Связь интегрального биохимического индекса и содержания хлорорганических ксенобиотиков в печени морского ерша Scorpaena porcus Linnaeus, 1758 в севастопольской морской акватории

Размещено на http://www.allbest.ru/

Связь интегрального биохимического индекса и содержания хлорорганических ксенобиотиков в печени морского ерша Scorpaena porcus Linnaeus, 1758 в севастопольской морской акватории

Л.В. Малахова, Е.Н. Скуратовская, Т.В. Малахова, В.В. Лобко Институт биологии южных морей им. А.О. Ковалевского РАН Российская Федерация

Аннотация

Несмотря на запрет применения хлорорганических соединений (ХОС), они до настоящего времени аккумулируются в различных абиотических и биотических компонентах экосистемы Черного моря, в том числе и в рыбах, вызывая негативные изменения в их метаболизме. Для оценки состояния морского ерша (скорпены) Scorpaena porcus Linnaeus, 1758 сопоставлены значения интегрального биохимического индекса (ИБХИ), рассчитанного по биохимическим показателям, и концентрации шести индикаторных конгенеров полихлорбифенилов (УПХБ6) и хлорорганических пестицидов группы п,п'-ДДТ, п,п'-ДДЭ и п,п'-ДДД (УДДТ) в печени рыб из бухт (Александровская, Стрелецкая, Балаклавская и Казачья) и открытых районов севастопольской морской акватории (бухта Ласпи и прибрежье микрорайона Любимовка). В бухтах Александровская и Стрелецкая, подверженных значительному антропогенному влиянию, обнаружены высокие концентрации ХОС в печени, составляющие для УПХБ6 2044 и 2019 и для УДДТ 162 и 319 нг/г сырой массы соответственно. Для определения отклика организма на уровень загрязнения в печени ерша исследовали комплекс таких биохимических маркеров, как активность холинэстеразы, каталазы, содержание альбумина, уровень окислительной модификации белков и продуктов перекисного окисления липидов. Выявлены статистически достоверные корреляционные связи между значениями ИБХИ, рассчитанного по комплексу этих биохимических показателей, и концентрацией УПХБ6 в печени ерша и в донных отложениях (r=0,95, p<0,05). Максимальные значения ИБХИ соответствовали наиболее загрязненным бухтам Александровская и Стрелецкая, в которых

они на два порядка превышали величины ИБХИ в бухте Ласпи. По показателям ИБХИ рыбы в районах бухт Ласпи, Казачья и в открытой акватории Любимовки в летние сезоны 2016-2018 гг. находились в более благоприятном состоянии, чем в полузакрытых бухтах Александровская, Стрелецкая и Балаклавская.

Ключевые слова: Scorpaena porcus, полихлорированные бифенилы, ДДТ, биомаркеры, интегральный биохимический индекс, севастопольская морская акватория, Черное море.

Abstract

The Relationship between Integrated Biochemical Index and Content of Organochlorine Xenobiotics in the Liver of the Black Scorpion Fish

Scorpaena porcus Linnaeus, 1758,

from Sevastopol Bays and Coastal Areas

Ludmila V. Malakhova, Ekaterina N. Skuratovskaya, Tatiana V. Malakhova and Veronika V. Lobko

A.O. Kovalevsky Institute of Biology of the Southern Seas of RAS

Despite the ban on the use of organochlorine compounds (OCs), they are still widely distributed in various components of the Black Sea ecosystem, including fish. Sevastopol marine area, as a region of active economic use, is subject to significant anthropogenic impact. To assess the condition of the Black Sea scorpion fish Scorpaena porcus Linnaeus, 1758, from Sevastopol bays (Aleksandrovskaya, Streletskaya, Balaklavskaya, and Kazach'ia) and coastal areas (Laspi bay and Lyubimovka region), the liver of fish was analyzed to compare integrated biomarker response (IBR) and the concentrations of OCs: six indicator congeners of polychlorinated biphenyls (ЈPCB6) and organochlorine pesticides - p,p'-DDT and its metabolites p,p'-DDE and p,p'-DDD (ЈDDT). High concentrations of PCBs and DDTs were found in fish liver from Alexandrovskaya and Streletskaya bays, which are subject to significant anthropogenic impact: 2044 and 2019 ng/g wet weight for ЈPCB6 and 162 and 319 ng/g wet weight for ЈDDT, respectively. To determine the response of scorpion fish to the level of pollution, the liver of fish was analyzed to measure such biochemical markers as cholinesterase and catalase activities, albumin content, and the levels of oxidized proteins and lipid peroxidation. The set of these biochemical markers was used to calculate IBR. IBR correlated well with the ЈPCB6 concentration in sediments and liver of scorpion fish (r=0.95, p<0.05). The maximum IBR was determined in the most polluted Alexandrovskaya and Streletskaya bays, where it was two orders of magnitude higher than the IBR in Laspi bay. Based on IBR values, the fish from Laspi and Kazach'ia bays and from the coastal area of Lyubimovka were in better condition than the fish from Alexandrovskaya, Streletskaya, and Balaklavskaya bays in summer seasons of 2016-2018.

Keywords: Scorpaena porcus, polychlorinated biphenyls, DDTs, biomarkers, integrated biochemical response, Sevastopol marine area, the Black Sea.

