохромоксидазою) - натрію азидом. Частку вільнорадикального окиснення ненасичених жирних кислот в реалізації кисню виявляли ПаЕДТА.

Встановлено, що клітини гранульози з яєчника фолікулярного росту характеризуються дихальною активністю і відновною здатністю, інтенсивність яких залежить від розміру фолікулів, з яких вони вилучені. Найвищі величини значень досліджених показників характерні для клітин, вилучених з великих фолікулів, нижчі - з малих і найнижчі із середніх. Висока інтенсивність окисних процесів у гранульозі з малих фолікулів забезпечує ріст ооцитів, а з великих - дозрівання статевої клітини в домінуючому фолікулі. При цьому, підвищена інтенсивність споживання кисню клітинами малого і домінуючого фолікулів проявляється на фоні обмеження в акцепторах електронів у позаклітинному середовищі.

Використання інгібіторів ресинтезу АТФ як гліколізу, так і окремих ланок ланцюга дихання мітохондрій, свідчать про активність вказаних метаболічних шляхів у гранульозі й можливості використання альтернативних субстратів для забезпечення існування клітин. Основним шляхом утилізації Оксигену в клітинах гранульозного шару малого і великого фолікулів є аеробний гліколіз, а з середнього - існують альтернативні шляхи постачання і використання субстратів. Найбільший потік відновних еквівалентів в позаклітинний простір з гранульози середнього за розміром фолікула за інгібування гліколізу свідчить, що джерело постачання відновних еквівалентів у порожнину фолікула є гліколіз і характеризує залежність існування клітин від вказаного метаболічного шляху.

Ключові слова: ДИХАЛЬНА АКТИВНІСТЬ, ВІДНОВНА ЗДАТНІСТЬ, ІНГІБІТОРИ, ГРАНУЛЬОЗА, ФОЛІКУЛИ, ЯЄЧНИК, КОРОВИ.

Abstract

OXIDATIVE PROCESSES IN GRANULOSA CELLS OF COW OVARIAN FOLLICLES AT FOLLICULAR GROWTH

Yu. V. Bodnar1, N. V. Kuzmina1, D. D. Ostapiv1, O. I. Chajkovska2, R. D. Ostapiv2

1Institute of Animal Biology of NAAS

2State Scientific Research Control Institute of Veterinary Medicinal Products and Feed Additives

Article presents the research results on the respiratory activity and redox capacity of granulose layer cells of cow ovarian follicles under the physiological state of follicular growth. After the slaughter of the cows, the ovaries in physiological state of follicular growth were selected and the size of the follicles was evaluated. Cells of the granulosa layer were aspirated from small (< 4 mm), medium (4-7 mm) and large (> 7 mm) follicles and determined: intensity of oxygen absorption - polarographically, redox capacity - potentiometrically. K3[Fe(CN)6] was used as an extracellular electron acceptor. The share of oxygen consumed by aerobic glycolysis was determined by using sodium fluoride inhibitor, the NAD-dependent link of the mitochondrial electron transport chain - amytal, and the terminal (cytochrome oxidase) - sodium azide. The share of free-radical oxidation of unsaturated fatty acids in the realization of oxygen was detected by Na2EDTA.

Granulosa cells from the ovary of follicular growth are characterized by respiratory activity and regenerative capacity, the intensity of which depends on the size of the follicles from which they are extracted. The highest values of the investigated indicators are characteristic of cells extracted from large follicles, lower - from small follicles, and the lowest values are from medium follicles. The high intensity of oxidative processes in granulosa from small follicles ensures the growth of oocytes, and from large follicles - maturation of the germ cell in the dominant follicle. At the same time, the increased intensity of oxygen consumption by the cells of small and dominant follicles is manifested against the background of limitations in electron acceptors in the extracellular environment.

The use of inhibitors of ATP resynthesis of both glycolysis and individual links of the mitochondrial respiratory chain testify the activity of the indicated metabolic pathways in granulosa and the possibility of using alternative substrates to ensure the existence of cells. The main way of utilization of oxygen in the granulosa layer cells of small and large follicles is aerobic glycolysis, and from the medium there are alternative ways of supplying and using substrates. The largest flow of reducing equivalents into the extracellular space from the granulosa of a medium-sized follicle due to inhibition of glycolysis indicates that the source of the supply of reducing equivalents into the follicle cavity is glycolysis and this characterizes the dependence of the existence of cells on the indicated metabolic pathway.

Keywords: RESPIRATORY ACTIVITY, REDOX CAPACITY, INHIBITORS, GRANULOSIS, FOLLICLES, OVARY, COWS.

