Размещено на http://www.allbest.ru/

УЧРЕЖДЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ ”ПОЛЕССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ“

Факультет биотехнологический

Кафедра биотехнологии

УПРАВЛЯЕМАЯ САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА № 2

на тему: Генетически модифицированные микроорганизмы

Студент 5 курса, гр.18БТ-1 Максим Витальевич Вечёрко

Биология (по направлениям)

Проверил Наталья Павловна Дмитрович Доцент кафедры

Биотехнологии Кандидат сельскохозяйственных наук

ПИНСК 2022

ОГЛАВЛЕНИЕ

генетический микроорганизм экосистема ген

ВВЕДЕНИЕ

1. ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ - ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ, АНАЛИЗ И МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ ПОВЕДЕНИЯ В ЭКОСИСТЕМЕ

2. ВЫДЕЛЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ ИЗ ПРИРОДНЫХ ЭКОНИШ, ПОНЯТИЕ О БИОМАРКЕРНЫХ И БИОРЕПОРТЕРНЫХ ГЕНАХ

3. МОЛЕКУЛЯРНАЯ ЭКОЛОГИЯ И ПРОБЛЕМЫ НЕКУЛЬТИВИРУЕМОГО СОСТОЯНИЯ КЛЕТОК

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ИСТОЧНИКОВ

ВВЕДЕНИЕ

Достижения молекулярной биологии, генетики микроорганизмов привели к возникновению новой экспериментальной технологии - генетической инженерии. Появилась реальная возможность создания штаммов микроорганизмов с заданными свойствами, что оказало влияние на развитие современной биотехнологии, особенно направления, связанного с микробиологическим синтезом белков высших эукариотических организмов, получение которых из традиционных источников затруднено. Для того чтобы производство биологически активных соединений микроорганизмами было рентабельным, необходимо использовать высокоэффективные штаммы-продуценты. Создание подобных продуцентов невозможно без знания особенностей организации генома и регуляции метаболизма микробной клетки [4].

1. ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ - ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ, АНАЛИЗ И МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ ПОВЕДЕНИЯ В ЭКОСИСТЕМЕ

Значительную часть ГМО составляют генетически модифицированные микроорганизмы (ГЕМОМ). В качестве векторов прокариот используют плазмиды и фаги. Поскольку микробные клетки относительно просто устроены, быстро растут и легко подвергаются «конструированию», то ГЕМОМ широко используют в фундаментальных научных исследованиях и прикладных областях. Современная наука использует ГЕМОМ в качестве моделей для решения ряда проблем биологии и медицины (процессы старения и регенерации, закономерности развития некоторых заболеваний и т.д.). Для биотехнологических производств ГЕМОМ - это перспективные продуценты ценных веществ. При помощи генетически модифицированных микроорганизмов получают пищевые добавки, аминокислоты, витамины, ароматизаторы, ферменты, фармацевтические препараты, вакцины, а также некоторые дорогостоящие соединения, ранее производимые путем традиционного химического синтеза. Методами генной инженерии удается не только увеличить продуктивность процесса и удешевить его, но и получить микробиологическим путем необычные для микробного метаболизма продукты при физиологических условиях. Замена химического синтеза на биологический привлекательна с точки зрения экологической безопасности и использования возобновляемых природных источников. Международные стандарты качества производства (GMP) требуют, чтобы после завершающей стадии очистки конечный продукт не содержал микробной ДНК.

В последнее время растет число ГЕМОМ, предлагаемых для разрушения различных загрязнений как в природных местообитаниях, так и в искусственных очистных установках. Новое направление генно-инженерных разработок - это создание микроорганизмов-пробиотиков с заданными свойствами на основе молочнокислых бактерий. Получены штаммы с повышенной активностью использования лактозы и гидролиза белков молока, обладающие устойчивостью к бактериофагам. Перенос генов из неродственных штаммов позволяет «добавить» молочнокислым микроорганизмам ряд дополнительных возможностей (например, способность к образованию (а-кетоглутарата из глутамата) [6].