Введение

Севастопольская морская акватория на протяжении многих десятилетий является районом активного хозяйственного использования, подвергающимся значительному техногенному воздействию. К наиболее опасным загрязняющим веществам антропогенного происхождения, поступающим из различных источников в прибрежные морские районы Севастополя, относятся такие хлорорганические соединения (ХОС), как полихлорированные бифенилы (ПХБ) и хлорорганический пестицид 1,1,1-трихлор-2,2-бис(4 -хлорфенил)этан (далее - ДДТ) (Малахова, 2005; Малахова и др., 2019). В течение нескольких десятилетий во всем мире, в том числе в странах причерноморского региона, ПХБ экстенсивно использовались как диэлектрики, теплоносители, добавки к клеям, маслам, лакам и др., а ДДТ - для борьбы с возбудителями малярии и энцефалита и как инсектицид на сельскохозяйственных угодьях (Трегер, Розанов, 2000; Li et al., 2006; Reddy et al., 2019). В 1980-1990-х гг. загрязненность черноморской акватории Крыма была настолько высока, что ХОС обнаруживали во всех без исключения ее компонентах: планктоне, водорослях-макрофитах, моллюсках, рыбе и донных осадках. Высокая концентрация ПХБ (в эквиваленте Ароклор 1254) была выявлена в пелагических видах рыб Trachurus mediterraneus, Lisa aurata, Odontogadus merlangus luxinus, составляла 454, 240 и 560, а также в донных видах Psetta maxima maeotica и Neogobius kessleri kessleri - 105 и 232 нг/г сырой массы соответственно (Поликарпов, Жер- ко, 1996). В последние годы содержание ХОС в гидробионтах в этих районах изменялось от n-10-2 до n-102 нг/г сырой массы (Малахова и др., 2019). А в так называемых критических органах гидробионтов, функции которых среди прочих заключаются в выведении токсикантов из организмов (гепатопанкреас у моллюсков, печень у рыб и млекопитающих), концентрация ХОС достигала n-103 - 105 нг/г сырой массы (Логоминова и др., 2018; Malakhova et al., 2014). В последние годы нами была выявлена положительная корреляционная связь содержания ХОС в воде и смертности пелагической икры и отрицательная - с численностью личинок рыб на ранних этапах постэмбрионального развития (Klimova et al., 2014). биохимический ксенобиотик морской ерш

В настоящее время большое внимание уделяется поиску видов-индикаторов загрязнения морской среды различными токсикантами. Одним их таких гидробионтов является морской ерш (скорпена) Scorpaena porcus (L.), широко распространенный вид для донной прибрежной ихтиофауны Черного моря, ведущий малоподвижный оседлый образ жизни в конкретных участках моря. Биохимические показатели морского ерша нашли широкое применение в биоиндикации состояния севастопольских бухт (Rudneva et al., 2016).

Для оценки воздействия токсикантов и ответных реакций морских животных на загрязненность среды обитания часто используют биохимические показатели, позволяющие выявить механизмы воздействия комплекса негативных факторов среды на конкретные звенья метаболизма, определить основную стратегию и особенности структурно-функциональных изменений в организме при адаптации к неблагоприятным условиям обитания. В качестве таких биомаркеров широко используют параметры прооксидантно- антиоксидантной системы, активность холинэстеразы, концентрацию белков, включая альбумин (Пашина, Золотавина, 2014; Van der Oos et al., 2003; Tierney et al., 2003; Michelis et al., 2010; Rudneva et al., 2016; Luk'yanova, Korchagin, 2017). В современных программах мониторинга для интерпретации суммарного отклика нескольких молекулярных биомаркеров применяют интегральные биохимические индексы состояния организмов. Такие индексы позволяют снизить сложность и неопределенность многомерных данных путем вычисления универсального обобщающего показателя и сравнить состояние организмов из акваторий с различным уровнем загрязнения (Beliaeff, Burgeot, 2002; Leinio, Lehtonen, 2005; Vieira et al., 2016; Giltrap et al., 2017; Luk'yanova, Korchagin, 2017).

Целью работы стало выявление связи содержания ХОС и интегрального индекса биохимических показателей в печени скорпены в бухтах и открытой морской акватории Севастополя.

Материалы и методы

Рыб отлавливали в летние периоды с 2016 по 2018 г. в различных по размерам, степени изолированности от моря и уровню загрязненности четырех севастопольских бухтах, имеющих ограниченный водообмен с открытым морем: Александровской, Стрелецкой, Балаклавской и Казачьей, а также в открытых районах моря - бухте Ласпи и прибрежной зоне микрорайона Любимовка. Бухты пере-числены в порядке уменьшения антропогенной нагрузки на их акватории: по объемам сбросов промышленно-бытовых и ливневых стоков, урбанизации их берегов, базированию флота, судоходству, препятствующим водообмену гидротехническим сооружениям (Овсяный и др., 2001). Бухта Ласпи по мор-фологии относится к морскому заливу и, как открытая прибрежная зона микрорайона Любимовка, имеет свободный водообмен с шельфовой зоной Крыма.

Даты отлова рыбы и отбора проб донных отложений, координаты и описание районов и вероятных источников загрязнения указаны в табл. 1.

Для определения индивидуальных особенностей в накоплении ХОС и биологических откликов на уровень загрязненности в каждом районе были отобраны пробы печени от 7 до 9 самцов и самок ерша, имевших стандартную длину в пределах 16-17 см. После полного биологического анализа особей и отбора проб для биохимических исследований печень рыб упаковывали в фольгу и до анализа на ХОС хранили в морозильной камере при минус 20 °С. Пробоподготовку и определение ХОС в печени проводили в соответ-ствии с руководством (МВИ МН 2352-2005). Для анализа брали размороженные образцы печени от индивидуальных особей. Печень у ерша длиной 16-17 см является крупным органом. Аликвоты гомогенизированной печени (по 0,5 г сырой массы) в двух повторностях смешивали с безводным сульфатом натрия и экстрагировали ХОС смесью неполярного гексана (фирмы Fluka) и полярного ацетона (фирмы Lab-Scan) в соотношении 3:1 в аппарате Сокслета в течение 4 ч. Затем отгоняли растворители на лабораторном роторном испарителе Laborota 4000 (Heidolph, Германия) при температуре 40 °С и для выявления влияния фактора жирности печени на накопление ХОС определяли экстрагированные липиды гравиметрическим методом (ГОСТ 7636-85). Очистку экстрактов от мешающего влияния соэкстрагировавшихся веществ проводили на колонках с флорисилом (фирма Merk, Германия).

Таблица 1. Даты, координаты и описание районов отлова рыб и отбора проб донных отложений

Table 1. Dates, geographic coordinates and description of the fish and bottom sediment sampling sites

Для оценки возможного загрязнения в ходе пробоподготовки, а также для оценки чистоты реактивов и оборудования определяли ХОС в холостых пробах тем же методом, что и отобранные пробы.

Интенсивность антропогенной нагрузки в районах отлова рыб устанавливали по уровню содержания ПХБ и ДДТ и его метаболитов в донных осадках. Донные осадки отбирали гравиметрической трубкой диаметром 6 см в трех точках каждого района обитания ершей. Для усреднения пробы верхние слои (0-2 см) этих кернов были смешаны, гомогенизированы и высушены при температуре 40-50 °С. Подготовка и анализ проб донных осадков осуществляли в соответствии с ГОСТ Р 53217-2008. Удаление элементарной серы из экстрактов донных отложений проводили с помощью активированной металлической меди.