Клітини гранульозного шару вистилають внутрішню поверхню фолікула та оточують ооцит, формуючи навколо нього яйценосний горбик (Kosenko et al., 2005). На ранніх стадіях розвитку фолікулів гранульоза щільним шаром оточує ооцит, формуючи «колиску», в якій росте статева клітина, а на більш пізніх - зростають відстані і втрачаються міжклітинні зв'язки (Calado et al., 2011). Метаболізм клітин гранульози визначається роллю у дозріванні яйцеклітини - ступенем зрілості цитоплазми і ядра. Клітини гранульозного шару фолікулів яєчників корів для існування отримують енергію гліколізом і диханням (Clark et al., 2006; Celik et al., 2012). При цьому, гранульоза використовує глюкозу й засвоює амінокислоти, проявляє характерні, залежні від субстратів окиснення, дихальну активність і відновну здатність (Sugiura et al., 2005; Gook et al., 2014). Інтенсивність дихання клітин та нагромадження відновних еквівалентів у позаклітинному середовищі - показники, які характеризують напруженість окиснювальних процесів зв'язаних як з ресинтезом АТФ, так і окисним перетворенням мембранних структур, цитозольних компартментів і мітохондрій. Встановлено, що підвищення рівня Оксигену за культивування фолікулів покращує їх розвиток, диференціювання та дозрівання ооцитів (Ying et al., 2011; Makanji et al., 2014), що зв'язано з ефективністю ресинтезу АТФ. При цьому, дихальна активність і відновна здатність гранульози залежать від стадії розвитку фолікулів одного і того ж фізіологічного стану яєчника.

Тому досліджували особливості реалізації ендогенних субстратів клітинами гранульозного шару у зв'язку з розміром фолікулів за фолікулярного росту яєчників корів.

Матеріали і методи. Яєчники за фізіологічного стану «фолікулярного росту» відбирали після забою корів чорно-рябої молочної породи віком 4-7 років й оцінювали розмір фолікулів. Клітини гранульозного шару аспірували з малих (< 4 мм), середніх (4-7 мм) і великих (> 7 мм) фолікулів і визначали: інтенсивність поглинання кисню - за температури 38,5 °C у фосфатно - сольовому буфері (ФСБ; NaCl-0,8 г, KCl-0,02 г, Na2HPO4-0,11 г, KH2PO4- 0,02 г, MgCl2-0,01 г, Н2О до 100 мл) полярографічно (нг-атом О2/0Д мл суспензії клітин (СК)*хв; відновну здатність - потенціометрично (мВ / 0,1мл СК* хв) з використанням мікроелектродів. У якості позаклітинного акцептора електронів використовували калію ферриціанід (Кз[Fe(CN)6]; Кз...; 10-4М). дихальний клітина гранульоза фолікулярний

Для встановлення частки кисню, що споживається аеробним гліколізом використовували інгібітор натрію фторид (NaF; 10-3M), НАД-залежною ланкою ланцюга транспорту електронів мітохондрій - амітал (АМ; 5*10-3М), а термінальною (цитохромоксидазою) - натрію азид (NN3; АЗ - 5*10 2M). Для виявлення частки вільнорадикального окиснення ненасичених жирних кислот в реалізації кисню використовували інгібітор МцЕДТА (0,6 І0-3М). Результати досліджень опрацьовані методом варіаційної статистики з використанням t-критерію Стьюдента. Різницю між середніми арифметичними значеннями вважали статистично вірогідною: * р < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001.

Результати й обговорення. Клітини гранульози з фолікулів яєчника «фолікулярного росту» характеризуються дихальною активністю 7,0±0,47 нг-атом О2/0Д мл СК*хв і відновною здатністю - 2,6±0,30 мВ / 0,1мл СК*хв.

За порівняно високих середніх величин значень дихальна активність і відновна здатність клітин гранульози залежать від розміру фолікулів з яких вони вилучені. Зокрема, клітини з великого фолікула характеризуються максимальною дихальною активністю (8,0±0,81 нг-атом О2/0Д мл СК* хв), нижчою на 11,3 % з малого (менше 4 мм) і найнижчою (3,5±0,83 нг-атом О2/0Д мл СК* хв) з середнього (табл. 1).

Різниця між мінімальною і максимальною величинами показника становить 56,3 % і статистично вірогідна (р < 0,001).

Відновна здатність гранульози слабо залежить від розміру фолікула (3,9-4,4 мВ / 0,1мл СК*хв), різниця становить 0,5 мВ / 0,1мл СК*хв, що знаходиться в межах похибки середнього арифметичного.

