Вплив пропаргілгліцину на ендотелійзалежне розслаблення судин і утворення супероксидного аніона при старінні

Размещено на http://www.allbest.ru/

Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Вплив пропаргілгліцину на ендотелійзалежне розслаблення судин і утворення супероксидного аніона при старінні

К.О. Драчук, Н.О. Дорофеєва, В.Ф. Сагач

Київ

Анотація

інгібітор аніон ендотелійзалежний судина

Вивчали вплив інгібітора цистатіонін-у-ліазазалежного шляху синтезу сірководню (H2S), пропаргілгліцину на ендотелійзалежне розслаблення судин та активність основних шляхів утворення супероксидного аніона, індуктора оксидативного стресу у старих тварин. У дослідах показано, що у старих тварин ацетилхолініндуковане ендотелійзалежне розслаблення ГМ аорти пригнічене (7,5 ± 1,4%)порівняно з дорослими (64,9 ± 3,5%). Додавання до перфузату пропаргілгліцину призводило до покращення, середнє значення амплітуди збільшувалось з 7,5± 1,4до 44,5±3,2%. Ці ефекти супроводжувалися зниженням в тканинах аорти вмісту супероксидного аніона через пригнічення активності ксантиноксидазного шляху його утворення.

Ключові слова: старіння; ендотелійзалежне розслаблення; оксидативний стрес; супероксидний аніон; пропаргілгліцин.

Annotation

K.O. Drachuk, N.A. Dorofeyeva, V.F. Sagach

THE EFFECT OF PROPARGYLGLYCINE ON THE ENDOTHELIUM-DEPENDENT RELAXATION AND ACTIVITY OF MAIN SOURCES OF SUPEROXIDE ANION GENERATION DURING AGING

Bogomolets Institute of Physiology, NAS of Ukraine, Kyiv;

The objective of the present study was to investigate the effect of propargylglycine (PAG), an inhibitor of the CSE-dependent pathway of hydrogensulfide synthesis, on the endotheliumdependent relaxation of aortic smooth muscle (SM) in old rats. It was found a violation of SM relaxation in this group of animals. The average value of its amplitude was 7.5 ± 1.4% compared with 64.9 ± 3.5% in healthy adult rats. PAG significantly improved endothelium-dependent relaxation in old rats, the average value of its amplitude increased from 7.5 ± 1.4% to 44,5 ± 3,2%. This effect was due to suppression of superoxide anion generation by inhibition of xanthineoxidase activity. Key words: aging; endothelium-dependent relaxation; oxidative stress; superoxide anion; propargylglycine.

АННОТАЦИЯ

К.О. Драчук, Н.А. Дорофеева, В.Ф. Сагач

ВЛИЯНИЕ ПРОПАРГИЛГЛИЦИНА НА ЭНДОТЕЛИЙЗАВИСИМОЕ РАССЛАБЛЕНИЕ СОСУДОВ И АКТИВНОСТЬ ОСНОВНЫХ ПУТЕЙ ОБРАЗОВАНИЯ СУПЕРОКСИДНОГО АНИОНА ПРИ СТАРЕНИИ

Снижение биодоступности NO в сосудах при старении приводит к нарушению эндотелийзависимого расслабления и повышению риска таких заболеваний, как атеросклероз, артериальная гипертензия, диабетическая ангиопатия и др. Изучали влияние ингибитора цистатионин-у-лиазазависимого пути синтеза сероводорода (H₂S), пропаргилглицина на эндотелийзависимое расслабление сосудов и активность основных путей образования супероксидного аниона, индуктора оксидативного стресса, у старых животных. Опыты показали, что у старых животных ацетилхолининдуцированное эндотелийзависимое расслабление гладких мышц аорты снижено (7,5 ± 1,4%) по сравнению со взрослыми (64,9 ± 3,5%). Добавление к перфузату пропаргилглицина приводило к его улучшению, среднее значение амплитуды увеличивалось с 7,5 ± 1,4 до 44,5 ± 3,2%. Данны еэффекты сопровождались снижением в тканях аорты содержания супероксидного аниона через подавление активности ксантиноксидазного пути его образования. Ключевые слова: старение; эндотелийзависимое расслабление; оксидативный стресс; супероксидный анион; пропаргилглицин.