Анализ ХОС осуществляли в ЦКП «Спектрометрия и Хроматография» ФИЦ ИнБЮМ на газовом хроматографе Хрома- тэк Кристалл 5000 (Россия) с микродетектором электронного захвата и капиллярной колонкой (30 м*0,32 мм*0,25 мкм) с неподвижной фазой CR-5. Условия, обеспечивающие разделение при совместном присутствии шести конгенеров ПХБ, ДДТ и его метаболитов 1,1-дихлор-2,2-бис-(4-хлорфенил) этилена (далее - ДДЭ) и 1,1-дихлор-2,2-бис- (4-хлорфенил)этана (далее - ДДД), были следующими: температура испарителя 280 °С, начальная температура термостата колонки 150 °С (0 мин), далее нагрев 5°/мин до 220 °С (2 мин), далее 2°/мин до 240 °С (2 мин), далее 5°/мин до 290 °С (10 мин), температура ЭЗД 300 °С, газ-носитель - азот, делитель потока 1:20, постоянный поток 2 мл/мин, начальная скорость через колонку 40 см/с.

В пробах печени и донных осадков была измерена концентрация ДДТ и его метаболитов ДДЭ и ДДД, а также шести индикаторных конгенеров ПХБ (номера даны по номенклатуре IUPAC): трихлорбифенила (ХБ) 28, тетраХБ 52, пентаХБ 101, гексаХБ 138, 153 и гептаХБ 180. Стандартные образцы конгенеров ПХБ, ДДТ, ДДЭ и ДДД приобретали в компании «Sigma-Aldrich». Концентрация токсикантов представлена в виде суммы ДДТ и его метаболитов (ЕДДТ) и суммы индикаторных конгенеров ПХБ (ЕПХБ6), выраженной в нг/г сырой массы в печени ерша и в нг/г сухой массы в донных отложениях. Ошибка определения ХОС не превышала 20%. Для внутреннего контроля качества проводимых анализов использовали сертифицированные стандартные образцы гидробионтов (гомогената тунца IAEA-435 (IAEA, Monaco). Полученные концентрации в данном образце показали хорошую сходимость с рекомендованными значениями и были равны: для п,п'-ДДЭ - 81,95 (рекомендованный интервал равен 91 +/- 58); ПХБ 52 - 8,22 (4,4 +/- 4,6); ПХБ 101 - 27,97 (23 +/- 10); ПХБ 153 - 87,50 (81 +/- 37); ПХБ 138 - 64,18 (70 +/- 32); ПХБ 180 - 39,14 (32 +/13) нг/г сухой массы.

Отклик организмов рыб на загрязненность окружающей среды определяли по изменению биохимических параметров печени: концентрации альбумина (Алб), активности холинэстеразы (ХЭ), показателей проокси- дантно-антиоксидантной системы (активность каталазы (Кат), уровень окислительной модификации белков (ОМБ) и перекисного окисления липидов (ПОЛ)).

Образцы ткани печени несколько раз промывали холодным физраствором, гомогенизировали, центрифугировали в лабораторной рефрижераторной центрифуге MPW-352R (Польша) 15 мин с ускорением 10000 g. Для дальнейшего анализа использовали супернатант.

Концентрацию альбумина определяли с применением стандартного набора реагентов «ОЛЬВЕКС ДИАГНОСТИКУМ» (Россия). Активность ХЭ анализировали с помощью ацетилхолинхлорида в качестве субстрата (Каталог инструкций, 2005). Активность Кат регистрировали по реакции взаимодействия перекиси водорода с молибдатом аммония (Королюк и др., 1988). Уровень ОМБ выявляли по реакции взаимодействия окисленных аминокислотных остатков белков с 2,4-ди- нитрофенилгидразином. Оптическую плотность образовавшихся 2,4-динитрофенил- гидразонов регистрировали при следующих длинах волн: 346 и 370 нм (альдегидные и кетонные продукты окислительной модификации нейтрального характера), 430 нм (альдегидные продукты окислительной модификации основного характера) (Дубинина и др., 1995). Для расчета интегрального биохимического индекса (ИБХИ) использовали суммарное значение трех показателей ОМБ. Уровень ПОЛ регистрировали по реакции с тиобар- битуровой кислотой (Стальная, Гаришвили, 1977). Биохимические показатели пересчитывали на белок сырой массы ткани, концентрацию которого определяли с использованием стандартного набора реагентов «ОЛЬВЕКС ДИАГНОСТИКУМ». Измерения проводили на спектрофотометре СФ-2000 (Россия).

Для оценки ИБХИ проводили расчеты, представленные в (Beliaeff, Burgeot, 2002), в которых использовали среднее значение биомаркеров (X) на станции, среднее значение по всей выборке данных (m), его стандартное квадратичное отклонение (s), параметр Y= (Х - m)/s, который представляет собой стандартизированное среднее Х, параметр Z, равный Y или -Y, если биологический эффект соответственно активировался или ингибировался, минимальное значение для каждого биомаркера для всех станций (min) и значение S, рассчитанное как S = Z + |min|.

ИБХИ определяли по площади многоугольников, полученных на лепестковых диаграммах. Пример диаграммы ИБХИ для печени ершей из бухты Александровской показан на рис. 1.

Площадь пятиугольника АБВГД, очерченного на диаграмме, где на радиальных осях отложены стандартизованные значения биохимических маркеров S, рассчитывали по формуле (1) как сумму площадей (А) пяти треугольников, с общей вершиной в точке 0:

Площади треугольников рассчитаны через две стороны, которыми являются показатели биохимического отклика S и синус угла между ними, равного 2п/5. Приведем пример расчета площади АА0Б:

Достоверность различий уровней концентрации ХОС оценена с помощью U-критерия Манна-Уитни. Статистическая надежность уравнений нелинейной регрессии оценена с помощью F-статистики распределения Фишера. Оценку значимости коэффициента корреляционной связи (r) концентрации ХОС в печени ершей, донных отложений и ИБХИ проводили с использованием /-критерия Стьюдента. Статистическая обработка и графическое оформление полученных результатов выполнены с помощью пакета прикладных программ R, MS Excel 2016, «Гидролог» (Belokopytov, 1998).

