Метод ПЦР (полимеразной цепной реакци)

Размещено на http://www.allbest.ru/

Содержание

Введение

1. Механизм полимеразной цепной реакции

2. Варианты технологии ПЦР. Детекция результатов ПЦР

3. Иммунологические методы обнаружения ГМИ

4. Использование методов ПЦР для обнаружения ГМИ

Список литературы

Введение

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определенных фрагментов нуклеиновой кислоты (НК) в биологическом материале (пробе).

Открытию полимеразной цепной реакции предшествовало развитие молекулярно- биологических технологий.

ДНК - полимерная молекула, состоящая из повторяющихся блоков - нуклеотидов. Каждый нуклеотид состоит из азотистого основания, сахара (дезоксирибозы) и фосфатной группы. Связи между нуклеотидами в цепи образуются за счет дезоксирибозы и фосфатной группы (фосфодиэфирные связи). В подавляющем большинстве случаев (кроме некоторых вирусов, содержащих одноцепочечную ДНК) макромолекула ДНК состоит из двух цепей, ориентированных азотистыми основаниями друг к другу.

В ДНК встречается четыре вида азотистых оснований (аденин, гуанин, тимин и цитозин). Азотистые основания одной из цепей соединены с азотистыми основаниями другой цепи водородными связями согласно принципу комплементарности: аденин соединяется только с тимином, гуанин - только с цитозином.

Однако возможность использования ПЦР в плане наработки большого количества копий нуклеиновых кислот еще не рассматривалась. Это было связано с техническими трудностями, обусловленными необходимостью трудоемкого синтеза праймеров, и нестабильностью фермента. В начале использования метода ПЦР после каждого цикла нагревания и охлаждения ДНК-полимеразу приходилось добавлять в реакционную смесь, так как она быстро инактивировалась при высокой температуре, необходимой для разделения цепей спирали ДНК. Процедура была очень неэффективной, требовала много времени и фермента.

Таким образом, сформировался принцип использования ПЦР как метода амплификации in vitro заданных фрагментов ДНК с полностью или частично известной последовательностью.

Результатом открытия ПЦР стало почти немедленное практическое применение метода. В 1985 г. Саики с соавторами опубликовали статью, в которой была описана амплификация геномной последовательности в-глобина. С этого момента количество публикаций о применении ПЦР в своей работе стало увеличиваться в геометрической прогрессии.

Особенно бурное развитие метод ПЦР получил благодаря международной программе «Геном человека». Были созданы современные лазерные технологии секвенирования (расшифровки нуклеотидных последовательностей ДНК). Это в свою очередь способствовало значительному росту информационных баз данных, содержащих последовательности ДНК биологических объектов.

В настоящее время предложены различные модификации ПЦР, показана возможность создания тест-систем для обнаружения микроорганизмов, выявления точечных мутаций, описаны десятки различных применений метода.

Таким образом, открытие метода ПЦР стало одним из наиболее выдающихся событий в области молекулярной биологии за последние десятилетия. Это позволило поднять медицинскую диагностику на качественно новый уровень.

1. Механизм полимеразной цепной реакции

Для проведения ПЦР необходимо наличие в реакционной смеси (РС) ряда основных компонентов.

Праймеры - искусственно синтезированные олигонуклеотиды, имеющие, как правило, размер от 15 до 30 нуклеотидов, идентичные (комплементарные) противоположным концам противоположных цепей искомого участка ДНК-мишени. Служат затравкой для синтеза комплементарной цепи с помощью ДНК-полимеразы и играют ключевую роль в образовании и накоплении продуктов реакции амплификации.

Правильно подобранные праймеры обеспечивают специфичность и чувствительность тест-системы и должны отвечать ряду критериев:

> быть специфичными. Особое внимание уделяют 3'-концам праймеров, так как именно с них Taq-полимераза начинает достраивать комплементарную цепь ДНК. При недостаточной специфичности праймеров в процессе ПЦР будут образовываться продукты, которые, с одной стороны, могут быть идентифицированы как ложноположительный результат, а с другой стороны, на процессы их накопления будут расходоваться компоненты реакционной смеси, что приведет к значительной потере чувствительности реакции как таковой;

> не должны образовывать димеры и петли - устойчивые двойные цепи при отжиге праймеров самих на себя или друг с другом;

> область отжига праймеров должна находиться вне зон мутаций, делеций или инсерций в пределах видовой или иной специфичности, взятой в качестве критерия при выборе праймеров. При попадании в такую зону не происходит отжига праймеров и, как следствие, возникает ложноотрицательный результат. Taq-полимераза - термостабильный фермент, который обеспечивает достраивание 3'-конца второй цепи ДНК согласно принципу комплементарности.

