Инновационные методы получения каллусной культуры якона Smallanthus sonchifolius
Методы получении каллусной культуры in vitro якона (Smallanthus sonchifolius) как источника получения биологически активных соединений. Разработка инновационных методов получения биологически активных веществ на основе культуры растительных клеток.
| Рубрика | Биология и естествознание |
| Вид | статья |
| Язык | русский |
| Дата добавления | 06.08.2023 |
| Размер файла | 639,0 K |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru/
Размещено на http://www.allbest.ru/
Инновационные методы получения каллусной культуры якона Smallanthus sonchifolius
Светлана Алексеевна Гревцова,
Этери Илларионовна Рехвиашвили,
Алан Анзорович Абаев,
Мадина Камболатовна Айлярова,
Марина Юрьевна Кабулова
Аннотация
Актуальность проводимых исследований заключается в получении каллусной культуры in vitro якона (Smallanthus sonchifolius), как источника получения биологически активных соединений. Исследования проводились в стационарных условиях ФГБОУ ВО Горский ГАУ на факультете биотехнологии и стандартизации. В связи с этим, целью данной работы является разработка инновационных методов получения биологически активных веществ на основе культуры растительных клеток якона (Smallanthus sonchifolius). Инновационным методом получения биологически активных веществ является культура растительных клеток и тканей. Биологические технологии способны оптимизировать процесс получения биологически активных веществ растительного происхождения, на основе методологии культивирования in vitro. В растительных организмах происходит синтез основных классов соединений: углеводов белков, жиров, в то же время образуют вторичные метаболиты, макро- и микроэлементы, оказывающие существенное влияние на организм человека. В различных органах растений: корнях и клубнях якона (Smallanthus sonchifolius) содержится большое количество запасных углеводов, к которым относится инулин. Инулин встречается различных растениях, где его содержание составляет до 50% от содержания сухих веществ. Инулин не переваривается пищеварительными ферментами, относится к группе пищевых волокон и является пребиотиком. Одним из таких растений содержащих инулин является якон (Smallanthus sonchifolius). Содержание инулина в сухом веществе якона (Smallanthus sonchifolius) составляет не более 58,6 %. Получение инулина из якона, является перспективным, но и затратным временным и технологическим процессом. В связи с этим, целесообразно разработать технологию и параметры процесса образования in vitro каллусной культуры якона (Smallanthus sonchifolius), необходимость которой обоснована тем, что она является перспективным источником инулина, как биологически активного вещества.
Ключевые слова: инновации, каллусная культура, якон, Smallanthus sonchifolius
Innovative methods for obtaining the callus culture of the yacon Smallanthus sonchifolius
Svetlana A. Grevtsova, Eteri I. Rekhviashvili, Alan A. Abaev, Madina K. Aylyarova, Marina Yu. Kabulova
Abstract
The focus of the current research, carried out in stationary conditions at the Gorsky SAU at the department of Biotechnology and Standardization, has been to obtain in vitro callus culture of the yacon (Smallanthus sonchifolius), which is valuable as a source of biologically active compounds. The purpose of this study has been to develop innovative methods for getting biologically active substances based on the culture of plant cells of the yacon (Smallanthus sonchifolius). An innovative method to gain biologically active substances is the culture of plant cells and tissues, and biological technologies are capable of optimizing the process of receiving biologically active substances of plant origin, based on the in vitro cultivation methodology. In plant organisms, there tends to take place a synthesis of the main classes of compounds, i.e. carbohydrates, proteins, fats, which contemporaneously form secondary metabolites, macro- and microelements that have a significant effect on the human body. In various plant organs, i.e. the roots and tubers of the yacoMn (Smallanthus sonchifolius) contain a large amount of spare carbohydrates, which include inulin. Inulin is found in various plants, where its content comes close to 50% of the dry matter content. Inulin cannot be broken down by digestive enzymes and belongs to the group of dietary fibers and is also a prebiotic. The yacon (Smallanthus sonchifolius) is one of the plant species containing inulin with its content in the dry matter approximating 58.6%. The research on extracting inulin from the yacon may have produced promising results so far, but it is a time-consuming and technologically-complex process. Therefore, it is worthwhile to further pursue the development of technology and parameters relating to the process of formation of in vitro callus culture of the yacon (Smallanthus sonchifolius) on account of it demonstrating considerable potential for being a good source of inulin as a biologically active substance.