Результаты

В донных отложениях во всех районах обнаружены следующие пять индикаторных конгенеров ПХБ: 52, 101, 138, 153 и 180. В бухтах Александровская и Стрелецкая, которые наиболее подвержены антропогенному прессу, донные отложения были представлены илами, концентрация ЕПХБ5 в них составила в среднем 110 и 121, а ЕДДТ - 35 и 51 нг/г соответственно. В бухте Балаклавской содержание ЕПХБ5 в грунтах равнялось 59, ЕДДТ - 36 нг/г. В Казачьей бухте в районе вылова ершей дно образовано крупной заиленной галькой, где загрязняющие вещества группы ДДТ не накапливались, концентрация ПХБ по сравнению с другими исследованными бухтами была минимальной - 9 нг/г (рис. 2).

Рис. 1. Лепестковая диаграмма биохимических маркеров из бухты Александровской. Кат - активность каталазы, Алб - содержание альбумина, ХЭ - активность холинэстеразы, ПОЛ - уровень перекисного окисления липидов и окислительной модификации белков (ОМБ)

Fig. 1. A biomarker radar chart for the station in Alexandrovskaya Bay. Cat: catalase activity, Alb: albumin content, ChE: cholinesterase activity, LP: lipid peroxidation, OP: level of oxidized proteins

Акватории Любимовки и бухты Ласпи относятся к открытым прибрежным участкам моря, где гру нт состоит в основном из песка, слабо сорбирующего гидрофобные загрязняющие вещества. Содержание ЕПХБ5 в этих районах было меньше, чем в бухтах, и составляло 4 и 6 нг/г соответственно, а концентрация ЕДДТ была практически равной - 1 нг/г.

Показатель жирности печени рыб изменялся в интервале от 13 до 32%, в среднем составил 24 ± 6% на сырую массу (результаты представлены в виде среднее значение ± стандартное отклонение, табл. 2). Достоверной разницы показателей жирности печени ерша между бухтами и открытыми районами не выявлено.

Во всех пробах печени обнаружены шесть индикаторных конгенеров ПХБ, а также метаболиты ДДТ: ДДЭ и ДДД (кроме бухты Казачьей, где ДДД не обнаружен).

Рис. 2. Средняя концентрация ХОС в донных отложениях в районах отлова морского ерша в севастопольской морской акватории в 2016-2017 гг. (Малахова и др., 2018) и в 2018 г.

Fig. 2. Mean OC concentration in the bottom sediments at scorpion fish catch stations in the Sevastopol marine area in 2016-2017 (Malakhova et al., 2018) and in 2018

В 83% образцов определен также исходный пестицид ДДТ. Анализ содержания ХОС показал многократные достоверные различия (р<0,05) между исследованными станциями (табл. 2). Наиболее высокая концентрация пестицидов группы ДДТ определена в бухтах Балаклавской и Стрелецкой, наименьшая - в бухте Казачья.

Несмотря на более чем сорокапятилетний запрет применения ДДТ, соединения этой группы составляли от 7 до 45% в сумме концентрации обнаруженных ХОС.

Таблица 2. Среднее содержание липидов (+/- СКО,% сырой массы), средняя концентрация п,п'-ДДТ и его метаболитов п,п'-ДДЭ и п,п'-ДДД и конгенеров ПХБ (+/- СКО, нг/г сырой массы) в печени ерша Scorpaena porcus в бухтах и открытых районах морской акватории Севастополя

Table 2. Mean fat content (+/- SD,% wet weight), mean concentration of p,p'-DDT and its metabolites p,p'- DDE and p,p'-DDD and of six PCB congeners (+/- SD, ng/g wet weight) in the liver of Scorpaena porcus from Sevastopol bays and the offshore area

Обозначение: н.обн. - не обнаружено.

Максимальное относительное количество ЈДДТ обнаружено у ершей в бухте Ласпи, где общий уровень содержания ХОС в печени был наименьшим, минимальное - в бухте Казачьей.

Преобладающим метаболитом ДДТ в пробах печени ерша был ДДЭ, содержание которого в ЈДДТ составляло в среднем 89%, что свидетельствовало о том, что исходный пестицид ДДТ в последнее время не поступал в организмы ерша. Однако в пробах наблюдалось некоторое остаточное количество ДДТ, так как метаболизм ранее накопившегося пестицида не успел пройти полностью, поскольку время полного исчезновения ДДТ для различных климатических зон, а также в зависимости от природы матрицы, где он был аккумулирован, составляет от 240 до 3850 сут. (Исидоров, 1999).

В полузакрытых севастопольских бухтах и акватории Любимовки основная доля обнаруженных ХОС в печени ерша была представлена ПХБ, концентрация суммы которых в среднем в 8,8 и 3,4 раза соответственно превышала содержание суммы ДДТ и его метаболитов. В бухте Ласпи такого превышения промышленных токсикантов над загрязнителями сельскохозяйственного назначения не наблюдали. Максимальное содержание ЕПХБ6, составляющее в среднем 2044 и 2019 нг/г, обнаружено в печени ершей в бухтах Александровской и Стрелецкой, минимальное - 139 нг/г - в бухте Ласпи (табл. 2).

Доминирующими конгенерами в пробах печени ерша были гексахлорбифенилы 138 и 153 (рис. 3). Максимальное относительное содержание ПХБ 138 и 153 определено в бухте Казачьей, 40 и 43% соответственно, минимальное - в бухте Ласпи, равное 14 и 25% соответственно.

Суммарное содержание ЈПХБ6 и ЈДДТ не превышало нормативов, установленных в России для печени рыбы, составляло 5000 и 3000 нг/г сырой массы соответственно (Гигиенические требования ..., 2002).

Сравнительный анализ молекулярных биомаркеров показал, что активность каталазы, содержание альбумина, уровень ОМБ и ПОЛ в печени рыб из бухт Александровской и Стрелецкой превышали соответствующие значения в других акваториях. Напротив, активность холинэстеразы в этих наиболее загрязненных районах была в 1,5 раза ниже, чем в более чистой бухте Ласпи и акватории Любимовки (табл. 3).

Для значений ИБХИ, рассчитанного на основании статистических параметров биохимических маркеров в печени рыб, наблюдались очевидные различия между исследованными районами. В Александровской и Стрелецкой бухтах он был многократно выше, чем в других районах, и составлял 10,87 и 13,03 соответственно. Минимальный индекс, равный 0,01, определен в бухте Ласпи (рис. 4). В целом значения ИБХИ ранжировались по убыванию в ряду: Стрелецкая бухта > Александровская бухта >> Балаклавская бухта > Казачья бухта >> акватория Любимовки >> бухта Ласпи.

