Иммобилизация растительных клеток и клеток животных

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

УО «ПОЛЕССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

Факультет биотехнологический

Кафедра биотехнологии

РЕФЕРАТ

по дисциплине: Системная биология (Иммобилизованные клетки и ферменты)

на тему: Иммобилизация растительных клеток и клеток животных

Денисюк Виктор Анатольевич

ПИНСК 2021

Введение

Изолированные растительные клетки, как и клетки микроорганизмов, можно культивировать invitro в колбах на качалках или в ферментерах, а возможность использования культур растительных клеток для получения биопрепаратов уже давно общепризнана. Из примерно 30 000 известных природных соединений более 90% можно обнаружить в высших растениях. Культивируемые растительные клетки тотипотентны, т. е. в принципе в них может экспрессироваться вся генетическая информация, и, следовательно, любое вещество, находящееся в интактном растении, можно получить, культивируя клетки данного растения. В настоящее время многие из промышленно важных соединений, используемых в фармацевтической, пищевой и парфюмерной промышленности, выделяют из тканей возделываемых или дикорастущих растений. Эти вещества имеют сложное химическое строение, и поэтому их трудно получить каким-либо другим способом. Возможности получения некоторых важных видов растительного сырья ограничены уже сегодня или могут стать ограниченными в ближайшем будущем. В связи с этим настоятельно необходимы поиски и разработка альтернативных источников. Одним из таких источников являются культуры растительных клеток; за последнее десятилетие в этой области достигнуты значительные успехи. Так, недавно в Японии был впервые внедрен промышленный способ получения природного соединения (шиконина), основанный на культивировании растительных клеток [1].Однако для промышленного использования культур растительных клеток с целью получения широкого спектра органических соединений необходимо решить ряд основных проблем. Растительные клетки в культуре значительно отличаются от клеток микро организмов, поэтому новейшие способы ферментации, разработанные для последних, в большинстве случаев не годятся для культивирования растительных клеток. Изучался биосинтез различных соединений в модельных системах, подобранных таким образом, чтобы они включали различные виды биосинтеза: синтез denovo из простых источников углерода (например, сахарозы), синтез из добавленных к питательной среде предшественников или биоконверсия (например, гидроксилирование). Для сохранения биосинтетической активности большое значение имеет жизнеспособность клеточных препаратов, поэтому применялись различные методы иммобилизации и изучалась жизнеспособность и биосинтетическая активность полученных препаратов [3].

1. Методы иммобилизации растительных клеток

Растительные клетки достаточно чувствительны к изменениям окружающей среды, и, следовательно, для иммобилизации могут быть использованы только наиболее мягкие методы.

Установлено, что для крупных чувствительных растительных клеток самым подходящим из широко используемых методов иммобилизации является включение в гель. Известны также примеры иммобилизации растительных клеток методами адсорбции и ковалентной сшивки. Иммобилизацию растительных клеток проводят в стерильных условиях, поскольку растительные клетки растут относительно медленно и, следовательно, очень чувствительны к заражению быстро растущими клетками микроорганизмов. В связи с этим используемый для иммобилизации носитель должен выдерживать соответствующую обработку, например автоклавирование [2].

1.1 Включение в гель

Для иммобилизации растительных клеток путем включения в гель можно использовать несколько различных методик. Конечная концентрация иммобилизованных клеток в препарате может варьировать в широких пределах (от нескольких процентов до 50% (по весу) и выше). Оптимальную концентрацию клеток нужно определять отдельно для каждого конкретного случая. Для иммобилизации клеток различных типов, в том числе растительных, широко используют альгинат кальция. Условия включения в гель альгината кальция очень мягкие, полимер можно стерилизовать автоклавированием, и кроме того, процесс иммобилизации обратим, что достигается добавлением агента, связывающего кальций (например, ЭДТА или лимонной кислоты). Конечная концентрация альгината в препарате иммобилизованных клеток может быть разной в зависимости от типа используемого альгината. Стабильность геля возрастает с увеличением концентрации полимера, но при высоких концентрациях альгината суспензия альгинат/клетки становится очень вязкой, что может затруднить процесс образования гранул.