Keywords: innovations, callus culture, Smallanthus sonchifolius, yacdn
Введение
Каллусная ткань в биотехнологии имеет очень широкий спектр применения в частности является источником биологически активных веществ (БАВ), а так же может быть использована для микроклонального размножения и индукции структурного морфогенеза [1,3]. Получение биологически активных веществ из растительных образцов якона (Smallanthus sonchifolius) затруднительно, так как он не произрастает на территории РСО-Алания и является интродуцентом из Японии и Дальнего Востока. Перспективным явлеется использование биорессурсного потенциала каллусных клеток якона (Smallanthus sonchifolius). На основе каллусных клеток якона (Smallanthus sonchifolius) возможно получение возобновляемых ценных вторичных метаболитов [2, 4, 6]. У некоторых растений из рода Smallanthus семейства Астровые. удается добиться только образования каллуса, но не получается вызвать накопление достаточной биомассы, необходимой для культивирования БАВ [3, 5, 6]. Подбор оптимальных условий стерилизации растительного материала якона, оптимизации питательных сред и условий культивирования каллусной ткани, полученных из разных частей изучаемых растений, позволит скорректировать биотехнологические методы, что в дальнейшем даст возможность получить накопительную культуру биомассы каллуса якона (Smallanthus sonchifolius) для получения инулина in vitro.
Целью исследования явилась разработка инновационных методов получения биологически активных веществ на основе культуры растительных клеток якона (Smallanthus sonchifolius).
В задачи исследований входило:
* Подбор оптимальных условий стерилизации растительного материала якона.
* Подбор оптимальных питательных сред и условий культивирования эксплантов якона.
* Изучение особенностей роста и развития растений в ходе процесса культивирования якона.
Материалы и методы исследования
* Образцы якона (Smallanthus sonchifolius), выращенные в коллекционном питомнике Горского ГАУ послужили материалом для исследований.
* Исследования образцов проводили на основе нормативной документации соответствующей направлению исследований.
* Согласно ГОСТ 23637-79 проводили отбор средних проб образцов якона (Smallanthus sonchifolius).
* Изучение питательной ценности якона (Smallanthus sonchifolius), анализ основных физических, физико-химических показателей проводили согласно методикам ВИЖ (А.Е. Петухова и др., 1989).
* Исследование культур растительных клеток и тканей, полученых in vitro а также суспензионное культивирование в т.ч. стерилизацию растительных эксплантов, и цитологический анализ проводили в соответствии с методикам: Бутенко (1999); Сорокина И.К. (2002), Р.Г. Бутенко (1964); Р.Г. Бутенко (1987).
Результаты исследований и их обсуждение
Изолированные каллусные ткани были получены в асептическом помещении - ламинар-боксе, стерильными инструментами.
Для получения изолированных клеток растений необходимо соблюдение строгой стерильности, в связи с этим разработана схема стерилизации эксплантов якона (Smallanthus sonchifolius)
На поверхности растительных тканей якона (Smallanthus sonchifolius) находится эпифитная микрофлора и она может служить серьезным источником микробного заражения. Для обеззараживания посадочного материала проводится поверхностная стерилизация эксплантов.
Предварительно определяют место извлечения экспланта, и эту часть растения промывают многократно водой. Затем извлекают различные варианты эксплантов и осуществляют стерилизацию согласно схеме приведенной в табл. 1.
Таблица 1. Схема стерилизации эксплантов якона (Smallanthus sonchifolius).