Обсуждение результатов

Степень загрязнения донных отложений ХОС изучается во многих районах Мирового океана. Сравнение результатов, полученных в настоящей работе, с литературными данными по уровню содержания ХОС в морях средиземноморского бассейна показало (табл. 4), что концентрации ПХБ в донных осадках полузакрытых бухт Севастополя сопостави- мы со значениями, обнаруженными в подверженных интенсивному промышленному воздействию бухтах и заливах на юге Испании (Fernandes et al., 2002) и в Адриатическом море (Nuro et al., 2009), но были ниже, чем максимальные значения загрязнения ПХБ в проливе Босфор (Okay et al., 2009) и на юге Франции (Kanzari et al., 2012). Сравнение диапазонов концентрации ЈДДТ выявило, что уровень загрязненности донных отложений в севастопольской акватории был выше, чем в канале Берри на юге Франции (Kanzari et al., 2012), но несколько ниже, чем в других районах Средиземного моря (Fernandes et al., 2002; Qu et al., 2018; Barakat et al., 2013) (табл. 4).

Fig. 3. Proportions of PCB congeners (%) in the liver of the black scorpion fish

Таблица 3. Статистические параметры молекулярных биомаркеров для печени морского ерша Scorpaena porcus из различных по загрязненности морских районов Севастополя

Table 3. Statistical parameters of molecular biomarkers of the liver of black scorpionfish Scorpaena porcus from differently-polluted sea areas near Sevastopol

Примечание: n - количество проанализированных особей; БХМ - биохимический маркер; Кат - каталаза, ркат/мг белка; Алб - альбумин, мг/г белка; ХЭ - холинэстераза, мкмоль/г белка-с; ПОЛ - перекисное окисление липидов, нмоль/мг белка; ОМБ - окислительная модификация белков, ед. опт. плотности/г белка; X - среднее значение биомаркера на станции; m - среднее значение по всей выборке данных; s - стандартное квадратичное отклонение m; параметр Y -- стандартизированное среднее Х; параметр Z, равный Y или -Y, если биологический эффект соответственно активировался или ингибировался; min - минимальное значение для всех станций; S - стандартизованное значение биохимических маркеров.

Рис. 4. Показатель ИБХИ для печени морского ерша Scorpaena porcus из различных по загрязненности морских районов Севастополя

Fig. 4. IBR of the liver of black scorpionfish Scorpaena porcus from differently-polluted sea areas near Sevastopol

Таблица 4. Концентрация ЈПХБ (от 5 до 20 конгенеров) и ЈДДТ в донных осадках из различных районов морей средиземноморского бассейна

Table 4. PCB (from 5 to 20 congeners) and DDT concentrations in bottom sediments from various regions of the Mediterranean seas

* - не обнаружено; ** - нет данных; *** - сумма концентрации п,п'-ДДТ и его метаболитов п,п'-ДДЭ и п,п'-ДДД, а также о,п'-ДДТ и его метаболитов о,п'-ДДЭ и о,п'-ДДД.

Загрязненные донные отложения могут составлять серьезную угрозу для фито- и зоо- бентосных организмов, а через пищевую цепь также оказывать влияние на демерсальных рыб, к которым относится изученный вид. Экологическую оценку уровней загрязненности грунтов проводят сравнением с определенными нормами. В Российской Федерации такие нормы для морских донных осадков не установлены. Известные рекомендованные критерии экологического качества морских осадков рассчитаны на основании пороговой концентрации (threshold effect concentration - TEC), ниже которой неблагоприятные воздействия маловероятны, вероятной концентрации (probable effect concentration - PEC), при которой возможны негативные эффекты, и предельной концентрации (extreme effect concentration - EEC), воздействие которой приводит к ухудшению в состоянии гидробионтов (Gomez-Gutierrez et al., 2007). В работе (Gomez-Gutierrez et al., 2007) для суммы ПХБ указаны уровни ТЕС, РЕС и ЕЕС, равные 29, 274 и 3490 соответственно, для суммы ДДТ, ДДЭ и ДДД - 5,5, 77 и 703 нг/г сухой массы соответственно. Сравнение концентрации ХОС в донных отложениях с этими критериями представлено на рис. 5.

Согласно этим нормам концентрация как ^ПХБ5, так и ^ДДТ в донных осадках в бухтах Александровской, Стрелецкой и Балаклавской находилась на уровне, при котором возможны неблагоприятные воздействия на биоту, а в бухтах Казачьей, Ласпи и в акватории Любимовки отрицательные эффекты от воздействия токсикантов на биоту маловероятны.

В печени рыб максимальное накопление ХОС так же, как в донных отложениях, было обнаружено в полузакрытых бухтах. Соотношение уровней загрязненности донных осадков исследованных акваторий и показателей содержания ХОС в печени ерша показаны на рис. 6.

Статистическая надежность уравнений регрессии на рис. 6 оценена с помощью F-статистики распределения Фишера. В результате расчетов было установлено, что коэффициенты детерминации уравнения зависимости ^ПХБ6 в печени от ^ПХБ5 в грунтах статистически значимы и уравнение регрессии статистически надежно (а = 0,05), чем подтверждается предположение о влиянии уровня загрязненности среды обитания ерша в изученных полигонах на содержание ^ПХБ6 в печени скорпены.

Статистическая значимость функциональной зависимости ^ДДТ в печени от ^ДДТ в донных осадках не подтверждена.