Таблиця 1 Дихальна активність та відновна здатність клітин гранульози, залежно від розміру фолікулів яєчника «фолікулярного росту», M±m

Примітка: Різниця статистично вірогідна порівняно до максимальної величини показника:***р < 0,001.

Додавання акцептора електронів однозначно знижує дихальну активність клітин гранульози не залежно від розмірів фолікулів. Найбільше зниження величини показника (в 2,6 - 2,8 раза; р < 0,001) виявлено у клітин з малого і великого фолікулів. При цьому, в клітин гранульози з середнього за розміром фолікула відновна здатність (позаклітинний транспорт електронів) знижується на 29,6 %, а з інших фолікулів - не змінюється.

На особливості енергогенеруючих процесів у клітинах гранульози, залежно від розміру фолікулів з яких вони вилучені, вказують результати оцінювання споживання кисню і відновної здатності за використання інгібіторів. Так, гранульоза з великого і малого фолікулів за дії NaF, відповідно, на 73,8 і 71,9 % (р < 0,001) залежать від аеробного шляху гліколізу, а з середнього - на 57,2 % (р < 0,05; табл. 2).

Таблиця 2 Дихальна активність клітин гранульози з фолікулів яєчника «фолікулярного росту» за додавання інгібіторів, M±m

Наслідком змін споживання кисню після дії інгібітора гліколізу виявилась майже однакова величина споживання Оксигену в гранульозі з великого і малого фолікулів: 2,0 - нг-атом О2/0,1 мл СК*хв. Виключенням є клітини гранульози, які вилучені з середнього фолікула, величина значення - 1,5 нг-атом О2/0Д мл СК*хв.

Коливання відновної здатності клітин за додавання інгібіторів зумовлені як обмеженням, так і перерозподілом потоку електронів з мітохондрій на зовнішньоклітинні акцептори. Зокрема, гальмування гліколізу супроводжується зниженням величини показника на 12,0 % у клітин з малого фолікула, на 23,1 % - з великого і на 38,7 % - із середнього.

Порівняно до дії натрію фториду, додавання інгібітора НАД-залежного шляху ланцюга дихання мітохондрій (аміталу) майже не впливало на дихальну активність клітин з великого і малого (1,8±0,42 - 2,0±0,60 нг-атом О2/0Д мл СК*хв) і проявляло тенденцію до зменшення (на 40,0 %; р> 0,05) величини показника з середнього фолікулів (0,9±0,18 нг-атом О2/0Д мл СК*хв). Одночасно встановлено підвищення потоку електронів (протонів) з клітин великого і малого фолікулів, відповідно, на 21,1 і 12,0 %, а з середнього - не змінюється (2,6±0,58 мВ / 0,1мл СК*хв).

Пригнічення активності цитохромоксидази зумовлює тенденцію до зниження на 10,011,2 % дихальної активності гранульози з середнього і великого та на 22,3 % - з малого фолікулів. При цьому, відновна здатність з середніх і великих фолікулів, відповідно, на 23,6 і % зростає, а з малих на 12,0 % знижується.

Внесення №2ЕДТА знижує дихальну активність на 12,5 - 16,7 % у всіх клітин і на 14,9 - 17,3 % відновну здатність гранульози з фолікулів більше 4 мм. Відновна здатність клітин з малих фолікулів не змінюється (3,7±0,96 мВ / 0,1мл СК*хв).

Отже, клітини гранульози характеризуються високою лабільністю окисних процесів. За присутності Оксигену протікають процеси ресинтезу АТФ за рахунок окисного фосфорилювання, а за дефіциту акцептора електронів протікають анаеробні процеси з нагромадженням в позаклітинному середовищі (порожнині фолікула, фолікулярній рідині) продуктів окиснення субстратів (в тому числі лактату). Присутність позаклітинного акцептора (калію ферриціаніду) забезпечує активування і виявлення альтернативних шляхів використання субстратів.

За порівняно високих величин значень, дихальна активність і відновна здатність залежать від стадії розвитку фолікулів яєчника та характеризують особливості окисних процесів у клітинах гранульози, потреби ростучих і дозріваючих ооцитів. Висока інтенсивність окисних процесів у гранульозі з малих фолікулів забезпечує ріст ооцитів, а з великих - дозрівання статевої клітини в домінуючому фолікулі. При цьому, підвищена інтенсивність споживання кисню клітинами малого і домінуючого фолікулів проявляється на фоні обмеження в акцепторах електронів у позаклітинному середовищі.

