Особенности приемов иммобилизации животных клеток. Выбор клеток-мишеней и тест-реакций для биотестов

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Министерство образования Республики Беларусь

Учреждение высшего образования

«Полесский государственный университет»

Факультет биотехнологический

Кафедра биотехнологии

Реферат

по дисциплине: Системная биология (Иммобилизованные клетки и ферменты)

Особенности приемов иммобилизации животных клеток. Выбор клеток-мишеней и тест-реакций для биотестов

Студент 4 курса, гр.18НПД-1

Биология (по направлениям)

Савчук Кирилл Александрович

Старший преподаватель

Водчиц Наталья Васильевна

Пинск 2021

Оглавление

Введение

1. Особенности приемов иммобилизации животных клеток

2. Выбор клеток-мишеней и тест-реакций для биотестов

Заключение

Список использованных источников

Введение

клетка млекопитающее изолированный

За последние годы были достигнуты большие успехи в разработке методов контролируемого культивирования in vitro клеток млекопитающих. Можно выделить несколько факторов, непосредственно способствовавших быстрому развитию этой области биотехнологии, а именно: получение непрерывных, полностью охарактеризованных клеточных линий, обнаружение специфических факторов роста и разработка аппаратуры, предназначенной для культивирования изолированных клеток в оптимальных условиях in vitro. В результате в настоящее время появилась возможность поддерживать в культуре в состоянии высокой функциональной дифференциации практически любой тип клеток млекопитающих. Быстрая эволюция методологии культивирования клеток оказала огромное влияние на научные исследования во многих областях биологии. В частности, методики выделения и изучения продуктов клеточного метаболизма, таких как гормоны, ферменты и антитела, постоянно упрощаются и совершенствуются [3, c. 33].

В зависимости от того, есть ли необходимость в прикреплении изолированных животных клеток к твердой подложке, или матрице, используют две различные методики культивирования. Большинство клеток твердых тканей, таких как ткани почки, печени и кожи, являются поверхностно-зависимыми, поэтому in vitro их можно культивировать только в виде тонких пластов или монослоев, непосредственно связанных с поверхностью подложки. Отдельные клетки, образующие такой монослой, контактируют как с соседними клетками, так и с самой подложкой; следовательно, их можно рассматривать как иммобилизованные. Однако в отличие от иммобилизации ферментов, антител и микробных клеток, для которой часто требуется предварительная химическая модификация, связывание между поверхностно-зависимыми клетками млекопитающих и твердой подложкой обычно проводят без специальной физической или химической обработки. Оно осуществляется благодаря исходной активности препарата изолированных клеток, совместимости клеток с твердой подложкой, а также наличию в сыворотке веществ, способствующих связыванию клеток или специально добавленных в среду [1, c. 11].

1. Особенности приемов иммобилизации животных клеток

Иммобилизованные поверхностно-активные клетки тканей животных играют все большую роль во многих областях биологии. Иммобилизованные клетки обычно сохраняют высокую степень функциональной дифференцировки, что облегчает изучение регуляции клеточного метаболизма гормонами и ростовыми факторами, а также способствует изучению механизмов модификации клеточных функций под действием различных эффекторов, например, лекарственных препаратов и токсинов. Так, иммобилизованные гепатоциты нашли широкое применение в исследованиях метаболизма чужеродных веществ в печени [1, c. 55].

Для некоторых видов клеток (например, клеток лимфобластоидного происхождения), обладающих особыми свойствами, разработана другая система культивирования. Такие клетки можно выращивать в условиях, сходных с условиями, в которых происходит пролиферация бактериальных клеток. Они растут и размножаются в суспензии без предварительной иммобилизации, что в значительной степени облегчает разработку промышленных способов их культивирования. При культивировании поверхностно-зависимых клеток требуется большая площадь поверхности носителя, а также адекватное и строго контролируемое поступление питательных веществ и кислорода, что вплоть до последнего времени сдерживало их широкомасштабное применение. Благодаря разработке методов культивирования на микроносителях, согласно которым клетки выращивают в виде монослоев, иммобилизованных на гранулах полистирола, стекла или декстрана, стало возможным культивирование поверхностно-зависимых клеток в суспензии. Однако, чтобы перейти к промышленному выращиванию клеток данным способом, необходимо еще решить ряд проблем, связанных с контролем условий культивирования [3, c. 66].