Х-Каррагинан представляет собой полисахарид, содержащий сульфоэфирные группы (сульфированы более 20% остатков сахара) и не растворимый в холодной воде. Однако при нагревании он растворяется, а при последующем охлаждении образует гель. Температура образования и качество геля зависят как от концентрации полимера, так и от количества и типа присутствующих в растворе катионов (например, K+, NH4+, Ca2+ или Ba2+).

Агар и агароза (очищенный препарат агара) образуют гели при охлаждении горячего раствора. Для понижения температуры гелеобразованпяагарозу можно химически модифицировать введением гидроксиэтильных групп. Оптимальная температура геле-образования при иммобилизации растительных клеток 25-30 °С. Преимуществом геля агарозы является то, что он стабилен в отсутствие противоионов. В последнее время для иммобилизации клеток микроорганизмов широко применяют полиакриламид. Однако некоторые вещества, используемые при радикальной полимеризации акриламида, токсичны для растительных клеток. Были разработаны методы, позволяющие уменьшить токсичность акриламида и других реагентов, что позволило получить жизнеспособные растительные клетки, иммобилизованные в полиакриламидном геле.

Для иммобилизации биокатализаторов можно использовать предполимеры уретана с концевыми функциональными изоцианатными группами. При смешивании таких предполимеров с каким-либо водным раствором, например клеточной суспензией, гель образуется в течение нескольких минут. В присутствии воды предполимеры уретана реагируют друг с другом с образованием карбаматных связей. Иммобилизованные данным способом клетки Lavandulavera использовали для получения пигмента.

Для иммобилизации растительных клеток можно использовать мембраны различной конфигурации. Впервые иммобилизация растительных клеток данным методом была продемонстрирована на полых трубчатых реакторах. Растительные клетки наносят на наружную поверхность полой трубки и через нее с относительно высокой скоростью прокачивают обогащенную кислородом питательную среду. При изучении модельной системы было показано, что в полом трубчатом реакторе иммобилизованные клетки Glycinemax продуцируют фенольные соединения с постоянной скоростью в течение 700 ч [4].

1.2 Адсорбция

Иммобилизация с помощью адсорбции на твердых носителях является очень мягким методом. Однако до настоящего времени его не использовали для иммобилизации растительных клеток.Растительные протопласты, адсорбированные на поперечно-сшитом декстране, сохраняли свою жизнеспособность [2].

1.3 Ковалентное связывание

Метод ковалентного связывания клеток микроорганизмов с твердым носителем применяют достаточно редко. Что же касается его использования в случае растительных клеток, то известен только один пример ковалентной сшивки клеток Solanumaviculare с нерастворимой матрицей из полифениленоксида. Носитель активировали глутаровым альдегидом, и после удаления избытка глутарового альдегида гель добавляли к суспензии растительных клеток. Иммобилизованные клетки использовали в колоночном реакторе для получения стероидных гликозидов в течение 11 суток [4].

2. Жизнеспособность иммобилизированных растительных клеток

В большинстве случаев необходимо, чтобы растительные клетки после иммобилизации сохраняли жизнеспособность. Это особенно важно, когда в процесс синтеза denovo вовлечены все пути метаболизма клетки [5].

2.1 Окрашивание

Окрашивание флуоресцеиндиацетатом (ФДА) часто используют для определения жизнеспособности клеток. После адсорбции ФДА клетками при наличии эстеразной активности он деацетилируется и становится флуоресцирующим. Окрашенные клетки рассматривают с помощью микроскопа, снабженного УФ-источником света.

Выраженное в процентах отношение клеток, находящихся в данный момент времени на какой-либо стадии митоза, к их общему числу в популяции называют митотическим индексом (МИ). По его изменению в течение инкубации можно судить о жизнеспособности клеток. Удобным красителем для окраски хромосом после фиксации является карбол-фуксин [5].

