Виділення та аналіз структури мутантної форми N-кінцевого каталітичного модуля тирозил-тРНК синтетази BOS TAURUS з заміною Trp 40 та Trp 87 на аланін

Размещено на http://allbest.ru

Виділення та аналіз структури мутантної форми N-кінцевого каталітичного модуля тирозил-тРНК синтетази BOS TAURUS з заміною Trp 40 та Trp 87 на аланін

В.М. Заєць, Л.А. Коломієць, О.Ю. Цуварєв, О.І. Корнелюк

Інститут молекулярної біології і генетики НАН України

Мета. Виділення та аналіз структури мутантного однотриптофанового білка міні BtTyrRS для дослідження за допомогою методів флуоресцентної спектроскопії конформаційних змін фермента в процесі взаємодії з антикодоном тРНК та визначення впливу залишків триптофану в положенні 40 та 87 в його структурі на функціональні властивості ензиму. Методи. Електрофорез, метал-хелатувальна афінна хроматографія, флуоресцентна спектроскопія, моделювання просторової структури. Результати. Встановлено, що заміна двох кодонів амінокислоти триптофану на кодони амінокислоти аланіну в клонованій кДНК міні BtTyrRS не впливає на синтез мутантної форми фермента в штамі E. coli BL21(DE3)pLysE. Вихід афінно очищеного на Ni-NTA агарозі білка складає в середньому 3,5 мг з 100 мл культурального середовища. Комп'ютерне моделювання структури та флуоресцентна спектроскопія однотриптофанової форми міні BtTyrRS вказують на компактну структуру мутантного фермента, в якому Trp 283 знаходиться в іммобілізованому мікрооточенні. Висновки. Отримано афінно очищений на Ni-NTA агарозі мутантний однотриптофановий білок міні TyrRS, придатний для флуоресцентних досліджень структурно-динамічних та функціональних властивостей ензиму.

Ключові слова: тирозил-тРНК синтетаза, мутанта форма міні TyrRS, бактеріальна експресія

Аміноацил-тРНК синтетази (АРСази) [КФ 6.1.1] є ключовим ферментом першого етапу білкового синтезу. АРСази каталізують високоселективну АТФ-залежну активацію амінокислоти з утворенням аміноациладенілата та ковалентне приєднання її до ізоакцепторної тРНК, здійснюючи таким чином першу стадію реалізації закодованої в геномі організмів інформації про структуру білка [1].

Тирозил-тРНК синтетаза (TyrRS) є однією з найбільш вивчених АРСаз. В клітинах ссавців вона є гомодимером а2 типу, мономером якого є повнорозмірний фермент. Мономер TyrRS Bos taurus (59.2 кДа) складається з N-кінцевого каталітичного (міні 5zTyrRS, 39 кДа) та С-кінцевого EMAP II-подібного (20кДа) модулів [2]. В 5zTyrRS N-кінцевому модулю притаманна каталітична функція аміноацилювання тРНК, тоді як С-модуль відповідає за корегування та стабілізацію розміщення тРНК в активному центрі фермента [2,3]. Крім основної функції аміноацилювання тРНК тирозил-тРНК синтетаза виконує в клітині і важливі неканонічні функції. Після розщеплення синтетази еластазою на міні 5zTyrRS та С-модуль, останні проявляють цитокінові властивості: міні TyrRS є інтерлейкін-подібним цитокіном і стимулює ангіогенез, активує міграцію ендотеліальних клітин, а також є хемотаксичним фактором для нейтрофілів, тоді як С-модуль є ЕМАР II подібним цитокіном і стимулює хемотаксичну активність моноцитів та підсилює прокоагуляційну активність ендотеліальних клітин [3,4].

З огляду на те, що N-кінцевий каталітичний модуль синтетази є інтерлейкін-подібним цитокіном і проявляє проангіогенні властивості, він є перспективним об'єктом для досліджень з метою можливого використання в подальшому як лікарського препарату.

