Методика уточненной типизации мтДНК для исследований гибридизации большого (Spermophilus major Pall.) и желтого (S. fulvus Licht.) сусликов

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Методика уточненной типизации мтДНК для исследований гибридизации большого (Spermophilus major Pall.) и желтого (S. fulvus Licht.) сусликов

С.В. Титов

О.В. Чернышова

М.Д. Симаков

А.А. Кузьмин

Аннотация

гибридный популяция суслик

Актуальность и цели. Изучение гибридных популяций в пространстве и времени является актуальной задачей эволюционной биологии и популяционной экологии. Несмотря на довольно успешное изучение современных гибридных зон сусликов (Rodentia, Sciuridae, Spermophilus) в Поволжье, в процессе слежения за гибридными популяциями постоянно возникают вопросы по использованию для этого молекулярно-генетических маркеров. Целью исследования была разработка уточненной методики типирования мтДНК, позволяющей выявлять у особей большого и желтого сусликов, а также их гибридов специфический для Spermophilus fulvus и интрогрессивный привносимый S. major гаплотип А. Материалы и методы. Генетический материал для работы был сформирован из коллекции образцов ДНК кафедры «Зоология и экология» ПГУ. Аналитическая выборка составила 13 образцов ДНК S. fulvus и 18 образцов S. major, полученных от сусликов, отловленных в зоне контакта. При разработке метода уточненной типизации гаплотипа «А» мтДНК были использованы полученные при секвенировании нуклеотидные последовательности контрольного региона (D-loop) (1007 пн) большого суслика (n = 9) и желтого суслика (n = 4). Результаты. Анализ нуклеотидных последовательностей фрагмента гаплотипа «А» мтДНК (от 337 до 692 пн, 355 пн) двух видоспецифических образцов выявил только две области с сайтами узнавания эндонуклеазы рестрикции Fat I, по которым возможно их идентифицировать. При этом для образца S. major ожидается получение трех фрагментов рестрикции (94, 102 и 159 пн), а для образца S. fulvus - двух фрагментов (102 и 253 пн). Выводы. Нуклеотидный анализ имеющихся в базе секвенсов гаплотипа «А» мтДНК сусликов показал правильность выделения видоспецифических признаков уточненной типизации этого гаплотипа мтДНК у S. major и S. fulvus.

Ключевые слова: большой суслик, желтый суслик, межвидовая гибридизация, митохондриальная ДНК, контрольный регион, рестрикционный анализ

Refined mtDNA typing technique for hybridization studies of great (Spermophilus major Pall.) and yellow (S. fulvus Licht.) ground squirrels

S.V. Titov, O.V. Chernyshova, M.D. Simakov, A.A. Kuz'min

Abstract

Background. The research of hybrid populations in space and time is an urgent task of evolutionary biology and population ecology. Despite the rather successful study of modern hybrid zones of ground squirrels (Rodentia, Sciuridae, Spermophilus), there are questions about the use of molecular genetic markers for this in the process of observation of hybrid populations. The purpose of the study was to develop a refined mtDNA typing technique that allows detecting the Spermophilus fulvus-specific and introgressive S. major- introduced haplotype A in individuals of large and yellow ground squirrels, as well as their hybrids. Materials and methods. The genetic material for the work was formed from the collection of DNA samples of the Department of Zoology and Ecology of PSU. The analytical sample consisted of 13 DNA samples of S. fulvus and 18 samples of S. major obtained from ground squirrels caught in the contact zone. When developing the method of refined typing of haplotype «А» mtDNA, the nucleotide sequences of the control region (D-loop) (1007 bp) of the S. major (n = 9) and the S. fulvus (n = 4) obtained during sequencing were used. Results. The analysis of the nucleotide sequences of the mtDNA haplotype "A" fragment (from 337 to 692 bp, 355 bp) of 2 species-specific samples revealed only 2 sites with restriction endonuclease recognition sites by which it is possible to identify them. At the same time, three restriction fragments (94, 102 and 159 bp) are expected to be obtained for the S. major sample, and two fragments (102 and 253 bp) are expected for the S. fulvus sample. Conclusions. Nucleotide analysis of the sequences of haplotype "A" of ground squirrel mtDNA available in the database showed the correctness of the identification of species-specific features of the refined typing of this mtDNA haplotype in S. major and S. fulvus.