Рис. 5. Концентрация ЈПХБ5 (а) и ЈДДТ (б) в исследованных донных осадках и их пороговая концентрация (ТЕС), вероятная концентрация (PEC) и предельная концентрация (EEC) в донных осадках (Gomez- Gutierrez et al., 2007)

Fig. 5. SPCB5 (а) and ЈDDT (б) eoncentrations in the sediments and their threshold effect concentrations (TEC), probable effect concentrations (PEC) and extreme effect concentrations (EEC) in bottom sediments (Gomez- Gutierrez et al., 2007)

Рис. 6. Соотношение между содержанием ХОС в донных отложениях и печени морского ерша в севастопольской акватории

Fig. 6. Correlation of the OC content in liver of scorpion fish and in bottom sediments in the Sevastopol coastal areas

Сравнительная оценка выявленных концентраций в печени ерша с опубликованными данными затруднена из-за отсутствия единообразия в представлении данных: в публикациях концентрации представлены как на сухую, так и на сырую и липидную массу проб, количество обнаруженных конгенеров ПХБ варьирует в широких диапазонах от 6-7 маркерных до 40 индивидуальных соединений, а сумма метаболитов ДДТ - от двух до шести. Несмотря на это, проведенный литературный поиск показал, что в различных акваториях Мирового океана имеются районы, где в печени рыб обнаруживались более высокие концентрации пестицидов группы ДДТ, чем в севастопольской акватории. Так, в Азовском море концентрация в печени бычка-кругляка достигала 936 нг/г (Короткова и др., 2019) (табл. 5). На шельфе Сан-Диего в печени скор- пены Scorpaena guttata концентрация ^ДДТ в 2000 г. составляла в среднем 363 нг/г (Groce et al., 2005), что в полтора раза выше, чем средняя концентрация ЈДДТ в севастопольском регионе, где в среднем она была равна 212 нг/г (табл. 5). Концентрации ЈДДТ в печени придонных видов рыб в северных морях Баренцевом (Плотицына, Зимовейскова, 2016) и Ирландском (Giltrap et al., 2017) во втором десятилетии XXI в. оказались более низкими, чем обнаруженное содержание ЕДДТ в печени ерша в данном исследовании.

В отличие от ^ДДТ концентрация ^ПХБ в печени проанализированных рыб оказалась выше, чем в большинстве соответствующих опубликованных данных (табл. 5).

Соотношение конгенеров ПХБ в печени рыб дает информацию о связи между структурой ПХБ, их распространенностью в окружающей среде и потенциальной токсичностью и является характеристикой изменения изначального состава смеси ПХБ (Бродский и др., 2012). В пробах печени ерша из всех районов, кроме бухты Ласпи, доминирующими конгенерами были высокохлорированные гексахлорбифенилы 138 и 153 (см. рис. 3). Такое избирательное накопление гексахлорбифенилов, с одной стороны, может быть связано с потерей низкохлорированных конгенеров благодаря их селективной биотрансформации по мере включения ПХБ в пищевые цепи (Клюев, Бродский, 2000). Кроме этого, повышение доли высокохлорированных бифенилов может быть связано со снижением содержания низкохлорированных конгенеров в среде обитания рыб, так как известно, что в загрязненных ПХБ биотопах в микробном сообществе формируются бактерии, способные разрушать полихлорбифенилы (Vasilyeva, Strijakova, 2007). В то же время, в экологически чистых районах активные штаммы деструкторов токсичных соединений выявлены не были (Егорова и др., 2014). В бухте Ласпи не наблюдалось значительного превышения гексахлорированных бифенилов над тетра- и пентахлорированными конгенерами, что, возможно, связано с невысоким уровнем загрязненности ХОС ее акватории, близким в последние годы к таковому в глубоководной части Черного моря (Петренко и др., 2015).

Таблица 5. Концентрация ПХБ и ДДТ и его метаболитов в печени рыб из различных морских регионов

Table 5. The concentration of PCBs and DDT and its metabolites in the liver of fish from various marine areas

1 - сумма концентрации шести конгенеров ПХБ (по IUPAC): 28, 52, 101, 138, 153, 180; 2 - нет данных; 3 - сумма концентрации 11 конгенеров ПХБ по IUPAC: 28, 31, 52, 99, 101, 105, 118, 138, 153, 156, 180 +/- СКО; 4 - сумма концентрации 5 конгенеров ПХБ (по IUPAC): 118, 138, 153, 180, 187; 5 - сумма концентрации п,п'-ДДТ и его метаболитов п,п'-ДДЭ и п,п'-ДДД, а также о,п'-ДДТ и его метаболитов о,п'-ДДЭ и о,п'-ДДД, 6 - сумма концентрации 7 конгенеров ПХБ (по IUPAC): 28, 52, 101, 118, 138, 153, 180.

Воздействие высоких концентраций хлорорганических ксенобиотиков на биоту может вызвать множество специфичных ответных реакций, которые определяют перестройки на разных уровнях - от биохимических процессов в клетках до популяционных изменений, и оказать влияние на многие метаболические процессы в организме, в том числе на процессы фотосинтеза у первичных продуцентов (Егоров и др., 2012), антиоксидантной системы - у консументов (Малахова и др., 2018).

Для оценки воздействия токсикантов используют молекулярные биомаркеры как ранние прогностические показатели. Универсальным показателем окислительного стресса при действии отдельных токсикантов и комплексном загрязнении акваторий является повышение в тканях гидробионтов содержания продуктов ПОЛ и ОМБ (Napierska et al., 2009; Rudneva et al., 2016; de Moura et al., 2017). В данном исследовании увеличение уровня ОМБ и ПОЛ в печени ершей из наиболее загрязненных районов (бухты Стрелецкая и Александровская) свидетельствует о смещении прооксидантно-антиоксидант- ного равновесия в сторону интенсификации процессов свободнорадикального окисления белков и липидов и развитии окислительного стресса. В то же время, увеличение активности каталазы у рыб из бухт Стрелецкой и Александровской является адаптивной ответной реакцией фермента на загрязнение и отражает способность активно противостоять последствиям окислительного стресса. Ранее также было отмечено, что при адаптации к условиям загрязнения среды обитания гидробионты усиливали антиоксидантную защиту, при этом реакцией на действие ПХБ было повышение активности ферментов су- пероксиддисмутазы, каталазы и пероксидазы (Schlezinger et al., 2000).

Определение концентрации альбумина в печени и сыворотке крови рыб является важнейшим диагностическим инструментом, отражающим функции печени, метаболический статус, стрессовые условия и качество среды обитания. Альбумин участвует в процессах детоксикации и обладает высокой антиоксидантной активностью (Пашина, Золотавина, 2014; Michelis et al., 2010). Увеличение концентрации альбумина в печени ершей из бухт Александровской и Стрелецкой по сравнению со значениями у рыб из других акваторий может быть следствием его интенсивного синтеза для транспорта и обезвреживания ксенобиотиков, поступающих в организм.