2.2 Дыхание

О жизнеспособности клеток судят по их дыханию, которое можно измерять в течение инкубации через различные промежутки времени. Измерения проводят с помощью кислородного электрода Кларка по следующей стандартной методике. Клетки, суспендированные в среде (сырой вес 100-200 мг), или соответствующее количество иммобилизованных клеток (общий объем 5 мл) инкубируют при 25 °С. G помощью самописца регистрируют потребление кислорода, определяют сухой вес клеток (см. ниже) и рассчитывают удельную скорость дыхания.

Очень часто дыхание иммобилизованных клеток менее интенсивно, чем дыхание такого же количества суспендированных в среде клеток, что объясняется диффузионными затруднениями внутри полимерной сетки [5].

3. Способность иммобилизированных растительных клеток к биосинтезу

В клетках высших растений протекает множество химических реакций, которые можно использовать для синтеза сложных органических соединений. Наряду с реакциями биоконверсии, такими как гидроксилирование, метилирование и т. д., в растительных клетках осуществляется синтез органических соединений denovo из более простых соединений углерода. Иммобилизованные растительные клетки, сохранившие жизнеспособность, по-видимому, обладают такой же биосинтетической активностью, как и суспендированные в среде. Ниже приведены примеры, иллюстрирующие способность иммобилизованных растительных клеток к биосинтезу [7].

3.1 Биоконверсия

12-в-Гидроксилирование производного дигитоксина с образованием производного дигоксина представляет промышленный интерес. Эту реакцию способны осуществлять как суспендированные в среде, так и иммобилизованные клетки Digitalislanata в периодическом или непрерывном режимах. Клетки Digitalis, иммобилизованные в альгинатном геле могут быть использованы для гидроксилированияметилдигитоксина в метилдигоксин в периодическом режиме в течение 180 суток (если каждые трое суток гранулы геля с иммобилизованными клетками переносить в свежую среду). В данном случае время использования иммобилизованных клеток значительно превышает соответствующее время для клеток, суспендированных в среде; следовательно, с помощью иммобилизованных клеток удается получить более высокий выход продукта на единицу биомассы.

Культивируемые клетки Catharanthusroseus разных линий синтезируют различные индолсодержащие алкалоиды, такие как аймалицин, серпентин и катарантин. Конечным ферментом биосинтеза аймалицина является катенаминредуктаза. Для превращения катенамина в изомеры аймалицина использовали клетки С. roseus, включенные в агарозный гель и обработанные специальным веществом, повышающим проницаемость клеточных мембран [6].

3.2 Синтез из предшественников

Если для какого-либо соединения известен путь биосинтеза и доступны вещества-предшественники, то его выход можно существенно увеличить, добавляя эти предшественники в питательную среду. Путь биосинтеза изомеров аймалицина в клетках С. roseus детально изучен, и отдаленными предшественниками этих изомеров являются триптамин и секологанин [6].

3.3 Синтез denovo

При синтезе denovo сложных органических веществ из простых органических соединений с помощью культивируемых растительных клеток используется большая часть путей клеточного метаболизма. Поэтому синтез denovo осуществим только в том случае, если клетки жизнеспособны. В настоящее время известны лишь несколько примеров синтеза denovo сложных органических соединений с помощью иммобилизованных растительных клеток. Очевидно, сама по себе иммобилизация практически не влияет на биосинтетическую активность клеток. Ниже описаны два примера синтеза denovo: индолсодержащих алкалоидов и антрахинонов.

Индолсодержащие алкалоиды, такие как аймалицпн и серпентин, удалось получить с помощью клеток С. roseus, включенных в альгинатный и полиакриламидный гели. Для получения этих алкалоидов были отобраны специальные линии клеток.

Антрахиноны синтезируются различными культурами растительных клеток. Быдо описано получение антрахинонов с помощью включенных в альгинатный гель клеток Morindacitrifolia. Было установлено, что в одинаковых условиях иммобилизованные клетки М. citrifolia синтезируют в 10 раз больше продукта, чем клетки, суспендированные в среде [7].