Keywords: large ground squirrel, speckled ground squirrel, interspecific hybridization, mitochondrial DNA, Control region, PCR-RFLP analysis

Исследование гибридных популяций в пространстве и времени является актуальной задачей эволюционной биологии и популяционной экологии [1-3]. Без мониторинговых исследований таких популяций трудно понять механизмы проходящего в контактных популяциях процесса межвидовой гибридизации. Прежде всего, это касается выяснения доли участия генофонда родительских видов в формировании генофонда гибридного населения, а также выявления последствий смешения видоспецифических генотипов для видов в целом [4-6]. Использование в исследованиях гибридных и смешанных популяций молекулярно-генетических маркеров ядерной и митохондриальной ДНК (выявляющих гибридное происхождение, направление и силу интрогрессии генов), а также микросателлитной ДНК (выявляющих индивидуальный полиморфизм, родство и родственные связи особей) в исследованиях такого рода поднимает решение указанных проблем на совершенно иной уровень [7-10].

Несмотря на довольно успешное изучение современных гибридных зон сусликов (Rodentia, Sciuridae, Spermophilus) в Поволжье, в частности гибридизации большого (Spermophilus major Pall.) и желтого (S. fulvus Licht.) сусликов [11-14], в процессе слежения за гибридными популяциями постоянно возникают вопросы по использованию для этого молекулярно-генетических маркеров.

Исследования гибридизации большого и желтого сусликов в Заволжье показали, что у расселяющего и вступающего в гибридизацию S. major отмечается высокая доля особей, несущих гаплотип «А» мтДНК [11-14]. Этот митотип был получен видом, вероятно, в процессе былой интрогрессии [15-17]. Кроме того, гаплотип «А» мтДНК является специфичным для аборигенного S. fulvus [15]. При анализе гибридного населения и потока генов из родительских популяций в гибридную возникает довольно сложная методическая задача, связанная с выявлением путей происхождения гаплотипа «А» мтДНК. Является ли этот тип мтДНК привнесенным в гибридную популяцию желтым сусликом, т.е. аборигенным, или он является столь же чужеродным, как и другие типы мтДНК большого суслика, отмечаемые у гибридного населения.

Целью исследования была разработка уточненной методики типирования мтДНК, позволяющей выявлять у особей большого и желтого сусликов, а также их гибридов специфический для S. fulvus и интрогрессивный привносимый S. major гаплотип А.

Материал и методы

Генетический материал для работы был сформирован из коллекции образцов ДНК кафедры «Зоология и экология» ПГУ, полученной при изучении гибридной зоны большого и желтого сусликов (2002-2022 гг.). Аналитическая выборка составила 13 образцов ДНК S. fulvus и 18 образцов S. major, полученных от сусликов, отловленных в зоне контакта (Саратовская область, Краснокутский район, с. Усатово, N50.773787, Е46.898492).

Молекулярно-генетические исследования проводили на базе лаборатории молекулярной экологии и систематики животных кафедры зоологии и экологии Пензенского государственного университета.

ДНК выделяли из образцов ткани, зафиксированных после биопсии в этаноле (96 %) по общепринятой хлороформ-фенольной методике [18]. Полимеразную цепную реакцию (PCR) проводили в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 50 мМ Трис-HCl (pH 8.9), 20 мМ сульфата аммония, 20 мкМ ЭДТА, 170 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина (BSA), смесь дезокси- нуклеозидтрифосфатов (200 мкМ каждого из них), 2 мМ хлористого магния, 0,6 мкМ каждого из праймеров, 0,1-0,2 мкг ДНК и 2 ед. акт. Taq-полимеразы (Евроген, Россия).

В работе были использованы специфические для сусликов праймеры, применяемые для амплификации контрольного региона мтДНК: MDL 1 - 5'-TCCACCTTCAACTCCCAAAGC-3' и H00651 - 5'-TAACTGCAGAAGGCT AGGACCAAACCT-3' (1051 пн), а также короткого фрагмента (355 пн) контрольного региона мтДНК: MDL2 D - 5' CCAAATGACTATCCCCTACC-3' и MDL3 R - 5'- GACTAATAAGTCCAGCTACA-3'.