Амінокислотна послідовність N-кінцевого каталітичного модуля тирозилтРНК синтетази Bos taurus має три залишки триптофану, які в структурі білка розташовані в активному центрі ферменту (W40), в області димеризації мономерів міні BtTyrRS (W87) та в сайті зв'язування триплета антикодону тРНК TyrRS (W283). Розташування залишків триптофану в функціонально важливих областях ензиму робить перспективним дослідження його властивостей методами флуоресцентної спектроскопії, оскільки флуоресцентна спектроскопія є одним з найбільш інформативних методів вивчення конформаційних особливостей і внутрішньомолекулярних взаємодій в структурі білків [5]. Найбільш інформативними флуоресцентні дослідження властивостей білків стають при наявності лише одного залишка триптофану в їх структурі.

Раніше нами було клоновано кДНК каталітичного модуля тирозилтРНК синтетази в експресуючій плазміді рЕТ32а та досліджено його експресію [6]. В подальшому за допомогою сайт-спрямованого мутагенезу в клонованій кДНК міні 5zTyrRS було заміщено кодони Trp40 та Trp87 на кодони аланіну і залишено лише один кодон триптофану в області зв'язування ферментом антикодону [7].

Метою даної роботи було виділення та аналіз структури мутантного однотриптофанового білка міні 5zTyrRS для дослідження в подальшому за допомогою методів флуоресцентної спектроскопії конформаційних змін фермента в процесі взаємодії з антикодоном тРНК та визначення впливу залишків триптофану в положенні 40 та 87 в його структурі на функціональні властвості ензиму.

Матеріали і методи

В роботі була використана бактеріальна система E. coli, оскільки експресія білків в E. coli є недорогим, простим і швидким методом, який дозволяє отримати рекомбінантні білки у великих кількостях в нативному стані [8,9]. Для отримання мутантної форми міні TyrRS було взято штам-продуцент рекомбінантного білка E. coli BL21(DE3)pLysE (Stratagene, США), трансформований плазмідною конструкцією pET30а-39KYRSW283. Експресуюча конструкція pET30а-39KYRSW283 була створена на базі вектору pET-30a(+)

(“Novagen”, США) і містила клоновану мутантну по кодонам триптофанів в положенні 40 та 87 кДНК міні 5/TyrRS.

Для напрацювання рекомбінантної плазміди pET30а-39KYRSW283 використовували генноінженерний штам E. coli DH5a. Плазмідну ДНК виділяли за допомогою кіта Gene JET Plasmid Miniprep Kit фірми ''Thermo Scientific“. Концентрацію плазмідної ДНК визначали на спектрофотометрі NanoDrop 2000 ('Thermo Scientific“). Компетентні клітини E. coli отримували згідно методу Іное [10]. Всі процедури з трансформації плазмідної конструкції pET30а39KYRSW283 в компетентні клітини E. coli проводили стандартним методом згідно з лабораторним посібником [11].

Вирощування культури E. coli BL21(DE3)pZy5E та індукцію експресії рекомбінантної міні 5/TyrRS в бактеріальній культурі проводили в середовищі Луріа-Бертані (LB) (10 г бактотриптону, 5 г дріжджового екстракту, 10 г NaCl на 1 л) з 30 мкг/мл антибіотика канаміцину. Трансформовані рекомбінантною плазмідою pET30а-39KYRSW283 компетентні клітини E. coli вирощували на шейкері (Environmental Shaker Incubator ES-20) при 37 °С до оптичної густини А600 = 0,6-0,8 і індукували синтез цільового білка додаванням 1М ізопропіл-Р-О-тіогалактопіранозида (IPTG) до 1мМ концентрації з наступною інкубацією при 25 °С впродовж 12 годин згідно статті [12]. Зібрану біомасу зі 100 мл культури ресуспендували у 12 мл буферу для лізису клітин (50 мМ натрій-фоcфатний буфер, pH 8,0, 500 мМ NaCl, 10 мМ імідазол, 5 мМ Р-меркаптоетанол). Лізис проводили за допомогою ультразвукового дезінтегратора УЗ-озвучуванням (6 циклів по 20 с, інтервали 20 с). Лізат освітлювали центрифугуванням при 13000 об/хв протягом 30 хв при 4 °С. Супернатант наносили на врівноважену буфером для лізису клітин Ni-NTA агарозну колонку об'ємом 2 мл, яку промивали 10 мл буферу для промивки (50 мМ натрій-фощ фатний буфер, pH 8,0, 500 мМ NaCl, 20 мМ імідазол, 5 мМ Р-меркаптоетанол). Рекомбінантний білок елюювали 5 мл буферу для елюції (50 мМ натрій-фо^ фатного буфера, pH 8.0, 150 мМ NaCl, 200 мМ імідазол, 5 мМ Р-меркаптоетанол). Фракції з елюйованим білком об'єднували і діалізували проти 300 мл буферу для діалізу (500 мМ натрій-фоcфатний буфер рН 8,0, 150 мМ NaCl) впродовж 20 годин при + 4 °С.