Большинство клеток твердых тканей, таких как ткани почек, печени, кожи, являются поверхностно-активными. В зависимости от подходов, используемых для прикрепления изолированных клеток к твердой подложке, или матрице, используют различные методики культивирования клеток тканей животных и человека. Из-за поверхностно-активных свойств in vitro их можно культивировать только в виде тонких пластов или монослоев, непосредственно связанных с поверхностью подложки. Отдельные клетки, образующие этот монослой, контактируют как с соседними, так и с самой подложкой, поэтому их можно рассматривать как иммобилизованные. Однако, в отличие от иммобилизованных растительных клеток и ферментов, связывание между поверхностно-активными клетками млекопитающих и твердой подложкой обычно проводят без специальной физической или химической обработки. Это связывание осуществляется благодаря исходной активности препарата изолированных клеток, совместимости клеток с твердой подложкой, а также наличию в сыворотке или специально добавленных в среду веществ, способствующих связыванию клеток [2, c. 39].

Иммобилизованные поверхностно-зависимые клетки играют все большую роль во многих областях биологии, в частности в клинических исследованиях. Применение таких препаратов в значительной мере способствовало формированию сегодняшних представлений о регуляции роста и дифференцировки клеток, изучению процесса старения клеток, а также установлению функциональных и морфологических различий между нормальными и опухолевыми клетками. Иммобилизованные клетки обычно сохраняют высокую степень функциональной дифференцировки, что облегчает изучение регуляции клеточного метаболизма гормонами и ростовыми факторами, а также исследование модификации клеточных функций под действием лекарственных препаратов и токсинов. Так, иммобилизованные гепатоциты нашли широкое применение в исследованиях метаболизма чужеродных веществ в печени. Однако большинство работ с ними носило приближенно-качественный характер, и только благодаря быстрому развитию в последнее время биотехнологии клеточных культур стало возможным использовать иммобилизованные монослои клеток в биотестах - высокочувствительных специфичных системах, предназначенных для количественного определения ряда биологически важных веществ. Так, в клинической и экспериментальной эндокринологии использование биотестов in vitro облегчает определение гормонов как в здоровом, так и в больном организме и стимулирует исследования биосинтеза и метаболизма гормонов, а также ответа клетки на их воздействие [5, c. 44].

Иммобилизация поверхностно-активных клеток на твердой подложке - процесс многоступенчатый, который обычно начинается с адсорбции на отрицательно заряженной поверхности подложки специальных веществ, способствующих прикреплению клеток. К таким веществам относятся гликопротеины, получаемые из сыворотки, либо из клеток определенных типов (диплоидные фибробласты, часто встречающихся в виде примесей в первичных культурах эпителиальных клеток) [3, c. 66].

Таким образом, иммобилизация клеток достигается благодаря первоначальному контакту и последующему распластыванию клеток на поверхности, в результате чего формируется монослой. Образование тесной связи между поверхностью клетки и подложкой и по существу структурная и функциональная стабильность монослоя в большей степени зависят от присутствия в среде гликопротеинов, способствующих прикреплению клеток [1, c. 37].

Иммобилизация на твердой подложке клеток, реагирующих па действие гормонов, создает идеальные условия для выполнения различных операций, проводимых при биотестировании. Так, значительно упрощаются процедуры введения и удаления тестируемого и контрольного стимуляторов. При этом клеточный монослой практически не нарушается, а перенос культуральной среды между инкубационными стадиями сведен до минимума. Экскретируемые клеткой вещества можно легко определять, отбирая через определенные промежутки времени культуральную среду п анализируя ее, в то время как внутриклеточные продукты метаболизма можно выделять и изучать после полного лизиса клеток и их обработки специальными реагентами. И наконец, уникальная пространственная конфигурация клеток, организованных в монослои, способствует быстрому и одновременному действию стимулятора на все клетки культуры, благодаря чему достигается почти одинаковый ответ всех клеток. К тому же если повторы культур структурно идентичны, то с помощью иммобилизованных клеток удается достичь высокой чувствительности биотестирования [1, c. 38].