2. Варианты технологии ПЦР. Детекция результатов ПЦР

На данный момент разработаны варианты постановки ПЦР, направленные на решение следующих задач: увеличение эффективности реакции и снижение риска образования неспецифических продуктов; проведение качественного и количественного анализа искомых участков молекулы ДНК/РНК.

Наиболее распространенными модификациями ПЦР являются:

> ПЦР с горячим стартом (англ. hot-start PCR) - модификация метода, направленная на предотвращение неспецифического взаимодействия компонентов реакционной смеси до достижения оптимальных условий амплификации.

В зависимости от ГЦ-состава и размера праймеры имеют определенную температуру плавления (Тm - температура, при которой половина ДНК-матриц образует комплекс с олигонуклеотидным праймером в присутствии фермента - полимеразы). При соблюдении оптимальных условий (температура отжига праймеров близка по значениям к температуре плавления) праймер образует стабильную комплементар- ную связь с матрицей. Если же температура реакционной смеси ниже Тm, то возможен неспецифический отжиг праймера на матрицу, образование димеров. Если в данный момент активный фермент в реакционной смеси отсутствует, то элонгация образовавшегося неспецифического комплекса не происходит, что позволяет избежать ложноположительных результатов ПЦР

3. Иммунологические методы обнаружения ГМИ

Присутствие в продукте нового белка дает возможность применять для определения ГМО иммунологические методы. Они наиболее просты в исполнении, имеют относительно низкую стоимость и позволяют определить конкретный белок, несущий новый признак. В настоящее время разработаны тест-системы, применяя которые можно проводить количественное определение модифицированного белка в таких продуктах, как изоляты и концентраты соевого белка и соевая мука. Однако в случае анализа пищевых продуктов, при производстве которых исходное сырье подвергается значительной технологической обработке (высокая температура, кислая среда, ферментативная обработка и др.), иммунологический анализ может давать нестабильные или плохо воспроизводимые результаты из-за денатурации белка. При исследовании, например, колбасных и кондитерских изделий, продуктов детского питания, пищевых и биологически активных добавок к пище иммуноферментный анализ неприемлем.

Возможность определения белка ограничена уровнем его содержания в продукте. Так, в большинстве генетически модифицированных культур, представленных на мировом продовольственном рынке, уровень модифицированного белка в частях растений, употребляемых в пищу, ниже 0,06%, что затрудняет проведение иммуноферментного анализа. [4]

4. Использование методов ПЦР для обнаружения ГМИ

Строение ДНК одинаково во всех клетках организма, поэтому любая часть растения может быть использована для идентификации ГМО, что невозможно в случае определения модифицированного белка. ДНК более стабильна, чем белок, и в меньшей степени разрушается при технологической или кулинарной обработке пищевых продуктов, что делает возможным определение в них ГМО. Метод идентификации рекомбинантной ДНК включает несколько этапов:

* выделение ДНК из пищевого продукта

* умножение (амплификация) специфической ДНК, характерной для определенного сорта генетически модифицированного растения

* электрофорез продуктов полимеразной цепной реакции (ПЦР) и фотографирование результатов электрофореза.

Как было указано выше, при создании трансгенного растения в геном вносится генетическая конструкция, которая состоит не только из гена, определяющего новый признак, но и последовательностей ДНК, регулирующих работу гена. Для этих целей используется метод ПЦР с маркерами на последовательность ДНК (ген), определяющий новый признак. Результат анализа позволит обнаружить тот сорт генетически модифицированного растения, который был использован при производстве анализируемого продукта.

В 2000 году метод ПЦР в качестве основного для идентификации ГМИ растительного происхождения в пищевых продуктах. Чувствительность этого способа позволяет определить ГМИ в продукте, даже если его содержание не превышает 0,9%. Такой подход соответствует рекомендациям ВОЗ, принятым в большинстве стран мирового сообщества.

Список литературы

полимеразный цепной реакция генномодифицированный

1. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. М.: Мир, 2015. 589 с.

2. Кузнецов Вл.В., Куликов А.М., Митрохин И.А., Цыдендамбаев В.Д. Генетически биологическая модифицированные безопасность // организмы Федеральный и вестник экологического права ЭКОСинформ. 2014 г. № 10. С.1-64.

3. Зоны, свободные от ГМО. /Под ред. В.Б. Копейкиной. М. ГЕОС. 2017 - 106 с.

4. Генетически модифицированные организмы и обеспечение биологической безопасности. Кишинев: Экоспектр-Бендеры, 2017. 60 с.

5. http://www.biengi.ac.ru/

6. http://www.iacgea.ru

7. http://www.depart.drugreg.ru/CNIS/TXT/REESTR/gena.htm

8. http://www.groundup.org/

Размещено на Allbest.ru