Концентрацію очищеного рекомбінантного білка міні 5zTyrRS визначали спектрофотометрично на спектрофотометрі BioMate 5, використовуючи молярний коефіцієнт екстинкції 27850 M^-1 cm^-1 при довжині хвилі 280 нм. Коефіцієнт оптичного поглинання визначали за даними амінокислотного складу білка за допомогою програми ProtParam (http://expasy.ch/cgibin/protparam).

Електрофоретичний аналіз експресії рекомбінантного білка проводили за допомогою електрофорезу в 12% поліакриламідному гелі в денатурувальних умовах в буферній системі Леммлі [13]. Гелі забарвлювали барвником Cumassie R250.

Спектри флюоресценції реєстрували на спектрофлуориметрі з термостатованим кюветотримачем Hitachi M850 (Японія). Температуру у кюветі визначали з точністю до + 0,2 °С. Вимірювання проводили у кварцевій кюветі з довжиною оптичного шляху 0,5 см. Спектральна ширина щілини для монохроматора збуджувального світла та реєструючої системи становила 5-10 нм. Довжина хвилі збуджувального світла дорівнювала 280 нм та 295 нм, інтервал довжини хвиль для спектрів флюоресценції становив 300-400 нм, реєстрацію флуоресценції проводили під кутом 90° до напрямку пучка збуджувального світла при температурі 25 °С.

Амінокислотна послідовністьУугКЗ Bos taurus була взята з бази даних NCBI Gene data-base (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/) за ідентифікаційним номером DAA32266.1. Просторові структури димера подвійного мутанта 5zTyrRS були змодельовані з кристалічної структури ^sTyrRS (коди PDB 1N3L:A) як матриці за допомогою веб-сервера SWISS-MODEL [14].

Результати та їх обговорення

В попередніх роботах нами була отримана, клонована в низці плазмідних векторів та секвенована повна нуклеотидна послідовність кДНК гену тирозил-тРНК синтетази Bos taurus [15]. На її основі була створена експресуюча конструкція pET-30a(+)-39KYRS з клонованою послідовністю кДНК N-кінцевого каталітичного модуля синтетази. Експресований в штамі E. coli BL21 (DE3) рекомбінантний білок міні 5zTyrRS зберігав аміноацилювальну здатність, притаманну аміноацил-тРНК синтетазі.

Базуючись на рентгенструктурних даних кристалів N-кінцевого каталітичного модуля тирозил-тРНК синтетази людини [16], яка на 95% схожа з міні TyrRS Bos taurus, і комп'ютерній моделі просторової структури повнорозмірної тирозил-тРНК-синтетазы Bos taurus [17], нами була побудована комп'ютерна модель структурної організації гомодимера N-кінцевого каталітичного модуля TyrRS Bos taurus [12]. Згідно з даними рентгенструктурного аналізу та створеної нами тривимірної моделі каталітичного модуля синтетази триптофанові залишки в положенні 283 в димері функціональної міні 5zTyrRS знаходяться в області, доступній для взаємодії з тРНК.

З метою отримання білка міні 5zTyrRS з одним залишком триптофану в положенні 283 для дослідження властивостей фермента методами флуоресцентної спектроскопії в плазмідній конструкції pET-30a(+)-39KYRS була проведена заміна триплетів триптофану в кДНК каталітичного модуля синтетази в положенні 40 та 87 на триплети аланіну методом сайт-спрямованого QuikChange мутагенезу [7]. В результаті була отримана плазмідна конструкція pET-30a(+)-39KYRS283W, що має лише один кодон триптофану в положенні 283 в клонованій послідовності кДНК N-кінцевого модуля синтетази. Амінокислота аланін була вибрана для заміщення залишків триптофану в амінокислотній послідовності міні 5zTyrRS за її невеликим гідрофобним радикалом, який не впливає на формування суміжними амінокислотними залишками в поліпептидному ланцюзі вторинної структури білка.