Table 1. Scheme of sterilization of explants of yacon (Smallanthus sonchifolius).
|
Параметры процесса/ Process parameters |
Экспланты якона (Smallanthus sonchifolius) / Explants of the yacon (Smallanthus sonchifolius) |
||||||
|
Дезинфицирующий раствор / Disinfectant solution |
Н2О2 |
C2H5OH |
NaOCl |
C2H5OH |
H2O |
H2O |
|
|
Время дезинфекции (мин) / Disinfection time (min) |
5 |
5 |
5 |
5 |
10 |
10 |
Источник: составлено авторами на основании данных исследований.
Source: compiled by the authors on the basis of research data.
Нами был осуществлен подбор режимов асептики якона (Smallanthus sonchifolius):
1. Предварительная стерилизация исходного растительного материала - якона (Smallanthus sonchifolius).
2. Постстерилизация - отмывание объекта якона (Smallanthus sonchifolius) от стерилизующего раствора порциями дистиллята.
3. Инструменты и материалы необходимые для работы стерилизовали в автоклаве в течение 1 ч при 200 кПа, а также питательную среду автоклавировали в течение 20 минут при 70 - 80 кПа.
На следующем этапе эксперимента нами была усовершенствована среда для культивирования стерильных эксплантов якона. Культивирование растительных клеток осуществляли на среде Мури- синге-Скуга модифицированной селеном Se. Селен в качестве модификатора был выбран, как активный компонент влияющий на устойчивость растений к разного вида стрессам: окислительного стресса, УФ-облучения, солевого стресса. Селен в питательной среде может интенсифицировать обменные процессы в эксплантах. Такая модифицированная среда является оригинальной по составу, и позволяет ускорить процессы органогенеза якона.
каллусная культура якон
Таблица 2. Питательная среда Мурасиге-Скуга для получения каллусных культур якона (Smallanthus sonchifolius), модифицированная
Table 2. Murashige-Skuga nutrient medium for obtaining callus cultures of yacon (Smallanthus sonchifolius), modified
|
Компоненты / Components |
Количество, мг/л / Quantity, mg/l |
|
|
Макро-соли (по Мурасиге-Скуга) / Macro-salts (according to Murashiga-Skuga) |
50 |
|
|
Микро-соли (по Мурасиге-Скуга) / Micro-salts (according to Murashiga-Skuga) |
1 |
|
|
Пиридоксин / Pyridoxine |
1 |
|
|
Тиамин / Thiamine |
1 |
|
|
Аскорбиновая кислота / Ascorbic acid |
1 |
|
|
Феруловая кислота / Ferulic acid |
1 |
|
|
Индолилуксусная кислота / Indolylacetic acid |
1 |
|
|
Кинетин / Kinetin |
1 |
|
|
Fe-хелат / Fe-chelate |
5 |
|
|
Сахароза / Sucrose |
20000 |
|
|
Селен Se / Selenium |
12,5 |
|
|
Агар / Agar |
7000 |
|
|
рН - 5,8 |
Нами обоснованно, что на образование культуры каллусных клеток влияют внешние условия, в которых оказывается эксплант. Это - физические факторы, такие как свет, температура, аэрация, влажность. В связи с этим, были подобраны оптимальные условия для культивирования каллусных тканей. Кроме того, были подобраны оптимальные условия для культивирования каллусных тканей якона это температура 25,5оС, наличие освещенности 800 люкс и полная темнота, постоянная аэрация, оптимальная влажность составила 65 %.
Следующим этапом исследований было проведение эксперимента, где условиями экспозиции эксплантов были «свет» и «полная темнота». На каждую выбранную позицию было заложено по 20 эксплантов. В результате экспозиции «на свету» оказалось жизнеспособными - 75%. эксплантов, а в экспозиции «полная темнота» - 85%, что на порядок выше. Из проведенного исследования можно заключить: процессы фотосинтеза в экспозиции «полная темнота» - замедлены, и в связи с этим дифференцировка клеток оказывается низкой и идет накопление биомассы не дифференцированных клеток. Результаты приведены в табл. 3.