4. Иммобилизованные клетки животных

Ограниченность использования иммобилизованных животных клеток в значительной мере была обусловлена трудностью их культивирования. За последние годы достигнуты большие успехи в разработке методов контролируемого культивирования in vitro млекопитающих. Можно выделить несколько факторов, которые способствовали быстрому развитию этой области биотехнологии, а именно:

- получение непрерывных, полностью охарактеризованных клеточных линий;

- обнаружение специфических факторов роста;

- разработка аппаратуры для культивирования изолированных клеток в оптимальных условиях.

Быстрое развитие методологии культивирования клеток оказало огромное влияние на научные исследования во многих областях биологии. Постоянно упрощаются и совершенствуются в частности, методики выделения и изучения продуктов клеточного метаболизма, таких как гормоны, ферменты и антитела. Иммобилизованные поверхностно-активные клетки тканей животных играют все большую роль во многих областях биологии. Иммобилизованные клетки обычно сохраняют высокую степень функциональной дифференцировки, что облегчает изучение регуляции клеточного метаболизма гормонами и ростовыми факторами, а также способствует изучению механизмов модификации клеточных функций под действием различных эффекторов, например лекарственных препаратов и токсинов. Так, иммобилизованные гепатоциты нашли широкое применение в исследованиях метаболизма чужеродных веществ в печени [8].

4.1 Методы выделения и иммобилизации клеток

Большинство клеток твердых тканей, таких как ткани почек, печени, кожи, являются поверхностно-активными. В зависимости от подходов, используемых для прикрепления изолированных клеток к твердой подложке, или матрице, используют различные методики культивирования клеток тканей животных и человека. Из-за поверхностно-активных свойств invitro их можно культивировать только в виде тонких пластов или монослоев, непосредственно связанных с поверхностью подложки. Отдельные клетки, образующие этот монослой, контактируют как с соседними, так и с самой подложкой, поэтому их можно рассматривать как иммобилизованные. Однако, в отличие от иммобилизованных растительных клеток и ферментов, связывание между поверхностно-активными клетками млекопитающих и твердой подложкой обычно проводят без специальной физической или химической обработки. Это связывание осуществляется благодаря исходной активности препарата изолированных клеток, совместимости клеток с твердой подложкой, а также наличию в сыворотке или специально добавленных в среду веществ, способствующих связыванию клеток. Для некоторых видов клеток (например, клеток лимфобластоидного происхождения), обладающих особыми свойствами, разработана иная система культивирования. Клетки растут и размножаются в суспензии без предварительной иммобилизации, что облегчает разработку промышленных способов их культивирования [7].

При культивировании поверхностно-активных клеток требуется большая площадь поверхности носителя, а также адекватное и строго контролируемое поступление питательных веществ и кислорода, что вплоть до последнего времени сдерживало их крупномасштабное применение. Благодаря разработке методов культивирования на микроносителях, при которых клетки выращивают в виде монослоев, иммобилизованных на гранулах полистерола, стекла или декстрана, стало возможным культивирование поверхностно-активных клеток в суспензии. Жизнеспособные, чувствительные к действию эндогенных веществ (гормона) клетки можно выделить либо из нормальных, либо из патологических тканей человека или же из аналогичных тканей животных. В любом случае изолированные клетки получают, подвергая образцы тканей ферментативному диспергированию. При этом чтобы избежать некроза и получить максимальный выход жизнеспособных клеток, ткань следует измельчать как можно быстрее. Все операции следует проводить в стерильных условиях. Измельчение тканей начинают с приготовления срезов толщиной 0,5-1,0 мм с помощью микротома, успешно можно применять ножницы и пинцет (рис. 4.1) [9].

Рис. 4.1. Схема приготовления суспензии изолированных жизнеспособных клеток из свежеполученного образца ткани

Кроме того, из эпителиальных клеток выделяют особые факторы связывания, которые осуществляют прикрепление клеток к подложке, связывая гликопротеины клеточной поверхности с предварительно адсорбированными сывороточными или фибробластными гликопротеинами (рис. 4.2) [9].