2. Выбор клеток-мишеней и тест-реакций для биотестов

Широко используются иммобилизованные монослои клеток в системе биотестирования. Биотестирование - это оценка качественного и количественного содержания физиологически активных веществ (эффектора) по ответной реакции (тест-реакция) клеток-мишеней (тест-объект). Тест-объект (клетка, ткань, организм) - это жизнеспособные биологические структуры разных уровней организации [6, c. 22].

Тест-реакция характеризуется изменением какого-либо показателя под воздействием эффектора (стимулятора). Этот показатель получил название тест-параметра и определяется количественной характеристикой проявления тест-реакции [4, c. 36].

В клинической и экспериментальной эндокринологии использование биотестов облегчает определение, например, гормонов, как в здоровом, так и больном организме. В этой связи рассмотрим основные критерии и принципы, используемые при разработке и конструировании систем для биотестирования (в частности гормонов), а также дадим описание простейшего способа его реализации.

Клетки, иммобилизованные на твердой подложке, представляют собой весьма удобный объект для выполнения различных операций биотестирования. Так, упрощаются процедуры введения контрольного и тестируемого стимуляторов. При этом клеточный монослой не нарушается, а «перенос» культуральной среды между инкубационными стадиями сведен до минимума. Экскретируемые клеткой вещества можно легко определять, отбирая через определенные промежутки времени культуральную среду и анализируя ее, в то время как внутриклеточные продукты метаболизма можно выделять и изучать после полного лизиса клеток и их обработки специальными реагентами. И, наконец, уникальная пространственная конфигурация клеток, организованных в монослои, способствует быстрому и одновременному действию стимулятора на все клетки культуры, благодаря чему достигается почти одинаковый объект всех клеток. К тому же если повторы культур структурно идентичны, то с помощью иммобилизованных клеток удается достичь высокой чувствительности биотестирования [7, c. 56].

Выбор клеток-мишеней, наиболее подходящих для биотеста на какой-либо определенный гормон, обусловливается как природой исследуемого гормона, так и стабильностью in vitro и характеристиками ответа используемых клеток. Конечной целью разработки биотестов является получение доступных штаммов клеток для непрерывного культивирования или стабильных клеточных линий, у которых в течение длительного времени характеристики ответа и роста постоянны. Такие линии отвечают требованиям, предъявляемым к идеальным тканям-мишеням. Однако во многих случаях еще не удалось выделить культуры клеток для непрерывного культивирования, и разработанные к настоящему времени системы биотестирования основываются на использовании клеток, полученных непосредственно из человеческих или животных тканей путем ферментативного диспергирования. Как правило, эти клетки выделяют из соответствующих естественных тканей-мишеней, реагирующих на определенный гормон in vivo, и поэтому в идеале их нужно получать из тканей тех же видов животных, что и тестируемый гормон. В биотестах на человеческие клеточные стимуляторы, т. е. гормоны, выполнить это требование достаточно трудно, поскольку часто нет возможности получить подходящие образцы тканей для приготовления клеточных препаратов, особенно в случае непатологических тканей. В связи с этим для проведения какого-либо определенного биотеста нередко приходится использовать животные ткани. Однако это можно делать только после тщательного и систематического изучения и сравнения специфичности взаимодействия и характеристик ответов человеческих и животных клеток-мишеней на разные дозы стандартного препарата гормона [5, c. 15].

Изолированные клетки, полученные непосредственно из целых тканей ферментативным диспергированием, можно поддерживать в первичной культуре в иммобилизованном состоянии в течение 10-14 сут. При этом они способны сохранять высокую специфичность и чувствительность по отношению к соответствующим стимуляторам, т. е. свойства, предопределенные in vivo функциональными характеристиками исходной ткани. В биотестах на ряд гормонов появилась возможность использовать первичные культуры клеток, правда, их применение лимитируется ограниченной продолжительностью жизни клеток и присущей отдельным клеточным препаратам вариабельностью ответа. К сожалению, функционально дифференцированные клетки в первичных культурах теряют многие из функционально специфических маркеров, причем иногда этот процесс сопровождается интенсивным ростом быстро пролиферирующих типов «примесных» клеток, например, фибробластов. Однако период, в течение которого клетки-мишени способны отвечать на действие стимулятора, можно продлить, селективно уменьшив скорость пролиферации фибробластов. Этого добиваются, варьируя состав культуральной среды: уменьшая содержание сыворотки или полностью исключая ее из состава среды и подбирая определенные факторы роста и факторы, способствующие прикреплению клеток [4, c.17].