Таблица 3. Влияние условий экспозиции на жизнеспособность эксплантов якона в условиях in vitro
Table 3. Effect of exposure conditions on the viability of yacon explants under in vitro conditions
|
Условия экспозиции / Exposure conditions |
Количество эксплантов, шт. / Number of explants pcs |
Инфицировано, шт. / Infected pcs. |
Жизнеспособность / Viability |
||
|
шт. |
% |
||||
|
Свет / Light |
20 |
5 |
15 |
75 |
|
|
Полная темнота / Total darkness |
20 |
3 |
17 |
85 |
Источник: составлено авторами на основании данных исследований.
Source: compiled by the authors on the basis of research data.
Из всего выше изложенного следует, что экспозиция «полная темнота» на 10% явилась оптимальной для накопление биомассы не дифференцированных клеток каллусной культуры якона, которая может быть использована для синтеза биологически активных соединений.
В результате данного эксперимента получена in vitro каллусная культура якона (Smallanthus sonchifolius), которая имеет кремовый цвет, рыхлую водянистую структуру, клетки легко распадаются на отдельные агрегаты; средней плотности, с хорошо выраженными меристематическими очагами, на 10% больше в объеме, которая может являться активным продуцентом инулина.
Рис. 1. Каллусная культура якона.
Fig. 1. Yacon callus culture.
Источник: составлено автором на основании данных исследований.
Source: compiled by the authors on the basis of research data.
Заключение
* Питательная среда для получения и культивирования каллусных клеток якона (Smallanthus sonchifolius) - среда Мурасиге-Скуга - модифицированная, дополненная селеном работает эффективно.
* Период выращивания in vitro каллусной культуры якона (Smallanthus sonchifolius) составляет 10-15 дней.
* В экспозиции «полная темнота» образование клеток каллусной культуры якона на 10% выше по биомассе и может быть использовано для синтеза биологически активных соединений.
* Каллусная культура якона (Smallanthus sonchifolius) имеет кремовый цвет, рыхлую водянистую структуру Каллусная культура якона (Smallanthus sonchifolius) может являться продуцентом инулина.
Список источников
1. Охлопкова Ж.М., Кучарова Е.В. Получение первичных каллусных культур Astragalus propinquus schischk. и их цитологический анализ // Вестник ВГУ: Серия: химия, биология, фармация. 2019. J№ 4. С. 60-66.
2. Получение каллусной культуры донника лекарственного (Melilotus officinalis (l.) pall.) и ее цитоморфологические особенности /Л.М. Теплицкая [и др.] // Ученые записки Таврического национального университета им. В. И. Вернадского. Серия «Биология, химия». 2011. Т. 24(63). № 2. С. 284-290.
3. Томаева З.Р, Цугкиев Б.Г. Интродукция якона в Северную Осетию // Международная научнопрактическая конференция «Рациональное использование биоресурсов в АПК». - Владикавказ, 2006. - С. 179.
4. Гревцова С.А., Наниева Л.Б. Суспензионное культивирование каллусных клеток S. Oppositifolium // Известия Горского государственного аграрного университета. 2013. Т. 50. № 4. С. 272-274.
5. Томаева З.Р Биолого-хозяйственные особенности якона в условиях РСО-Алания и перспективы его использования: автореф. дисс.... канд. биолог, наук: 03.00.32 - Биологические ресурсы. Владикавказ, 2006. - 26 с.
6. Li Z.X., Zhao G.D., Xiong W., Linghu K.G., Ma Q.S., Cheang W.S., Yu H., Wang Y. // Chinese Medicine. 2019. Vol. 14(1): 12. https://doi.org/10.1186/ s13020-019-0234-0.
References
1. Okhlopkova Zh.M., Kucharova E.V Obtaining primary callus cultures of Astragalus propinquus schischk. and their cytological analysis. Bulletin of VSU, Series: Chemistry, biology. Pharmacy. 2019;(4): 60-66. (In Russ.).