Рис. 4.2. Прикрепление и организация в монослой свежеприготовленных клеток: А - молекулы гликопротеина, полученные из культурной среды, обогащенной сывороткой, адсорбируются на поверхности (электростатическое взаимодействие) лунки; Б - клетки, полученные из целой ткани оседают на поверхность лунки через 1-2 часа после нанесения;В - факторы связывания, полученные из клеток, прикрепляют клетки к поверхности, связывая сывороточные гликопротеины с гликопротеинами клеточной поверхности; Г - через 24 часа иммобилизованные клетки распластываются по поверхности, образуя монослой

Таким образом, иммобилизация клеток достигается благодаря первоначальному контакту и последующему распластыванию клеток на поверхности, в результате чего формируется монослой. Образование тесной связи между поверхностью клетки и подложкой и по существу структурная и функциональная стабильность монослоя в большей степени зависят от присутствия в среде гликопротеинов, способствующих прикреплению клеток. Общие принципы биотестирования. Широко используются иммобилизованные монослои клеток в системе биотестирования. Биотестирование - это оценка качественного и количественного содержания физиологически активных веществ (эффектора) по ответной реакции (тест-реакция) клеток-мишеней (тест-объект). Тест-объект (клетка, ткань, организм) - это жизнеспособные биологические структуры разных уровней организации. Тест-реакция характеризуется изменением какого-либо показателя под воздействием эффектора (стимулятора). Этот показатель получил название тест-параметра и определяется количественной характеристикой проявления тест-реакции.

Выбор клеток-мишеней, наиболее подходящих для биотеста на какое-либо определенное физиологически активное вещество, обуславливается как его природой исследуемого, так и стабильностью invitro и характеристиками ответа используемых клеток. В результате взаимодействия между стимулятором гормоном или медиатором и специфическими рецепторами соответствующих клетокмишений в нормальных условиях invivo происходят изменения в клеточном метаболизме: накапливаются метаболиты, расходуются вещества-предшественники, экскретируются в межклеточную среду специфические продукты метаболизма. Однако после извлечения тканей-мишеней из организма и ферментативного диспергирования изолированные клетки могут терять ряд специфических функциональных свойств, характерных для интактной ткани, и поэтому на препаратах иммобилизованных клеток не всегда возможно продемонстрировать полную последовательность функциональных ответов, обычно возникающих, например, при гормональной стимуляции исходной ткани. Тем не менее, во многих случаях при сохранении степени дифференцировки в условиях invitro, возможно выбрать несколько специфичных, ярко выраженных ответов клеток, на основе которых можно разработать метод биотестирования данного гормона. При изучении различных метаболических ответов, а также при выборе оптимального метода измерений биологической активности (биотестирования) данного физиологически активного вещества следует оценивать каждый из ответов по следующим четырем критерием:

- специфичность ответа;

- чувствительность ответа;

- точность определения в выбранном интервале доз гормона;

- воспроизводимость ответа при использовании клеточных препаратов;

В клинической и экспериментальной эндокринологии использование биотестов облегчает определение, например гормонов, как в здоровом, так и больном организме. В этой связи рассмотрим основные критерии и принципы, используемые при разработке и конструировании систем для биотестирования (в частности гормонов), а также дадим описание простейшего способа его реализации. Клетки, иммобилизованные на твердой подложке, представляют собой весьма удобный объект для выполнения различных операций биотестирования. Так, упрощаются процедуры введения контрольного и тестируемого стимуляторов. При этом клеточный монослой не нарушается, а «перенос» культуральной среды между инкубационными стадиями сведен до минимума. И, наконец, уникальная пространственная конфигурация клеток, организованных в монослои, способствует быстрому и одновременному действию стимулятора на все клетки культуры, благодаря чему достигается почти одинаковый объект всех клеток. К тому же если повторы культур структурно идентичны, то с помощью иммобилизованных клеток удается достичь высокой чувствительности биотестирования [9].

Заключение

биотестирование растительный полисахарид иммобилизация

Первое сообщение об иммобилизации растительных клеток в гранулированных полимерах появилось в 1979 г., и с тех пор количество подобных работ все растет. Считают, что с помощью иммобилизации можно частично или даже полностью преодолеть ряд основных затруднений, препятствующих крупномасштабному использованию растительных клеток.