Для визначення впливу замін двох триптофанових залишків на аланін на структуру міні BtTyrRS була побудована модель просторової структури мутантної форми гомодимера N-кінцевого каталітичного модуля TyrRS Bos taurus з одним триптофановим залишком в послідовності білка в положенні 283. Розроблена модель мутантної форми міні 5zTyrRS приведена на рис. 1. Порівняння моделей просторових структур отриманої раніше нативної [12] та мутантної форм міні 5zTyrRS не виявило явних відмінностей в їх структурі. Це свідчить про те, що заміна Trp40 та Trp87 на Ala в амінокислотній послідовності білка не привела до порушення просторової структури ензиму.

Рис. 1. Модель просторової структури гомодимера мутантної форми міні BtTyrRS з залишком триптофану в положенні 283. Різні мономери позначені синім та зеленим кольором

Fig.1. Model of spatial structure of the homodimer of mutant form mini BtTyrRS with tryptophan residues at position 283. Different monomers are highlighted in blue and green

Дослідження властивостей ферментів експериментальними методами потребує значної кількості білків. Для їх отримання в основному застосовуються генно-інженерні підходи. Бактеріальна система експресії на основі РНК-полімерази фага Т7 є однією з найбільш ефективних прокаріотичних систем, що використовується для отримання рекомбінантних білків як про-, так і еукаріотичного походження. Продуцентом рекомбінантних білків в цій системі є штами на основі E. coli BL21(DE3), в яких ген РНК-полімерази фага Т7 під контролем промотора lacUV5 інтегрований в бактеріальну хромосому. Штами на основі BL21(DE3) використовуються як реципієнти різних експресувальних плазмідних векторів, в яких цільові гени вбудовуються під контроль промоторів, що впізнаються РНК-полімеразою фага Т7. До таких плазмідних векторів відноситься вектор pET-30a(+). Транскрипція клонованих генів в цих векторах індукується додаванням в культуральне середовіще індуктора синтезу IPTG.

Синтез рекомбінантних білків в бактеріальних системах значною мірою залежить від умов культивування. В попередніх роботах нами були визначені оптимальні параметри експресії в бактеріальних клітинах E. coli штаму BL21(DE3)pLyyE нативної повнорозмірної тирозил-тРНК синтетази, нативної та мутантної міні 5zTyrRS, в амінокислотній послідовності якої залишки Trp40 та Trp283 були замінені на залишки Ala [6, 12, 18]. В роботах досліджувався вплив на експресію міні 5zTyrRS в експресувальному векторі pET30a(+) таких чинників, як склад культурального середовища, кількість індуктора синтезу білка, що вноситься в культуральне середовище, температурні параметри та час культивування культури до та після додавання індуктора. Було показано, що найбільш високий рівень синтезу рекомбінантної міні 5/TyrRS в культурі E. coli досягався при додаванні в культуральне середовище індуктора синтезу білка IPTG в концентрації 1мМ при досяганні оптичної густини OD₆₀₀= 0,7-0,9, що відповідає логарифмічній фазі росту бактеріальної культури, та інкубації культури впродовж 8 годин при 25 ^оС. При цій температурі інкубації бактеріальних культур відзначався найбільш високий вміст синтезованої рекомбінантної міні 5zTyrRS в розчинній фракції клітин E. coli, який досягав 47% від загальної кількості синтезованого рекомбінантного білка. Було встановлено також, що склад культурального середовища не має значного впливу на експресію ферменту.

Експериментально встановлені оптимальні умови експресії каталітичного модуля тирозил-тРНК синтетази Bos taurus в E. coli в середовищі LB були враховані нами в роботі при отриманні препаративної кількості рекомбінантної мутантної міні 5zTyrRS в культурі клітин E. coli штаму BL21(DE3) pLysE після трансформації штаму плазмідною конструкцією pET-30a(+)39KYRS283W.

Після лізису бактеріальних клітин та хроматографічної очистки лізату за допомогою металхелатувальної хроматографії на Ni-NTA агарозі (рис. 2) з 100 мл бактеріальної культури, інкубованої при температурі 25 ^оС впродовж 8 годин, було отримано з використанням при оцінці виходу білку коефіцієнта екстинції 27850 M^-1cm^-1 до 3,5 мг гомогенного рекомбінантного білка мутантної міні 5zTyrRS, чистота якого згідно гель-електрофорезу досягає 95% (рис. 3).