Реакцию проводили при условиях - 95 °С, 3 мин; далее 30 циклов при условиях - 95 °С, 15 с; 60 °С (56 °С), 15 с (отжиг); 72 °С, 80 (30) с. Впоследствии полученные таким образом PCR-продукты были подвергнуты электрофоретическому разделению в 6 % полиакриламидном геле (ПААГ) с целью качественного подтверждения прохождения реакции, определения концентрации продукта и выделения образцов для секвенирования.

При разработке метода уточненной типизации гаплотипа «А» мтДНК были использованы полученные нами ранее нуклеотидные последовательности контрольного региона (D-loop) (1007 пн) большого суслика (n = 9) и желтого суслика (п = 4) (Саратовская область, Краснокутский район, г. Красный Кут, N50.931083, E46.977070; с. Усатово, N50.773787, Е46.898492; с. Дьяков- ка, N50.705099, E46.777554). Видовая принадлежность особей была определена праймерными системами к видоспецифическим ядерным генам (HOX Ь5, 6 in gene p53, Ґgene p53, ZfY(X), SmcY) [15, 19].

Секвенирование фрагментов контрольного региона мтДНК (п = 13) проводили на секвенаторе ABI 3500 (Applied Biosystems) с использованием набора реактивов BigDye® Terminatorv 3.1 Cycle Sequencing Kits при первоначальной подготовке проб в амплификаторе SimpliAmp™ Thermal Cycler. Нуклеотидные последовательности были прочитаны и отредактированы с помощью программы BioEdit 7.1.3.0 [20]. Выравнивание нуклеотидных последовательностей осуществляли по алгоритму ClustalW в программе Mega X с обязательной доводкой вручную [21].

Результаты и обсуждение

В результате «симуляционной» реакции рестрикции на ресурсе NEBcutter V2.0 (http://nc2.neb.com/NEBcutter2) [22, 23] c использованием последовательностей контрольного региона мтДНК (1051 пн) специфических для видов образцов гаплотипа «А» № 1327m (S. major) и № 1335f (S. fulvus) была подобрана эндонуклеаза рестрикции Fat I (сайт узнавания ACATG), которая может их идентифицировать. Для образца 1337m, ассоциирующегося с гаплотипом «А» мтДНК расселяющихся больших сусликов, были выявлены шесть точек рестрикции (121, 169, 235, 308, 495, 588 пн), а для образца 1335f, свойственного аборигенным желтым сусликам, - только пять точек (121, 169, 235, 495, 588 пн). При этом для S. major специфическим будет получение шести фрагментов, а для S. fulvus - только пяти фрагментов рестрикции. В первом случае маркерным будет являться фрагмент 191 пн, во втором - 359 пн (рис. 1,а). Кроме этого, алгоритм «симуляционной» реакции рестрикции позволил подобрать еще пять альтернативных эндонуклеаз - CviAll, Fae I, Hin 1II, Hsp 92II, Nla III, которые также могут быть использованы в анализе.

В последовательностях коротких фрагментов гаплотипа «А» мтДНК (от 337 до 692 пн, 355 пн) контрольных образцов 1327m и 1335f было выявлено только две области с сайтами узнавания эндонуклеазы рестрикции Fat I, по которым возможна их идентификация (рис. 1,6, рис. 2). При этом для образца 1327m ожидается получение трех фрагментов рестрикции (94, 102 и 159 пн), а для образца 1335f - двух фрагментов (102 и 253 пн). Данный вариант идентификации специфичности гаплотипа «А» мтДНК является более быстрым и простым в интерпретации результатов.

Рис. 1. Результаты симуляционной реакции рестрикции (http://nc2.neb.com/NEBc) фрагментов мтДНК больших и желтых сусликов эндонуклеазой Fat I: а - фрагмент мтДНК (контрольный регион, 1051 пн); б - фрагмент контрольного региона мтДНК (354 пн)

Рис. 2. Результаты рестрикции (размеры фрагментов, пн) эндонуклеазы Fat I (сайт узнавания ACATG) фрагментов гаплотипа «А» мтДНК (355 пн) у контрольных образцов 1327m (Spermophilus major) и 1335f (S. fulvus).