2. Teplitskaia L.M., Yurkov I.N., Sidyakin A.I., Dukes I.V. Obtaining callus culture yellow melilot (Melilotus officinalis (l.) pall.) and its cytomorphological features. Scientific notes of Taurida national University. V. I. Vernadsky. Series «Biology, Chemistry». 2011;24(63)(2): 284-290. (In Russ.).
3. Tomaeva Z.R., Tsugkiev B.G., Introduction of yakon to North Ossetia. International scientific and practical conference «Rational use of biological resources in agriculture». Vladikavkaz: 2006. Р 179. (In Russ.).
4. Grevtsova S.A., Nanieva L.B. The suspension cultivation of callus cells of S. oppositifolium. Proceedings of Gorsky State Agrarian University. 2013;50(4): 272-274. (In Russ.).
5. Tomaeva Z.R. Bio-economic characteristics of yacon in the conditions ofNorth Ossetia-Alania and the prospects of its use: dissertation for the degree of candidate of biological Sciences. Vladikavkaz, 2006. (In Russ.).
6. Li Z.X., Zhao G.D., Xiong W., Linghu K.G., Ma Q.S., Cheang W.S., et al. Chinese Medicine. 2019;(14):12. Available from: https://doi. org/10.1186/ s13020-019-0234-0.
Размещено на Allbest.ru
Подобные документы
Исследование особенностей вторичного обмена растений, основных методов культивирования клеток. Изучение воздействия биологически активных растительных соединений на микроорганизмы, животных и человека. Описания целебного действия лекарственных растений.
курсовая работа [119,9 K], добавлен 07.11.2011Проблема сохранности полезных свойств масел при длительном хранении. Роль антиоксидантов как биологически активных веществ, предотвращающих прогоркание масел. выбор оптимального антиоксиданта для определенных веществ.
статья [252,5 K], добавлен 26.06.2007Понятие биологически активных веществ, определение их основных источников. Оценка роли и значения данных соединений в питании человека, характер их влияния на организм. Классификация и типы биологически активных веществ, их отличительные свойства.
презентация [2,0 M], добавлен 06.02.2016Флавоноиды как обширная группа полифенольных соединений, генетически связанных друг с другом. Знакомство с основными особенностями идентификации биологически активных веществ спектрофотометрическим методом в экстрактах листьев красной и чёрной смородины.
статья [68,9 K], добавлен 22.08.2013Изучение изолированного и сочетанного действия 1,1-диметилгидразина и ионов свинца и ртути на состояние мембран эритроцитов. Возможности повышения резистентности мембран с помощью биологически активных веществ (витаминов С, Е и препарата "Селевит").
диссертация [2,8 M], добавлен 25.10.2013Виды биологически активных веществ. Характеристика продуктов липидной природы, области применения. Микроорганизмы - продуценты липидов, способы их культивирования. Технологическая схема экстракционного выделения биожира из биомассы дрожжей, его стадии.
курсовая работа [86,5 K], добавлен 21.11.2014Применение клеточных технологий в селекции растений. Использование методов in vitro в отдаленной гибридизации. Работы по культивированию каллуса с целью получения нового селекционного материала. Гибридизация соматических клеток и ее основные результаты.
реферат [28,6 K], добавлен 10.08.2009Основные способы заражения куриных эмбрионов вирусом. Этапы получения субкультур: снятие клеточного слоя, отделение и посев клеток, методика заражения клеточных культур вирусом, учет результатов. Полуперевиваемые культуры клеток человека и животных.
презентация [4,2 M], добавлен 29.01.2015Оптимальный поиск физиологически активных компонентов питательной среды (нутриентов) и условий культивирования, необходимых разнообразным живым системам для интенсивного роста и синтеза биологически активных соединений: ферментов, антигенов, антибиотиков.
научная работа [379,9 K], добавлен 21.03.2012Плюсы и минусы использования генно-модифицированных источников пищевой продукции. Организмы, подвергшиеся генетической трансформации. Классификация трансгенных растений. Медико-генетическая оценка. Безопасность применения биологически активных добавок.
реферат [194,6 K], добавлен 24.03.2009