Потенциальные проблемы, возникающие при неконтролируемом внесении ГЕМОМ в окружающую среду, вызвали широкие дебаты в научном сообществе, вовлекшие поборников защиты окружающей среды и правительственные органы. Основной вопрос заключался в том, как долго ГЕМОМ и их ДНК будут существовать в окружающей природе и смогут ли модифицированные гены от ГЕМОМ быть переданы аборигенным микроорганизмам. Первоначальные эксперименты показали, что ГЕМОМ быстро отмирают при внесении в природные ценозы, поскольку не способны конкурировать с существующими сообществами микроорганизмов. Предполагали, что чужеродная ДНК, внесенная в ГЕМОМ, снижает конкурентоспособность живых клеток по сравнению с «дикими» штаммами из-за больших энергетических затрат на репликацию ДНК. Это предположение было подтверждено при изучении выживания в почве ГЕМОМ Pseudomonas sp. с введенной плазмидой, несущей гены расщепления мощного гербицида, 2,4,5-трихлорфеноксиаце- тата. Клетки ГЕМОМ-исевдомонад быстро исчезали из почвенного образца и через несколько дней не обнаруживались при прямых высевах на среды. Однако спустя несколько недель ГЕМОМ-псевдомонады вновь можно было обнаружить в образце, что говорит о том, что они не отмирали полностью. Результаты этих и последующих экспериментов показали, что модифицированные псевдомонады могут жить в почве в течение длительного времени. Другие наблюдения показали существование ГЕМОМ в почвенных и водных экосистемах в виде некультивируемых форм бактерий. Специальные исследования также показали, что ДНК разрушенных ГЕМОМ-клеток, адсорбированная на частицах почвенной глины, устойчива к действию ДНК-аз и может существовать в таком «иммобилизованном» виде достаточно долго, а затем быть вовлечена в процесс трансформации. Гены в почвенных и водных экосистемах могут быть также перенесены в результате трансдукции. Так, через год после введения в водную экосистему специфического штамма Pseudomonas sp. В13 в ней были обнаружены виды, расщепляющие 3-хлорбензол (3-ХБ), которые ранее из этой экониши не выделяли. Более того, в геноме нового изолята были обнаружены последовательности, принадлежащие штамму В13. Предполагают, что новый штамм возник в результате обмена частью генома между аборигенной бактерией и внесенным штаммом В13, не способным утилизировать 3-ХБ. Таким образом, перенос генетического материала в природных нишах возможен в течение значительного времени после введения чужеродных генов, и следствием этого может быть изменение пула генов микробиоты данной экосистемы, что отразится на биоразнообразии и стабильности данного сообщества [3].

Еще одна проблема - это использование при получении ГМО маркерных микробных генов устойчивости к антибиотикам, которые могут перейти к микробиоте кишечника, что приведет к невозможности лечения многих заболеваний с помощью антибиотиков. В связи с этим с декабря 2004 г. в странах ЕС запрещена продажа ГМО и их продуктов с микробными генами устойчивости к антибиотикам.

Любая интродукция ГЕМОМ в природные экониши опасна из-за возможности горизонтального переноса рекомбинантных генов от ГЕМОМ к другим представителям микробного сообщества. Ситуация осложняется отсутствием адекватных методов выявления и контроля над распространением ГЕМОМ в окружающей среде. Одним из путей может быть внедрение в переносимый наследственный материал генов «программируемой клеточной смерти», которые будут экспрессироваться после того, как функция ГЕМОМ в данном местообитании будет выполнена. Если эти гены будет нести рекомбинантная плазмида, то ее передача другому микроорганизму будет вызывать его гибель. Тем самым будет решена проблема распространения этих плазмид в окружающей среде [2].

Оценка риска вредных воздействий на плодородие почвы- как с экологической, так и с сельскохозяйственной точки зрения плодородие почвы зависит от присутствия микроорганизмов, влияющих на ее физико-химические свойства: рН, деструкцию и трансформацию остатков биоты. Однако не исключено, что интродуцированные ГММ могут делать почву непригодной для сельского хозяйства. Когда почва является защищаемым природным объектом, оценка риска интродукции ГММ должна зависеть от возможности спонтанного возвращения почвы в исходное состояние либо от возможности уменьшить или ограничить отрицательное воздействие ГММ на почву.

Уровень вероятного риска ГММ для почвы и ее плодородия ранжируется с помощью четырех уровней:

1) вредные последствия не обнаруживаются, или их появление маловероятно;

2) временные отрицательные биохимические изменения почвы и самоограничивающееся распространение нежелательных генетических свойств;

3) значительные биогеохимические изменения, отрицательно влияющие на плодородие почвы. Возможна специальная обработка, восстанавливающая исходные характеристики почвы. Имеет место массовое распространение нежелательных генетических свойств. Однако имеются возможности ограничивать или контролировать их распространение;

4) нежелательные стойкие и необходимые изменения почвы с изменениями ее плодородия. Массовое распространение нежелательных характеристик. Контроль их распространения невозможен. Однако неизвестно ни одного микроорганизма, обладающего свойствами 4-го уровня, и мала вероятность, что такой ГММ можно сконструировать.