Давно установлено, что in vivo функциональные характеристики чувствительных к гормонам тканей зависят не только от возраста и пола, но также от состояния здоровья и условий питания животного. Поэтому отнюдь не удивительно, что первичные монослои, приготовленные из таких тканей, характеризуются вариабельностью ответа клеток на действие стандартного препарата тестируемого стимулятора, что обусловлено характеристиками ответа in vivo различных исходных тканей.

В сущности каждый отдельный препарат иммобилизованных клеток представляет собой ткань-мишень для биотеста, однако широкое применение таких препаратов ограничено тем, что необходимо часто готовить новые монослои из свежих тканей, поскольку жизнь изолированных клеток непродолжительна и способность первичных культур к ответу на действие стимулятора постепенно уменьшается. Их используют лишь в тех случаях, когда одинаковая способность клеток к ответу не обязательна. Как уже указывалось выше, применяя штаммы клеток для непрерывного культивирования или устойчивые клеточные линии, можно решить большинство проблем, связанных с разработкой и внедрением в практику стабильных и воспроизводимых биотестов, основанных на использовании первичных клеточных культур. По определению такие штаммы и линии способны к неограниченной пролиферации, а в случае функционально дифференцированных чувствительных к гормону клеток характеризуются стабильным ответом на действие определенного специфического стимулятора. Это позволяет преодолеть затруднения, связанные с ограниченной продолжительностью жизни первичных культур и уменьшением их способности к ответу на действие гормона [3, c. 39].

В результате взаимодействия между гормоном и специфичными к действию данного стимулятора рецепторами соответствующих клеток-мишеней в нормальных условиях in vivo происходят изменения в клеточном метаболизме: накапливаются метаболиты, расходуются вещества-предшественники, экскретируются в межклеточную среду специфические продукты метаболизма. Однако после извлечения тканей-мишеней из организма и ферментативного диспергирования изолированные клетки нередко теряют ряд специфических функциональных свойств, характерных для интактной ткани, и поэтому препараты иммобилизованных клеток не всегда способны продемонстрировать полную последовательность функциональных ответов, обычно возникающих при гормональной стимуляции исходной ткани. Тем не менее, во многих случаях степени дифференцировки, сохраняющейся в условиях in vitro, бывает достаточно, чтобы выбрать несколько специфичных, ярко выраженных ответов клеток, на основе которых можно разработать метод биотестирования данного гормона [4, c. 39].

При изучении различных метаболических ответов, а также при выборе оптимального метода измерений биологической активности (биотестирования) данного физиологически активного вещества следует оценивать каждый из ответов по следующим четырем критерием:

Специфичность ответа;

Чувствительность ответа;

Точность определения в выбранном интервале доз гормона;

Воспроизводимость ответа при использовании клеточных препаратов.

Более того, поскольку каждый метаболический ответ должен быть количественным, при объективной оценке ответов клетки на действие изучаемого гормона большое значение имеет простота и эффективность способов выделения каждого метаболита, а также характеристики методов его опреде-ленпя, таких как радиоиммунологический анализ или твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA). Прежде всего необходимо изучить специфичность выбранного ответа клеток-мишеней на действие данного стимулятора. Не исключено, что действие других гормонов, особенно гормонов, имеющих сходную с исследуемым структуру, может вызывать подобный ответ. Например, такие гликопротеиновые гормоны, как лютеинизирующий гормон (ЛГ), фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), тиреотропный гормон (ТТГ) и хорионический гонадотропний гормон человека (ХГТЧ) имеют идентичные субъединицы и, как и предполагалось, обладают перекрестной активностью при взаимодействии с ТТГ-рецепторами. Однако в большинстве, случаев уровень функциональной перекрестной активности или простой блокировки рецепторов структурно сходными, но биологически неактивными молекулами можно свести до минимума, тщательно подбирая клетки-мишени и условия их инкубации, при которых достигается высокий уровень специфичности функционального ответа на действие исследуемого стимулятора [4, c. 45].

Следующий фактор, который необходимо принимать во внимание при оценке различных ответов иммобилизованных клеток-мишеней - это чувствительность ответа. Практически это означает, что следует установить минимальную дозу гормона, которую измеряют с помощью данного метода регистрации ответа клеток. Чувствительность ответа определяют как наименьшее количество стимулятора, которое удается отличить от нулевой дозы при заданных условиях биотеста; его находят, построив для исследуемого гормона кривую доза - ответ.