Кількість отриманого білка мутантної форми міні 5zTyrRS співвідноситься з кількістю отриманого раніше у культуральному середовищі в одних і тих же умовах білка нативної форми ферменту [12]. Це свідчить, що заміна двох триптофанових залишків на аланін в положенні 40 та 87 в структурі каталітичного модуля 5zTyrRS не впливає на синтез рекомбінантного білка в трансформованому плазмідною конструкцією pET-30a(+)-39KYRS283W штамі E. coli BL21(DE3)pLysE. Відповідно, з одного літра бактеріальної культури у використаних нами умовах експресії можна отримати до 35 мг очищеного рекомбінантного ензиму.

Рис 2. Електрофоретичний аналіз експресії та очистки мутантної форми mini-TyrRS на Ni-NTA агарозі

Fig. 2. Electrophoretic analysis of expression and purification of the mutant form of mini-TyrRS on Ni-NTA agarose

Рис. 3. Електрофоретичний аналіз експресії мутантної форми каталітичного модуля тирозинової аміноацил-тРНК синтетази Bos taurus в штамі E. coli BL21(DE3)pLysE та електрофоретичний контроль чистоти мутантного білка після хрматографічної очистки на Ni-NTA агарозі (12%-ий поліакриламідний гель)

М Маркерна суміш білків (``Invitrogen'', Mark 12 Unstained Standart)

1 Клітинний лізат трансформованої плазмідою pET30a-39KYRSW283 бактеріальної культури штаму BL21(DE3)pLysE до індукції IPTG синтезу мутантної форми міні BtTyrRS

2 Клітинний лізат трансформованої плазмідою pET30a-39KYRSW283 бактеріальної культури штаму BL21(DE3)pLysE після індукції IPTG синтезу мутантної форми міні BtTyrRS

3 Мутантна міні BtTyrRS після хрматографічної очистки на Ni-NTA агарозі

Fig. 3. Electrophoretic analysis of the expression of the mutant form of Bos taurus tyrosyl-tRNA synthetase catalytical module in E. coli BL21(DE3) pLysE strain and electrophoretic control of the purity of the mutant protein after chromatographic purification on Ni-NTA agarose (12% polyacrylamide gel).

M Mixture of marker protein ('' Invitrogen '', Mark 12 Unstained Standart).

1 Cell lysate of bacterial culture of E. coli strain BL21(DE3)/V.y.s7i' transformed with plasmid pET30a-39KYRSW87 before IPTG induction of mutant mini BtTyrRS synthesis.

2 Cell lysate of bacterial culture of E. coli strain BL21(DE3) pLysE transformed with plasmid pET30a-39KYRSW40 after IPTG induction of mutant form mini BtTyrRS synthesis.

3 Mutant mini BtTyrRS after chromatographic purification on Ni-NTA agarose.

Для оцінки стану отриманої за допомогою металхелатувальної хроматографії мутантної форми каталітичного модуля тирозил-тРНК синтетази була застосована флуоресцентна спектроскопія. Спектри флуоресценції мутантної форми каталітичного модуля тирозил-тРНК синтетази B. taurus за довжини хвилі збудження 280 нм (спектр флуоресценції білка зумовлений сумарним випромінюванням тирозинових та триптофанового залишків) та 295 нм (спектр флуоресценції зумовлений випромінюванням лише триптофанового залишку) приведені на рис.4. Флуоресцентні характеристики емісії триптофанового залишку отриманого рекомбінантного білка, ширина спектра флуоресценції ДХ та положення максимуму флуоресценції, становлять, відповідно, близько 57 нм та 345 нм (рис. 4). Параметри спектрів флуоресценції триптофанових залишків залежать від полярності мікрооточення, а також їх здатності релаксувати за час життя флуоресценції. Полярність мікрооточення триптофанового залишку визначається як його доступністю для молекул розчинника, так і власними полярними групами білка, які входять до складу мікрооточення. Згідно моделі трьох спектральних класів залишків триптофану в структурі білків [19] триптофановий залишок в положенні 283 відноситься більшою мірою до спектрального класу II, що характеризується емісією іммобілізованого на поверхні білка індольного флуорофора, який в основному контактує зі зв'язаною водою та іншими полярними групами в структурі протеїну.