Використання інгібіторів ресинтезу АТФ як гліколізу, так і окремих ланок ланцюга дихання мітохондрій свідчать про активність вказаних метаболічних шляхів у гранульозі й можливості використання альтернативних субстратів для забезпечення існування клітин. Величин дихальної активності і відновної здатності гранульози залежать від розміру фолікулів з яких вони вилучені та зумовлені особливостями функцій клітин для забезпечення розвитку ооцитів. Особливості проявляються неоднаковою здатністю використовувати субстрати і постачати в позаклітинний простір електрони (протони) з окремих ланок ланцюга дихання мітохондрій.

Основним шляхом утилізації Оксигену в клітинах гранульозного шару малого і великого фолікулів є аеробний гліколіз, а з середнього - існують альтернативні шляхи постачання і використання субстратів. Найбільший потік відновних еквівалентів в позаклітинний простір з гранульози середнього за розміром фолікула за інгібування гліколізу свідчить, що джерело постачання відновних еквівалентів у порожнину фолікула (фолікулярну рідину) є гліколіз і характеризує залежність існування клітин від вказаного метаболічного шляху.

У клітин, вилучених з великого і малого фолікулів, НАД-залежна ланка дихального ланцюга мітохондрій активна, про що свідчить підвищення потоку відновних еквівалентів у позаклітинний простір за дії інгібітора і ймовірне функціонування сукцинатоксидазного шляху (чи інших шляхів) утилізації субстратів у гранульозі. Аналогічно, у клітин появляється активність цитохромоксидази, інгібування якої призводить до відтоку електроів з дихального ланцюга мітохондрій та підвищення відновної здатності у гранульозі з середніх і великих фолікулів. Найвищою інтенсивністю вільнорадикальних процесів характеризуються клітини, вилучені з великих фолікулів.

Висновки

Клітини гранульози з яєчника фолікулярного росту, залежно від розміру фолікулів з яких вони вилучені, характеризуються дихальною активністю і відновною здатністю, інтенсивність яких залежить від ступеня розвитку та енергетичних потреб ооцитів. Найвищі величини значень досліджених показників характерні для клітин, вилучених з великих фолікулів, нижчі - з малих і найнижчі - з середніх.

Перспективи досліджень. Дослідити дихальну активність і відновну здатність клітин гранульозного шару фолікулів за гіпофункції яєчників корів.

References

1. Calado, A.M., Oliveira. E., Colago, A., Sousa, M. (2011). Ultrastructural and cytochemical characterization of follicular cell types in bovine (Bos taurus) cumulus-oocyte complexes aspirated from small and medium antral follicles during the estrus cycle. Animal Reproduction Science 123, (1-2). 23-31.

2. Celik, E., Celik, O., Kumbak, B., Yilmaz, E. (2012). А comparative study on oxidative and antioxidative markers of serum and follicular fluid in GnRH agonist and antagonist cycles. J. Assist Reprod. Genet. 29, 1175-1183.

3. Clark, A.R., Stokes, Y.M., Lane, M.J.G. (2006). Thompson Mathematical modelling of oxygen concentration in bovine and murine cumulus-oocyte complexes. Reproduction. 131. 9991006.

4. Gook, D.A., Edgar, D., Lewis, K., Sheedy, J. (2014). Impact of oxygen concentration on adult murine pre-antral follicle development in vitro and the corresponding metabolic profile. Molec. Hum. Reprod. 20. 31-41.

5. Kosenko, M.V., Chukhriy, B.M, Chaykovska, O.I. (2005). Vidtvorennya molochnoho poholivya. Lviv: Ukrayinski tekhnolohiyi, 227 [in Ukrainian].

6. Makanji, Y., Tagler, D., Pahnke, J., Shea, L.D. (2014). Hypoxia-mediated carbohydrate metabolism and transport promote early-stage murine follicle growth and survival. Am. J. Physiology: Endocrinology and Metabolism. 306. (8). 893-903.

7. Sugiura, K., Pendola, F.L., Eppig, J.J., (2005). Oocyte control of metabolic cooperativity between oocytes and companion granulosa cells: energy metabolism. Developmental Biology. 279. 20-30.

8. Ying, S., Wang, Z., Wang, C., Nie, H., He, D., Jia, R. et al. (2011). Effect of different levels of short-term feed intake on folliculogenesis and follicular fluid and plasma concentrations of lactate dehydrogenase, glucose, and hormones in Hu sheep during the luteal phase. Reproduction 142. 699-710.

Размещено на Allbest.ru