ВСТУП

Оксид азоту (NO) - ключовий фактор, що забезпечує нормальну реалізацію ендотелійзалежного розслаблення. Основним шляхом синтезу NO в судинах є окисний метаболізм L-аргініну під дією кальційзалежної конститутивної NO-синтази. Цей фермент активується при дії хімічних факторів (ацетилхолін, брадикінін, естрогени, інсулін тощо) або при збільшенні “напруження зсуву”. Синтезований в ендотелії NO дифундує в гладенькі м'язи (ГМ), активує гуанілатциклазу і збільшує утворення циклічного гуанозинмонофосфату(цГМФ). У результаті активується цГМФ-залежна протеїнкіназа, яка стимулює відтік внутрішньоклітинного Ca² - і розслаблення ГМ [1]. Існують докази і про прямий релаксуючий вплив NO на ГМ, при якому відбувається цГМФ-незалежна активація Са² - -АТФ-ази саркоплазматичного ретикулума і зменшення вмісту цитозольного Ca² - [2]. Головною причиною порушення ендотелійзалежного розслаблення є змен шення біодоступності NO. Останнє виникає, зокрема,через оксидативний стрес [3].

Однією із речовин, яка пригнічує оксидативний стрес і потенційно може відновлювати біодоступність NO та ендотелійзалежне розслаблення є пропаргілгліцин. Він є інгібітором цистатіонін-у-ліази, одного із трьох ферментів синтезу сірководню[4]. Показано здатність пропаргілгліцину зменшувати вміст супероксидного аніона 0О₂^-) в тканинах серця старих тварин та покращувати діастолічну функцію [5].

Метою нашої роботи було дослідити вплив пропаргілгліцину на ендотелійзалежне розслаблення судин, вміст -О₂^-та активність основних шляхів його утворення у старих щурів.

МЕТОДИКА

Фізіологічні дослідження. Досліди проводили на ізольованих препаратах грудної аорти щурів-самців лінії Вістар віком 8 міс (дорослі, n = 10) та 22-24 міс (старі, n = 20), масою 300370 г з дотриманням усіх вимог щодо роботи з лабораторними тваринами (міжнародна конвенція, Страсбург, 1986).

Для цих досліджень у щурів виділяли грудну аорту, нарізали на кільцеві препарати і за загальноприйнятою методикою в режимі, наближеному до ізотонічного, реєстрували скорочувальну активність ГМ[6]. Для активації ГМ аорти до перфузуючого розчину додавали норадреналін (10^-5 моль/л, “Sigma”, США). Стійкий рівень норадреналінзалежного скорочення («плато») приймали за 100%. Від нього проводили розрахунки зміни амплітуди ендотелійзалежних скоротливих реакцій ГМ аорти на ацетилхолін (10^-5 моль/л, “Sigma”, США). Пропаргілгліцин (10^-3 моль/л, “Sigma”, США) використовували для інкубації кільцевих препаратів аорти (30 хв), а також додавали в перфузійні розчини на час експерименту.

Біохімічні дослідження. Дослідження проведено за допомогою спектрофотометричного методу. В тканинах аорти дорослих і старих щурів визначали пули ^2та активність основних шляхів його утворення: циклооксигеназного (маркер тромбоксан B2TXB2), ліпооксигеназного (маркер лейкотрієн C₄ (LTC₄)) та ксантиноксидазного (маркер сечова кислота) [7, 8].Також вивчали зміни цих показників у групі старих тварин, яким за 30 хв до початку експерименту вводили пропаргілгліцин (внутрішньоочеревинно, 11,3 мг/кг). Така доза за нашими підрахунками давала змогу досягти концентрації його в крові 10"³ моль/л, що використовувалася у фізіологічних дослідженнях.