Серым цветом указаны области посадки праймеров (MDL2 D, MDL3 R)

Анализ полноразмерных фрагментов D-loop мтДНК (1051 пн) в восьми секвенсах больших сусликов (440m, 443m, 490m, 542m, 616m, 658m, 1230m, 1424m) подтвердил наличие в них двух сайтов узнавания эндонуклеазы рестрикции Fat I (ACATG). Проверка с той же целью трех секвенсов желтых сусликов (656f, 1334f, 1433f) выявила наличие только одного сайта узнавания, спрогнозированного «симуляционной» реакцией рестрикции. Эти результаты косвенно подтверждают работоспособность разработанной уточненной методики типизации гаплотипа «А» мтДНК у больших и желтых сусликов.

Анализ соответствия нуклеотидной последовательности фрагмента гаплотипа «А» мтДНК (от 337 до 692 пн, 355 пн) контрольного образца 1327m, ассоциирующегося с большим сусликом, в базе Web BLAST NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) выявил 66 соответствий по паре видов S. major - S. fulvus, из которых, на наш взгляд, значимыми для нашего исследования являются только семь: S. major, Саратовская область, MW150000 (Percent Identity - 99 %, 354/355 bp); S. major, Оренбургская область, MW149986 (99 %); S. major, Республика Башкортостан, MW149985 (99 %); S. major, Свердловская область, MW149982 (99 %); S. major, Удмуртская Республика, MW149981 (99 %); S. major, Кировская область, MW149980 (99 %); S. fulvus, Западный Казахстан, MW149998 (97 %, 346/355 bp) [16]. При этом во всех проанализированных секвенсах отмечается наличие двух сайтов распознавания эндонуклеазой рестрикции Fat I (ACATG), характерных для больших сусликов, в позициях 159 и 253 и делеции нуклеотида «А» по позиции 329. Аналогичная проверка контрольного образца 1335f дала только семь вариантов соответствий по паре видов S. major - S. fulvus, из которых упомянем четыре: S. fulvus, Западный Казахстан, MW149998 (99 %, 354/355 bp), S. major, Самарская область, MW149988 (99 %), S. major, Западный Казахстан, MW149987 (99 %), S. major, Ульяновская область, MW398138 (99 %) [16, 22]. Во всех этих проанализированных секвенсах отмечается отсутствие сайта распознавания эндонуклеазы Fat I (ACATG), характерного для желтых сусликов, в позиции 159, наличие сайта рестрикции в позиции 253 и делеции нуклеотида «А» по позиции 329. Таким образом, нуклеотидный анализ имеющихся в базе секвенсов гаплотипа «А» мтДНК сусликов показал правильность выделения видоспецифических признаков уточненной типизации этого гаплотипа мтДНК у S. major и S. fulvus. Проведение расширенного рестрикционного анализа имеющейся в нашем распоряжении выборки (около 120 образцов) гаплотипом «А» мтДНК из зоны контакта большого и желтого сусликов в Заволжье позволит с большей надежностью апробировать разработанную методику уточненной типизации мтДНК.

Список литературы

1. Hewitt G.M. Hybrid zones - natural laboratories for evolutionary studies // Trends Ecol. Ev. 1988. № 3. P. 158-167.

2. Barton N.H., Hewitt G.M. Adaptation, speciation and hybrid zones // Nature. Vol. 341. 1989. P. 497-503.

3. Hewitt G.M. Speciation, hybrid zones and phylogeography - or seeing genes in space and time // Mol. Ecol. № 10. 2001. P. 537-549.

4. Harrison R.G. Hybrid zones: windows on the evolutionary process // Ox. Surv. Ev. Biol. 1990. № 7. P. 69-128.

5. Barton N.H. The role of hybridization in evolution // Mol. Ecol. 2001. № 10. Р. 551-568.

6. Howard D.J., Britch S.C., Braswell W.E., Marschall J.L. Evolution in hybrid zones // The Evoiution of Population Biology / ed. R.K. Singh and M.K. Uyenoyama. Cambridge: Cambridge University Press, 2003. P. 297-314.

7. Queller D.C., Strassmann J.E., Hughes C.R. Microsatellites and kinship // Trends Ecol. Ev. 1993. № 8. P. 285-288.

8. Рысков А.П. Мультилокусный ДНК-фингерпринтинг в генетико-популяционных исследованиях биоразнообразия // Молекулярная биология. 1999. Т. 33, № 6. С. 880-892.