Оценка риска вредных воздействий ГММ на биоразнообразие в экосистемах - актуальность этой оценки вызвана не столько необходимостью сохранения каких-либо конкретных биологических видов, сколько необходимостью сохранения всего генофонда как источника генетической изменчивости.

В этом случае для оценки риска тяжести сложившейся ситуации от интродукции ГММ в открытую экосистему предлагается также исходить из четырех градаций:

1) вредные последствия не обнаруживаются или крайне маловероятны;

2) временное и локальное вытеснение аборигенных видов, самоограничивающееся распространение ГММ;

3) массовое распространение интродуцированных ГММ. значительное вытеснение аборигенных видов, восстановление их численности возможно лишь за счет специальных мероприятий, и такие средства для ограничения и контроля такого распространения имеются;

4) нежелательное стойкое и необратимое вытеснение аборигенных и резидентных видов, массовое распространение интродуцированных ГММ. Отсутствует возможность его ограничения или контроля [8].

2. ВЫДЕЛЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ ИЗ ПРИРОДНЫХ ЭКОНИШ, ПОНЯТИЕ О БИОМАРКЕРНЫХ И БИОРЕПОРТЕРНЫХ ГЕНАХ

Большинство микроорганизмов, растущих в природных образцах, еще ждут своей очереди быть выделенными в чистые культуры. По некоторым оценкам, мы можем культивировать меньше 0,1 % всего микробного разнообразия.

Десятки тысяч видов микроорганизмов, живущих как симбионты животных и растений, нуждаются в выделении и идентификации. Хотя многие из таких микроорганизмов относят к так называемым «некультивируемым» и, таким образом, остающимся недоступными классическим микробиологическим методам идентификации, существует несколько способов, позволяющих оценить их разнообразие и распространение. Такие методы включают прямые микроскопические наблюдения и различные приемы на основе молекулярной диагностики, включая амплификацию диагностирующих последовательностей генома, кодирующих синтез молекулы 16S рРНК, для последующей их расшифровки.

Методы прямого прижизненного окрашивания различных проб воды, почвы и осадков позволяют с уверенностью считать, что этот метод выделяет гораздо больше живых клеток, чем высевы на различные среды. Другими словами, результаты прямого счета живых клеток микроорганизмов показывают, что пока мы нс можем вырастить и идентифицировать более 99% видов микроорганизмов из таких проб. Такое большое расхождение в результатах прямого счета в сравнении с высевом на среды поставило вопрос: являются ли прижизненно окрашенные микроорганизмы живыми или мертвыми? При применении в качестве прижизненного красителя акридинового оранжевого было замечено, что часть клеток окрашивается с последующей зеленой флуоресценцией, часть остается оранжевой. Это привело вначале к неверному выводу, что зеленые клетки - живые, а оранжевые - мертвые. Впоследствии было, однако, выяснено, что цвет флуоресценции зависит от отношения ДНК/белок в клетке: активно делящиеся клетки выглядят зелеными, а растущие более медленно или покоящиеся клетки дают оранжевую флуоресценцию, оставаясь при этом живыми.

В дальнейшем были разработаны более прямые методы, основанные на оценке метаболитической активности клеток (клеточное дыхание), позволяющие отличить живые клетки от неживых в природных пробах. Методы основаны на применении различных солей тетразолия, которые при восстановлении в клетке дегидрогеназами (дыхательная активность) превращаются в нерастворимый формазан красного цвета, что можно обнаружить визуально под микроскопом. Есть способ различать живые, мертвые и поврежденные (умирающие) клетки при измерении состояния мембранного потенциала с помощью флуорохромов. Предлагают также добавление к пробам живых клеток ингибитора клеточного деления (налидиксовой кислоты), при этом активно растущие клетки будут удлиняться без вступления в фазу бинарного деления [9].

Возможно, многие микроорганизмы, наблюдаемые при прямом микроскопировании как живые, вступили в состояние «некультивируемой формы бактерий (НФБ)» (см. подразд. 2.5). Эта концепция была предложена американским микробиологом Р.Колвелл в 1987 г. Вначале концепция была встречена с критикой, однако к настоящему времени получила повсеместную поддержку. Показано, что часть клеток из природных образцов не дает колоний на лабораторных средах, хотя в природе они ведут активный образ жизни и патогенные формы удерживают свою вирулентность по отношению к животным. Эксперименты четко показали, что такие патогены человека, как Legionella pneumophila, Salmonella enter it id is, Vibrio cholerae и V. vulnificus, постоянно образуют НФБ формы в природных эконишах. Таким образом, становится понятной важность прямых микроскопических наблюдений природных образцов для обнаружения НФБ патогенов [1].