Иммобилизованные растительные клетки могут быть использованы только для получения веществ, синтез которых не связан с ростом клеток, т. е. веществ, продуцируемых клетками в стационарной фазе. За счет более длительной стационарной фазы, наблюдаемой у иммобилизованных растительных клеток, можно решить ряд проблем, связанных с замедлением роста клеток (наработкой биомассы).

При культивировании растительных клеток происходит их агрегация, причем размеры агрегатов сильно варьируют, что затрудняет как перемешивание культуры, так и процессы массопереноса. Такого рода затруднения можно частично преодолеть с помощью иммобилизации, поскольку при этом агрегация не мешает, а, наоборот, помогает. Относительно гомогенный препарат гранул геля, содержащих клеточные агрегаты, получить нетрудно.

При длительном культивировании, сопровождаемом многократными пересевами, культуры растительных клеток часто претерпевают значительные изменения. Так, линии клеток, отобранные по признаку высокой продуктивности по определенному веществу, во многих случаях утрачивают эту способность. Данная проблема может быть до некоторой степени решена путем иммобилизации, поскольку у иммобилизованных клеток наблюдается удлинение стационарной фазы, а наработка продукта происходит, когда клетки находятся в неделящемся состоянии, т. е. в период наименее вероятного возникновения генетических изменений.

Проблему низкой механической устойчивости растительных клеток удается решить путем включения клеток в защитную полимерную матрицу, благодаря чему упрощается конструкция реактора. Еще одно преимущество иммобилизованных растительных клеток - это возможность индуцированной экскреции веществ, накопленных внутри клетки, с помощью периодической пермеабилизации, что может оказаться полезным для дальнейшей разработки технологии культивирования растительных тканей. При этом биомассу можно использовать многократно в течение достаточно длительного времени.

Результаты применения иммобилизованных растительных клеток, полученные к настоящему времени, весьма обнадеживают. По-видимому, иммобилизация представляет собой перспективный метод, с помощью которого удастся частично или полностью решить проблемы, связанные с использованием культур растительных тканей для получения сложных органических соединений [10].

Литература

1. Березин И.В., Иммобилизованные ферменты [Текст] / И.В. Березин, Н.Л. Клячко, А.В. Левашов // М.: Высш. шк.- 1987. - 159 с.

2. Бодей С.П., Иммобилизованные клетки и ферменты[Текст] / С.П. Бодей, П. Броделиус, И.М. Кабрал // М.: Мир. - 1988.- с. 81-85.

3. Бутенко Р.Г., Биология клеток высших растений invitro и биотехнологии на их основе / Р.Г. Бутенко // М.: ФБК-ПРЕСС.- 1999.- 144 с.

4. Степанов Э.Ф., Применение иммобилизованных ферментов /Э.Ф. Степанов // Итоги науки и техники. Сер. Биотехнология. М.: ВИНИТИ. - 1986.- с. 23-26.

5. Синицын А.П., Иммобилизованные клетки микроорганизмов / А.П. Синицын, Е.И. Райнина, В.И. Лозинский, С.Д. Спасов // М.: Изд-во Моск. ун-та. - 1994.- 138 с.6. Юрин В.М., Иммобилизованные клетки и ферменты: курс лекций / В.М. Юрин // Минск: БГУ. - 2006.- с. 152-155.

7. Валиханова Г.Ж., Биотехнология растений / Г.Ж. Валиханова // Алматы: Конжык. - 1996.- 44 с.

8. Корочинский А.В., Исследование возможности создания иммобилизованных структур на базе пробиотиков / А.В. Корочинский, В.В. Верниковский, Э.Ф. Степанова // Успехи современного естествознания.- 2010.- с. 34- 38.

9. Скрябин Г.К., Иммобилизованные клетки микроорганизмов Биотехнология / Г.К. Скрябин, К.А. Кощеенко // - М.: Наука.- 1984.- с. 89-91.

10. Тривен М., Иммобилизованные ферменты / М. Тривен // М.: Мир. -1983.- 121 с.

Размещено на Allbest.ru