Можно установить, как влияют на чувствительность биотеста изменения условий инкубации, таких как плотность клеток-мишеней в монослое, время действия стимулятора, ионная сила и pH среды, а также выбрать условия, в которых чувствительность проводимого биотеста максимальна. Точность измерения действия гормона, или показатель эффективности анализа, определяют по графикам зависимости точности измерения от дозы гормона. Эти графики можно использовать для сравнения эффективности биотеста в различных интервалах доз исследуемого гормона, т. е. на различных участках стандартной кривой, а также для изучения влияния различных условий инкубации или каких-либо веществ на эффективность биотеста в любом заданном интервале доз гормона. При оптимизации условий проведения биотеста следует стараться подобрать условия для наиболее точного определения действия гормона, по крайней мере, в интересующем, а желательно в максимально широком интервале доз. Подобный метод анализа кривой доза - ответ первоначально использовали для анализа кривых насыщения. Аналогичный, хотя и немного упрощенный, подход был затем применен для оптимизации и оценки методов биотестирования стимуляторов щитовидной железы, основанных на ответах in vitro срезов ткани щитовидной железы и клеточных мембран или первичной культуры клеток щитовидной железы в монослое [7, c. 21].

Заключение

Ограниченность использования иммобилизованных животных клеток в значительной мере была обусловлена трудностью их культивирования. За последние годы достигнуты большие успехи в разработке методов контролируемого культивирования in vitro млекопитающих. Можно выделить несколько факторов, которые способствовали быстрому развитию этой области биотехнологии, а именно: 1) получение непрерывных, полностью охарактеризованных клеточных линий; 2) обнаружение специфических факторов роста; 3) разработка аппаратуры для культивирования изолированных клеток в оптимальных условиях [5, c. 107].

Быстрое развитие методологии культивирования клеток оказало огромное влияние на научные исследования во многих областях биологии. Постоянно упрощаются и совершенствуются в частности, методики выделения и изучения продуктов клеточного метаболизма, таких как гормоны, ферменты и антитела. Иммобилизованные поверхностно-активные клетки тканей животных играют все большую роль во многих областях биологии. Иммобилизованные клетки обычно сохраняют высокую степень функциональной дифференцировки, что облегчает изучение регуляции клеточного метаболизма гормонами и ростовыми факторами, а также способствует изучению механизмов модификации клеточных функций под действием различных эффекторов, например, лекарственных препаратов и токсинов. Так, иммобилизованные гепатоциты нашли широкое применение в исследованиях метаболизма чужеродных веществ в печени [5, c. 108].

Список использованных источников

1. Юрин, В.М. Иммобилизованные клетки и ферменты: курс лекций / В.М. Юрин. - Минск: БГУ, 2006. - 138 с.

2. Жебентяев, А.И. Электрохимические методы анализа: учебное пособие / А.И. Жебентяев, А.К. Жерносек, И.Е. Талуть. - Витебск: ВГМУ, 2016. - 106 с.

3. Короткова, Е.И. Физико-химические методы исследования и анализа: учебное пособие / Е.И. Короткова, Т.М. Гиндуллина, Н.М. Дубова. - Томск: Изд-во Томского политехнического университета, 2011. - 168 с.

4. Кудряшов, А.П. Биосенсорные устройства: курс лекций / А.П. Кудряшов. - Мн: БГУ, 2003. - 113 с.

5. Семак, И.В. Инженерная энзимология: курс лекций / И.В. Семак. - Минск: БГУ, 2006. - 125 с.

6. Суслова, А.И. Основные понятия биохимии. Ферменты: учебное пособие / А.И. Суслова, В.И. Бахтаирова. - Иркутск: ИГМУ, 2014. - 41 с.

7. Никольский, Б.П. Ионоселективные электроды / Б.П. Никольский, Е.А. Матерова. - Л.: Издательство «Химия», 1980. - 240 с.

8. Баталова, Т.А. Ферментные электроды: учебное пособие / Т.А. Баталова. - Благовещенск: ГОУ ВПО «Амурская государственная медицинская академия», 2008. - 16 c.

Размещено на Allbest.ru