Рис. 4. Спектри флуоресценції мутантної форми міні TyrRS при довжині збудження 280 нм (1) та 296 нм (2)

Fig. 4. Fluorescence spectra of the mutant form of mini TyrRS at excitation wavelengths of 280 nm (1) and 296 nm (2)

Раніше нами була вивчена власна триптофанова флуоресценція нативної міні TyrRS і проаналізована її внутрішньомолекулярна динаміка методами флуоресцентної спектроскопії [20]. Проведений аналіз локалізації та властивостей мікрооточення 3-х триптофанових залишків, відповідальних за власну флуоресценцію міні TyrRS, дозволив охарактеризувати їх доступність в структурі димера фермента та конформаційну рухливість їх мікрооточення. Характеристики триптофанової флуоресценції мутантної форми міні TyrRS з залишками триптофанів у положенні 283 свідчать про іммобілізацію і компактний стан оточення триптофанових залишків в гомодимері ензиму та збереження нативної конформації синтетази.

Дані підтверджуються подібністю просторових структур нативної та мутантної форм міні 5zTyrRS та аналізом їх властивостей за допомогою програми ProtParam, згідно якої індекси нестабільності останніх майже однакові і дорівнюють відповідно 36,2 та 37,15, що свідчить про стабільність рекомбінантного білка.

В результаті проведеної роботи встановлено, що заміна кодонів триптофану в положеннях 40 та 87 на кодони аланіну в кДНК каталітичного модуля тирозил-тРНК синтетази Bos taurus не впливає на синтез мутантної форми ферменту в клітинах E. coli та її структуру. Вихід очищеного гомогенного білка мутантної міні 5zTyrRS при інкубації культури трансформованого плазмідою pET30а-39KYRSW283 штаму E. coli BL21(DE3)pLys^,E при 25 °С складає в середньому 35 мг з 1 л культурального середовища LB, що є достатнім для проведення подальших структурно-функціональних досліджень мутантної форми 5zTyrRS. Згідно оцінки просторової структури та флуоресцентних даних структура мутантної форми синтетази перебуває в компактному стані.

мутантний однотриптофановий білок флуоресцентна спектроскопія триптофан ензим

V.N. Zayets, L.A. Kolomiiets, O.Yu. Tsuvarev, A.I. Kornelyuk

ISOLATION AND STRUCTURE ANALYSIS OF THE MUTANT FORM OF N-TERMINAL CATALYTIC MODULE OF BOS TAURUS TYROSYL-tRNA SYNTHETASE WITH REPLACEMENT OF Trp 40 AND Trp 87 BY ALANINE

Summary

Aim. Isolation and analysis of the structure of the mutant monotryptophan protein mini BtTyrRS for study of conformational changes of the enzyme at the stage of interaction with tRNA using fluorescence spectroscopy and determination of the effect of tryptophan residues in position 40 and 87 in its structure on the functional properties of the enzyme. Methods. Electrophoresis, metal-chelating affinity chromatography, fluorescence spectroscopy, spatial structure modeling. Results. It was found that the replacement of two codons of Trp by codons of Ala in the cloned cDNA mini BtTyrRS does not affect the synthesis of the mutant form of the enzyme in E. coli strain BL21 (DE3) pLysE. The yield of affinity purified protein on Ni-NTA agarose is on average 3.5 mg per 100 ml of culture medium. Computer modeling of the structure and fluorescence spectroscopy of the monotryptophan form ofmini BtTyrRS indicates a compact structure of the mutant enzyme, in which Trp 283 is in an immobilized microenvironment. Conclusions. Affinity purified on Ni-NTA agarose mutant monotryptophan protein mini TyrRS have been obtained which is suitable for fluorescent studies of structural-dynamic and functional properties of the enzyme.

Key words: tyrosyl-tRNA synthetase, mutant form of mini TyrRS, bacterial expression

В.Н. Заец, Л.А. Коломиец, А.Ю. Цуварев, А.И. Корнелюк

Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины

ВЫДЕЛЕНИЕ И АНАЛИЗ СТРУКТУРЫ МУТАНТНОЙ ФОРМЫ N-КОНЦЕВОГО КАТАЛИТИЧЕСКОГО МОДУЛЯ ТИРОЗИЛ-тРНК СИНТЕТАЗЫ BOS TAURUS С ЗАМЕНОЙ Trp 40 И Trp 87 НА АЛАНИН