Определение активности ХЭ и ее ингибирование при различных воздействиях является удобным, быстрым и адаптивным тестом оценки токсичности многих химических соединений (Gad, 2009; Rudneva et al., 2016). Снижение активности ХЭ в печени ершей из наиболее загрязненных бухт (Александровской и Стрелецкой), вероятно, обусловлено ингибирующим действием высоких концентраций токсикантов. Имеющиеся в литературе данные также свидетельствуют о снижении холинэстаразной активности в тканях рыб из районов с высоким уровнем загрязнения в результате ингибирования фермента токсикантами (Gad, 2009; Rudneva et al., 2016).

Общей оценкой влияния загрязняющих веществ на ершей может быть величина рассчитанных ИБХИ, для которых наблюдались очевидные различия между исследованными районами (рис. 4). Для Александровской и Стрелецкой бухт величина ИБХИ была многократно выше, чем для других районов, и составляла 10,87 и 13,03.

Значительное увеличение ИБХИ у рыб в двух бухтах, очевидно, связано с внешним негативным воздействием на исследованные особи в этих районах. Анализ связи значений ИБХИ с уровнями накопления ХОС в печени рыб (рис. 7а) и в донных отложениях (рис. 7б) показал, что значительные коэффициенты корреляции при высоком уровне значимости характеризуют тесную прямую связь между ИБХИ и содержанием УПХБ5 в донных отложениях (г = 0,95, p < 0,05) и УПХБ6 - в печени (г = 0,95, p < 0,05). Видимо, изученные биохимические параметры могут быть приоритетными маркерами для обнаружения откликов организмов на воздействие данных токсикантов.

Интегральные биохимические индексы нашли широкое применение в мониторинге состояния водных организмов. ИБХИ могут рассчитываться на основе различного количества биохимических параметров, в некоторых работах их количество достигает сотни (Немова, Высоцкая, 2004). Также показано, что индексы могут быть рассчитаны на основе измерения небольшого числа показателей (Beliaeff, Burgeot, 2002; Luk'yanova, Korchagin, 2017). В работе (Beliaeff, Burgeot, 2002) был рассчитан ИБХИ на основе измерений активности этоксирезоруфин-О- деэтилазы, ацетилхолинэстеразы и содержания ДНК-аддуктов в печени камбалы Platichthys flesus из четырех районов в заливе Сены (Ла-Манш). Авторы данного исследования сравнивали ИБХИ с содержанием полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) и ПХБ в печени рыб. Ими установлено увеличение значения ИБХИ в районах с высоким уровнем комплексного загрязнения среды обитания рыб, при этом значения ИБХИ прямо коррелировали с содержанием ПАУ и ПХБ в их печени (Beliaeff, Burgeot, 2002).

Рис. 7. Соотношение между средней концентрацией ХОС в печени морского ерша (а) и донных отложениях (б) в исследуемых районах севастопольской морской акватории и ИБХИ, рассчитанного по биохимическим показателям печени ерша

Fig. 7. Correlation between the OC mean concentration in the liver of scorpion fish (a) and in sediments (б) in the Sevastopol coastal area and the IBR in the liver of scorpion fish

С использованием молекулярных биомаркеров - активности каталазы, глутатион- S-трансферазы, уровня ПОЛ и концентрации глутатиона - оценено состояние морских и эстуарных организмов, обитающих в загрязненной прибрежной зоне зал. Петра Великого Японского моря. С помощью статистической обработки результатов рассчитаны и графически представлены интегральные биохимические индексы для мидий Crenomylilus grayanus, собранных на морских станциях с разным уровнем загрязнения, и мохнаторукого краба Eriocheir japonica из эстуариев рек, впадающих в зал. Петра Великого. Отмечено, что значения индексов соответствовали степени загрязнения районов отбора животных (Luk'yanova, Korchagin, 2017).

Заключение

Сравнительное исследование содержания ХОС в донных отложениях районов отлова морского ерша в севастопольской морской акватории с экологическими нормами показало, что в бухтах Александровской, Стрелецкой и Балаклавской уровень загрязнения ПХБ и ДДТ может привести к неблагоприятным воздействиям на биоту, а в бухтах Казачья, Ласпи и в акватории Любимовки отрицательные эффекты от воздействия токсикантов маловероятны.

Концентрация ХОС в печени ерша в бухтах Александровская и Стрелецкая, составляющая для ^ПХБ6 2044 и 2019 и для ^ДДТ 162 и 319 нг/г сырой массы, была выше в десятки раз, чем в открытых акваториях, и положительно коррелировала с количеством накопленных поллютантов в донных осадках.

Для определения отклика организма на уровень загрязнения в печени ерша исследовали активность холинэстеразы, каталазы, содержание альбумина, уровень окислительной модификации белков и продуктов перекисного окисления липидов. Общая оценка влияния загрязняющих веществ на ершей проведена при помощи сравнения величин ИБХИ, рассчитанных по комплексу этих биохимических маркеров. Диапазон величины ИБХИ изменялся от 0,01 в бухте Ласпи до 13,03 в бухте Стрелецкой. Выявлены статистически достоверные корреляционные связи между значениями ИБХИ и концентрацией ПХБ в печени ерша и в донных отложениях (r=0,95, p<0,05), следовательно, значительная вариабельность ИБХИ определяется уровнем загрязненности среды обитания и печени ерша. По показателям ИБХИ рыбы в районах бухт Ласпи, Казачьей и в открытой акватории Любимовки в летние сезоны 2016-2018 гг. находились в более благоприятном состоянии, чем в полузакрытых бухтах Александровской, Стрелецкой и Балаклавской.