Для наблюдения за некультивируемыми формами микроорганизмов в природных образцах применяют методы молекулярного анализа. Разработано несколько десятков диагностических проб- последовательностей ДНК/РНК для специфического обнаружения определенных видов, родов, семейств или таксонов более высокого порядка непосредственно в природных образцах. С использованием таких последовательностей было обнаружено, что морские воды содержат многие виды архей и бактерий, которые не поддаются культивированию в лаборатории. Наиболее подходящие для такой диагностики олигонуклеотидные пробы длиной 18 - 20 нуклеотидов, так как они легко гибридизируются со специфическим участком ДНК искомого организма. Даже небольшие количества не культивируемых форм могут быть обнаружены в популяциях природных образцов с помощью ПЦР-амплифика- ции диагностических последовательностей ДНК. Жизнеспособные клетки микроорганизмов могут быть идентифицированы также с помощью специфических и PHК методом обратной транскрипции, при этом следует помнить, что время полужизни некоторых бактериальных иРНК может составлять меньше минуты.

Биорепортёрные гены в молекулярной биологии - гены, которые присоединяют к регуляторным последовательностям других генов для исследования проявлений генов в культурах клеток. Некоторые репортёрные гены используются исследователями, так как их экспрессия придаёт организму чётко выраженные легко измеряемые характеристики, некоторые,- так как они являются селективными маркерами. Репортёрные гены используют для того, чтобы определить уровень экспрессии гена в клетке или в популяции. Часто в генно-инженерные конструкции встраивают в качестве репортёра ген LacZ.

Биомаркерный ген- ген, для которого известна точная хромосомная локализация и, как правило, имеется четкое фентиопическое выражение (мутантный фенотип, ферментативная активность и др.). Биомаркерный ген используются в основном при проведении картирования других генов [5].

3. МОЛЕКУЛЯРНАЯ ЭКОЛОГИЯ И ПРОБЛЕМЫ НЕКУЛЬТИВИРУЕМОГО СОСТОЯНИЯ КЛЕТОК

Молекулярная экология - это новая стратегия изучения разнообразия организмов в природных сообществах. Исследования в этом направлении призваны ответить на следующие основные вопросы: 1. Какова структура сообщества в исследуемом ареале (участок суши, пресноводный бассейн, участок морской или океанической акватории и т.п.). 2. Меняется ли структура сообщества в исследуемом ареале под воздействием тех или иных причин и каким образом. 3. Меняются ли взаимоотношения между участниками сообщества в процессе изменения структуры сообщества, в чем состоят эти изменения. 4. Как происходит обмен генетическим материалом между участниками экосистемы, имеет ли место так называемый горизонтальный перенос генетической информации. Ответ на последний вопрос особенно важен в связи с широким распространением в природных сообществах генетически модифицированных микроорганизмов.

В последние годы систематика и филогения организмов строятся все чаще на различиях в структуре генома и переходят в область геносистематики, основанной на новейших достижениях молекулярной биологии. Появление и усовершенствование различных методов молекулярной биологии (гибридизационного анализа, секвенирования, денатурирующего градиентного гель электрофореза, молекулярного клонирования и полимеразной цепной реакции) привели к созданию методологии молекулярной экологии. Использование описываемых в пособии молекулярно-биологических методов дает возможность расширить имеющиеся представления о микробном разнообразии в природных субстратах. Стало возможным изучение биоразнообразия на основании анализа отдельных элементов их генетического материала без выделения отдельных микроорганизмов в чистую культуру (Нетрусов и др., 2004). В связи с этим возможным становится учет, так называемых, «некультивируемых форм» бактерий - не способных расти в лабораторных условиях, составляющих подавляющую часть микробных сообществ. 4 Масштабы объектов молекулярной биологии могут быть самые разные: от слона до невидимого невооруженным глазом организма, при этом объектом молекулярных методов анализа является молекула ДНК или РНК. Следовательно, исходным этапом всех молекулярно-генетических методов является получение образцов ДНК. Источником геномной ДНК (матрицы) могут быть субстраты различной природы (растворы: плазма крови, речная или морская вода, суспензии (почва), клеточная биомасса). Возможность проведения молекулярно-генетического анализа с небольшим количеством легкодоступного биологического материала является методическим преимуществом методов данной группы. Выделенная ДНК одинаково пригодна для проведения различных исследований и может долго сохраняться в замороженном виде [4].