Отримані результати обробляли методами варіаційної статистики з використанням програм Excell (MS Office XP) та Origin 6.0 (Microcall Inc., США). Значення Р < 0,05 вважали статистично достовірними.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Фізіологічні дослідження. Показано, що додавання ацетилхоліну(10^-5 моль/л) до буферного розчин завжди викликало типове розслаблення преактивованих норадреналіном ГМ грудної аорти дорослих щурів. Середнє значення амплітуди становило 64,9 ± 3,5% (рисунок).У старих щурів дія ацетилхоліну викликала розслаблення ГМ грудної аорти, амплітуда якого була майже в 9 разів меншою за контроль. Середнє її значення становило 7,5 ± 1,4% (n = 10). Додавання до перфузату пропаргілгліцину призвело до суттєвого покращення (44,5 ± 3,2%; n = 10; див. рисунок) ацетилхолініндукованого розслаблення ГМ аорти старих щурів. Раніше проведені експерименти показали відсутність впливу пропаргілгліцину на розслаблення судин у дорослих тварин.

Нативні криві впливу пропаргілгліцину на ацетилхолініндуковане розслаблення гладеньких м'язів (ГМ) аорти старих щурів: 1 - дорослі щури; 2 - старі; 3 - старі після дії пропаргілгліцину. За віссю абсцис - час; за віссю ординат - напруження, розвинуте препаратом. Темна лінія під кривими - тривалість дії ацетилхоліну (10^-5 моль/л), переривчаста - вихідний рівень (внизу) тонічного напруження ГМ і заданий рівень (зверху) їх активації після введення норадреналіну, що приймається за 100%

Основною причиною порушення ендотелійзалежного розслаблення при старінні є оксидативний стрес. Посилене утворення *Оу призводить до окиснення 1) тетрагідробіоптерину - кофактора cNOS [9] і 2) глутатіону із наступним глутатіонуванням молекули cNOS [10, 11]. Наслідком цих двох процесів є неспряження (uncoupling) стану cNOS. Останній при цьому утворює -О₂замість NO [12], що, з одного боку, призводить до зниження конститутивного синтезу NO і порушення ендотелійзалежного розслаблення, а з іншого - до появи хибного (самопідсилюючого) кола утворення *О₂і прогресування оксидативного стресу. Таким чином,засоби, що пригнічують продукування-О₂^-, мають зменшувати розвиток оксидативного стресу, відновлювати спряжений стан cNOS та покращувати ендотелійзалежне розслаблення судин. Біохімічні дослідження. Як видно з таблиці, в тканинах аорти старих щурів дійсно розвивався оксидативний стрес. Так, сумарна швидкість генерації -О₂ - перевищувала значення у дорослих в 5,8 раза. Ми визначили інтенсивність декількох основних шляхів утворення радикала. Відомо, що важливими джерелами генерації *О₂в клітині є дихальний ланцюг мітохондрій, діяльність ксантиноксидази, циклооксигенази, ліпооксигенази, неспряженої сNOS[3, 13]. У процесі деградації пуринових нуклеотидів за участю ксантиноксидази одночасно утворюються *О₂^-і сечова кислота [14]. При цьому остання реакція активується в умовах гіпоксії [15]. Таким чином, сечова кислота є одночасно маркером активності ксантиноксидазного шляху продукції *О₂^-, інтенсивності розпаду пуринових нуклеотидів, зокрема, АТФ і гіпоксії. У тканинах аорти старих щурів пули сечової кислоти перевищували значення дорослих тварин у 8,3 раза (таблиця). Пули LTC4 маркера ліпоксигеназного генератора *О₂^-, були більшими за контрольні значення у 2,7 раза, а пули TxB2, маркера циклооксигеназного шляху генерації супероксиду, не відрізнялися від значення у дорослих тварин (див. таблицю).

Зміни пулів маркерів ферментативного утворення -О2в тканинах аорти старих щурів за дії пропаргілгліцину^ ± m, n = 5)