9. Sunnucks P. Efficient genetic markers for population biology // Trends Ecol. Ev. 2000. Vol. 15, № 5. Р. 199-203.

10. Funk D.J., Omland K.E. Species-level paraphyly and polyphyly: Frequency, causes, and consequences, with insights from animal mitochondrial DNA // Annu Rev. Ecol. EV. Syst. 2003. Vol. 34. P. 397-423.

11. Титов С.В., Ермаков О.А., Сурин В.Л. [и др.]. Молекулярно-генетическая и биоакустическая диагностика больших (Spermophilus major Pallas, 1778) и желтых (S. fulvus Lichtenstein, 1823) сусликов из совместного поселения // Бюлл. Моск. об-ва испытателей природы. Отд. Биол. 2005. Т. 110, № 4. С. 72-77.

12. Титов С.В. Популяционные и генетические механизмы межвидовой гибридизации млекопитающих (на примере рода Spermophilus): автореф. дис. ... д-ра биол. наук. М.: МГУ, 2009. 48 с.

13. Шмыров А.А. Гибридизация большого и желтого сусликов (экологические и генетические аспекты): автореф. дис. ... канд. биол. наук. М.: ИПЭЭ РАН, 2009. 24 с.

14. Шмыров А.А., Кузьмин Ан.А., Кузьмин Ал.А., Титов С.В. Характеристика гибридов большого (Spermophilus major Pall., 1778.) и желтого (S. fulvus Licht., 1823) сусликов по морфологическим и акустическим признакам // Зоологический журнал. 2012. Т. 91, № 1. С. 119-126.

15. Ermakov O.A., Surin V.L., Titov S.V. [et al.]. A molecular genetic study of hybridization in four species of ground squirrels (Spermophilus: Rodentia, Sciuridae) // Russian Journal of Genetics. 2002. Vol. 38, № 7. P. 796-809.

16. Brandler O.V., Tukhbatullin A.R., Kapustina S.Yu. [et al.]. Variability of Mitochondrial DNA Control Region and Phylogeography of Russet Ground Squirrel (Spermophilus major, Sciuridae, Rodentia) // Russian Journal of Genetics. 2021. Vol. 57, № 7. P. 825-835.

17. Ermakov O.A., Simonov E., Surin V.L. [et al.]. Implications of hybridization, NUMTs, and overlooked diversity for DNA barcoding of Eurasian ground squirrels // PLOS ONE. 2015. Vol. 10, № 1. Р. e0117201. doi:10.1371/journal.pone.0117201.

18. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: А laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. Р. 58-64.

19. Ermakov O.A., Surin V.L., Titov S.V. [et al.]. A Search for Y-Chromosomal Species-Specific Markers and Their Use for Hybridization Analysis in Ground Squirrels (Spermophilus: Rodentia, Sciuridae) // Russian Journal of Genetics. 2006. Vol. 42, № 4. P. 429-438. doi:10.1134/S1022795406040107.

20. Hall T.A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT // Nucleic Acids Symposium Series. 1999. Vol. 41. P. 95-98. URL: https://bioedit.software.informer.com.

21. ClustalW2. URL: http://www.ebi.ac.uk/clustalw.

22. Vincze T., Posfai J., Roberts R.J. NEBcutter: a program to cleave DNA with restriction enzymes // Nucleic Acids Res. 2003. Vol. 31. P. 3688-3691.

23. Титов С.В., Симаков М.Д., Чернышова О.В. [и др.]. Генетические особенности популяционной структуры большого суслика (Spermophilus major Pall.) в связи с динамикой населения во времени // Russian Journal of Ecosystem Ecology. 2020. Vol. 5, № 4. 16 р. URL: https://doi.org/10.21685/2500-0578-2020-4-3.

References

1. Hewitt G.M. Hybrid zones - natural laboratories for evolutionary studies. Trends Ecol. Ev. 1988;(3):158-167.

2. Barton N.H., Hewitt G.M. Adaptation, speciation and hybrid zones. Nature. 1989;341: 497-503.

3. Hewitt G.M. Speciation, hybrid zones and phylogeography - or seeing genes in space and time. Mol. Ecol. 2001;(10):537-549.