Некультивируемыми (НФ) называют такие формы микроорганизмов, которые в ответ на действие неблагоприятных факторов прекращают рост на питательных средах, но сохраняют жизнеспособность, а при улучшений условий культивирования возобновляют пролиферацию. Некультивируемое состояние (НС) обнаружено у многих патогенных видов. В связи с тем, что рутинные бактериологические методы не эффективны для обнаружения НФ, истинные размеры распространения феномена в объектах окружающей среды остаются мало изученными. С целью решения вопроса о значении феномена в эпидемиологии интенсивно изучаются индукторы НС и реверсии. Ежегодно публикуется большое количество работ на эту тему.

В настоящее время известно около 45 видов микроорганизмов, относящихся к 30 родам, у которых обнаружено НС. 30 видов патогенны для человека, 15 видов условно-патогенны или являются эубионтами человека, животных или растений. Среди бактерий, у которых обнаружено НС, есть возбудители таких грозных инфекций, как чума, холера, тулерямии, легионеллез. Более 60% видов, образующих НФ, грамотрицательны. Около 40% составляют бактерии, относящиеся к трем другим отделам царства Procariotae: грамположительные бактерии, микоплазмы и архебактерии. Эти факты указывают на универсальность некультивируемого состояния как общебиологического явления, расширяют первоначально сложившееся представление о спороподобном состоянии НФ и наглядно демонстрируют широкое распространение феномена в природе [7].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Генетически модифицированные микроорганизмы достаточно плотно вошли в множество сфер жизни человечества тем самым улучшив жизнь, с их помощь стало возможно синтезировать множество полезных соединений в том числе и жизненно необходимых некоторым людям (отрасль фармацевтики) которые ранее возможно было лишь извлечь из других организмов и в очень незначительных количествах. Поэтому я считаю, что развитие в данном направлении является положительным и довольно перспективным.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Булыгина Е.С., Кузнецов Б.Б., Марусина А.И., Турова Т.П., Кравченко И.К., Быкова С.А., Колганова Т.В., Гальченко В.Ф. Изучение нуклеотидных последовательностей nifH генов у представителей метанотрофных бактерий// Микробиология. 2002. Т. 71. № 4. С. 1-9.

2. Воюшин К.Е., Бавыкина Н.Б., Синеокий С.П. Принципы обеспечения биобезопасности при использовании генно-инженерно-модифицированных микроорганизмов в промышленности. Биотехнология. 2016;32(5):49-56.

3. Задорина Е.В., Слобода Н.В., Булыгина Е.С., Колганова Т.В., Кравченко И.К., Кузнецов Б.Б. Оценка разнообразия диазотрофов в торфяной почве методом клонирования гена nifH. //Микробиология. 2009. Том 78. №2. С. 252-260.

4. Запороженко Е.В., Слободова Н.В., Булыгина Е.С., Кравченко И.К., Кузнецов Б.Б. Экспресс-метод выделения ДНК из бактериальных сообществ различных почв // Микробиология. 2006. Т.75. С. 127-134.

5. Кравченко И.К., Дорошенко Е.В. Азотфиксирующая активность торфяной почвы верхового болота // Микробиология. 2003. Т. 72. № 1. С. 111- 116.

6. Нетрусов А.И., Бонч-Осмоловская Е.А., Горленко В.М., Иванов М.В., Каравайко Г.И., Кожевин П.А., Колотилова Н.Н., Котова И.Б., Максимов В.Н., Ножевникова А.Н., Семенов А.М., Турова Т.П., Юдина Т.Г. Экология микроорганизмов. Под ред. Нетрусова А.И. М.: Академия, 2004. 272 с.

7. Панкратов Т.А., Белова С.Э., Дедыш С.Н. Оценка филогенетического разнообразия прокариотных микроорганизмов в сфагновых болотах с использованием метода FISH.// Микробиология, 2005. Т. 74, №6, С. 831- 837.

8. Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю., Семенов П.А., Савилова А.М., Кофиади И.А., Абрамов Д.Д. «ПЦР «в реальном времени»». Под ред Д.В. Ребрикова. М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009. 223 с.

9. Турова Т.П. Применение методов геносистематики для решения вопросов таксономии и изучения биоразнообразия прокариот. Автореф. Дисс. 2009. 86 с.

Размещено на Allbest.ru