Список литературы / References

Бродский Е.С., Шелепчиков А.А., Фешин Д.Б., Ефименко Е.С., Агапкина Г.И. (2012) Профиль конгенеров полихлорированных бифенилов в почвах Москвы. Вестник Московского университета. Серия 17: Почвоведение, 2: 35-40 [Brodskiy E.S., Shelepchikov A.A., Feshin D.B., Efimenko E.S., Agapkina G.I. (2012) Profile of congeners of polychlorinated biphenyls in soils of Moscow-City. Bulletin of Moscow University. Series 17: Soil Science [Vestnik Moskovskogo universiteta. Seriya 17: Pochvovedenie], 2: 35-40 (in Russian)]

Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов (Сан-ПиН 2.3.2.1078-01) (2002) М., Минздрав РФ, 164 с. [Hygienic requirements for food safety and nutritional value (San-PiN 2.3.2.1078-01) (2002) Moscow, Ministry of Health of the Russian Federation, 164 p. (in Russian)]

ГОСТ 7636-85. Рыба, морские млекопитающие, морские беспозвоночные и продукты их переработки. Методы анализа (2003) М., ИПК Стандартов, 23 с. [GOST 7636-85. Fish, marine mammals, marine invertebrates and products of their processing. Analysis methods (2003) Moscow, IPK Standards, 23 p. (in Russian)]

ГОСТ Р. 53217-2008. Качество почвы. Определение содержания хлорорганических пестицидов и полихлорированных бифенилов. Газохроматографический метод с электронозахватным детектором (2008) М., Стандартинформ [GOSTR. 53217-2008. Soil quality. Determination of the content of organochlorine pesticides and polychlorinated biphenyls. Gas chromatographic method with an electron capture detector (2008) Moscow, Standartinform (in Russian)]

Дубинина Е.Е., Бурмистpов С.О., Ходов Д.А., Поротов И.Г. (1995) Окислительная модификация белков сыворотки крови человека, метод ее определения. Вопросы медицинской химии, 41(1): 24-26 [Dubinina E.E., Burmistrov S.O., Khodov D.A., Porotov I.G. (1995) Oxidative modification of human serum proteins. A method of determining it. Issues of Medical Chemistry [Voprosy meditsinskoi khimii], 41(1): 24-26 (in Russian)]

Егоров В.Н., Малахова Л.В., Малахова Т.В., Тодоренко Д.А. (2012) Адаптационные характеристики черноморской зеленой водоросли Ulva rigida Ag. при хроническом и импакт- ном воздействии полихлорбифенилов. Науковий вісник Ужгородського універсітету. Серия Біология, 32: 12-18 [Egorov V.N., Malakhova L.V., Malakhova TV., Todorenko D.A. (2012) Adaptable characteristics of the Black Sea green algae Ulva rigida Ag. under chronic and impact influence of polychlorinated biphenyls. Scientific Bulletin of the Uzhhorod University. Series Biology [Naukoviy visnik Uzhgorods'kogo universitetu. Seriya Biologiya], 32: 12-18 (in Russian)]

Егорова Д.О., Шестакова Е.А., Первова М.Г., Плотникова Е.Г. (2014) Бактерии-деструкторы полихлорированных бифенилов из почв с различным уровнем загрязнения. Вестник Пермского университета. Серия: Биология, 4: 64-72 [Egorova D.O., Shestakova E.A., Pervova M.G., Plotnikova E.G. (2014) Bacteria destructors of polychlorinated biphenyls from the soil with various level of pollution. Bulletin of Perm University. Biology [Vestnik Permskogo universiteta. Seriya: Biologiya], 4: 66-72 (in Russian)]

Исидоров В.А. (1999) Введение в химическую экотоксикологию. СПб., Химиздат, 144 c. [Isidorov V.A. (1999) Introduction to chemical ecotoxicology. St. Petersburg, Khimizdat, 144 p. (in Russian)]

Каталог инструкций. Диагностические наборы реактивов для клинических, биохимических и микробиологических исследований (2005) Днепропетровск, Филисит-диагностика, 199 с. [Catalog of instructions. Diagnostic reagent kits for clinical, biochemical and microbiological studies (2005) Dnepropetrovsk, Filisit-diagnostika, 199 p. (in Russian)]

Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова И.Г., Токарев В.Е. (1988) Метод определения активности каталазы. Лабораторное дело, 1: 16-19 [Korolyuk M.A., Ivanova L.I., Mayorova I.G., Tokarev V.E. (1988) Method for determination of catalase activity. Laboratory Work [Laboratornoe delo], 1: 16-19 (in Russian)]

Клюев Н.А., Бродский Е.С. (2000) Определение полихлорированных бифенилов в окружающей среде и биоте. Полихлорированные бифенилы. СупертоксикантыXXI века. Информационный выпуск № 5. М., ВИНИТИ, с. 31-63 [Klyuev N.A., Brodsky E.S. (2000) Determination of polychlorinated biphenyls in the environment and biota. Polychlorinated biphenyls. Supertoxicants of the 21st century. News release No. 5. Moscow, VINITI, p. 31-63 (in Russian)]

Короткова Л.И., Кораблина И.В., Барабашин Т.О. (2019) Аккумуляция приоритетных поллютантов в рыбах Азовского моря за последнее десятилетие. Водные биоресурсы и среда обитания, 2(3): 20-32 [Korotkova L.I., Korablina I.V., Barabashin T.O. (2019) Accumulation of priority pollutants in the fish of the Azov sea over the last decade. Aquatic Bioresources & Environment [Vodnye bioresursy i sreda obitaniya], 2(3): 20-32 (in Russian)]

Логоминова И.В., Малахова Л.В., Малахова Т.В., Артов А.М., Коростелева А.В., Постникова А.Н. (2018) Новые данные о хлорорганических поллютантах в подкожном жире черноморских китообразных. Труды Карадагской научной станции им. Т.И. Вяземского - природного заповедника РАН, 4(8): 16-25 [Logomonova I.V., Malachova L.V., Malachova TV., Artov A.M., Korosteleva AV., Postnikova A.N. (2018) New data on organochlorine pollutants in the subcutaneous fat of the Black Sea cetaceans. Proceedings of the T.I. Vyazemsky Karadag scientific station -- Nature Reserve of the RAS [Trudy Karadagskoy nauchnoy stancii im. T.I. Vyazemskogo - prirodnogo zapovednika RAN], 4(8): 16-25 (in Russian)]

Малахова Л.В. (2005) Распределение полихлорированных бифенилов в поверхностном слое донных осадков Севастопольской бухты (Черное море). Экологическая безопасность прибрежной и шельфовой зон и комплексное использование ресурсов шельфа, 12: 268272 [Malakhova L.V. (2005) Distribution of polychlorinated biphenyls in the surface sediments of Sevastopol Bay (the Black Sea). Ecological Safety of Coastal and Shelf Zones and Multiple Use of Shelf Resources [Ekologicheskaya bezopasnost' pribrezhnoy i shel'fovoy zon i kompleksnoe ispol'zovanie resursov shel'fa], 12: 268-272 (in Russian)]