4. Harrison R.G. Hybrid zones: windows on the evolutionary process. Ox. Surv. Ev. Biol. 1990;(7):69-128.

5. Barton N.H. The role of hybridization in evolution. Mol. Ecol. 2001;(10):551-568.

6. Howard D.J., Britch S.C., Braswell W.E., Marschall J.L. Evolution in hybrid zones. The Evoiution of Population Biology. Cambridge: Cambridge University Press, 2003:297-314.

7. Queller D.C., Strassmann J.E., Hughes C.R. Microsatellites and kinship. Trends Ecol. Ev. 1993;(8):285-288.

8. Ryskov A.P. Multilocus DNA fingerprinting in genetics and population studies of biodiversity. Molekulyarnaya biologiya = Molecular biology. 1999;33(6):880-892. (In Russ.).

9. Sunnucks P. Efficient genetic markers for population biology. Trends Ecol. Ev. 2000;15(5):199-203.

10. Funk D.J., Omland K.E. Species-level paraphyly and polyphyly: Frequency, causes, and consequences, with insights from animal mitochondrial DNA. Annu Rev. Ecol. EV. Syst. 2003;34:397-423.

11. Titov S.V., Ermakov O.A., Surin V.L. et al. Molecular genetic and bioacoustic diagnostics of great (Spermophilus major Pallas, 1778) and yellow (S. fulvus Lichtenstein, 1823) ground squirrels from the joint settlement. Byull. Mosk. ob-va ispytateley prirody. Otd. Biol. = Bulletin of Moscow Society of Nature researchers. Department of biology. 2005;110(4):72-77. (In Russ.).

12. Titov S.V. Population and genetic mechanisms of interspecific hybridization in mammals (by the example of Spermophilus). DSc dissertation. Moscow: MGU, 2009:48. (In Russ.).

13. Shmyrov A.A. Hybridization of large and yellow ground squirrels (ecological and genetic aspects). PhD abstract. Moscow: IPEE RAN, 2009:24. (In Russ.).

14. Shmyrov A.A., Kuz'min An.A., Kuz'min Al.A., Titov S.V. Characteristics of hybrids of great (Spermophilus major Pall., 1778.) and yellow (S. fulvus Licht., 1823) ground squirrels by morphological and acoustic. Zoologicheskiy zhurnal = Zoological journal. 2012;91(1):119-126. (In Russ.).

15. Ermakov O.A., Surin V.L., Titov S.V. et al. A molecular genetic study of hybridization in four species of ground squirrels (Spermophilus: Rodentia, Sciuridae). Russian Journal of Genetics. 2002;38(7):796-809.

16. Brandler O.V., Tukhbatullin A.R., Kapustina S.Yu. et al. Variability of Mitochondri-al DNA Control Region and Phylogeography of Russet Ground Squirrel (Spermophilus major, Sciuridae, Rodentia). Russian Journal of Genetics. 2021;57(7):825-835.

17. Ermakov O.A., Simonov E., Surin V.L. et al. Implications of hybridization, NUMTs, and overlooked diversity for DNA barcoding of Eurasian ground squirrels. PLOS ONE. 2015;10(1):e0117201. doi:10.1371/journal.pone.0117201.

18. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989:58-64.

19. Ermakov O.A., Surin V.L., Titov S.V. et al. A Search for Y-Chromosomal Species-Specific Markers and Their Use for Hybridization Analysis in Ground Squirrels (Sper-mophilus: Rodentia, Sciuridae). Russian Journal of Genetics. 2006;42(4):429-438. doi:10.1134/ S1022795406040107.

20. Hall T.A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series. 1999;41:95-98. Available at: https://bioedit.software.informer.com.

21. ClustalW2. Available at: http://www.ebi.ac.uk/clustalw.

22. Vincze T., Posfai J., Roberts R.J. NEBcutter: a program to cleave DNA with restriction enzymes. Nucleic Acids Res. 2003;31:3688-3691.

23. Titov S.V., Simakov M.D., Chernyshova O.V. et al. Genetic features of the population structure of the great (Spermophilus major Pall.) ground squirrel in connection with the dynamics of the population over time. Russian Journal of Ecosystem Ecology. 2020;5(4):16. (In Russ.). Available: https://doi.org/10.21685/2500-0578-2020-4-3.

Размещено на Allbest.ru