Гидролиз молочных белков протеазами штаммов молочнокислых бактерий и их гипоаллергенные свойства

Abstract

гидролиз белок молоко гипоаллергенный

HYDROLYSIS OF MILK PROTEINS BY PROTEASES OF LACTIC ACID BACTERIA STRAINS AND THEIR HYPOALLERGENIC PROPERTIES

The aim of this work was to optimize the hydrolys is of milk proteins by various protease so flacticacid bacteria (LAB) anden zymatic hydrolys is of milk proteins for the manifestation of their hypoallergenic properties. The amount of partial hydrolysates of whey proteins obtain edusing pepsin in a-LA is 100%, and using papainin P-LQ is 61.8 ± 4.8%; a-LA-100%. When using thermolysin, tryps in and alcalase in P-LQ and a-LA- 100%, respectively. In neutral and alkaline media, papain, trypsin, alcalase, and thermolys in efficiently cleaved p- LQ, and under optimized conditions, the seen zymes cleaved a-LA. Case in is considered the main source of protein for the production of hypoallergenic protein hydrolysates. Case in hydrolys is was carried out in 2 stages: protease hydrolys is with LAB strains and pepsin hydrolysis. As a result, during the fermentation of milk proteins, some LAB produce biologically active peptides that are relevant in the development and organoleptic, hypoallergenic properties of fermented milk products.

Keywords: lacticacidbacteria, milkproteinhydrolysis, proteasesof LAB, proteinhydrolysisoptimization, hypoallergenicmilkproteins

Аннотация

Целью данной работы была оптимизация гидролиза белков молока различными протеазами молочнокислых бактерий (МКБ) и ферментативный гидролиз белков молока для проявления их гипоаллергенных свойств. Количество частичных гидролизатов сывороточных белков полученных с применением пепсина в a-LA 100%, а с применением папаина в P-LQ 61,8±4,8%; a- LA-100%. При применении термолизин, трипсин и алкалазы в P-LQ и a- LA-100%, соответственно. В нейтральных и щелочных средах папаин, трипсин, алкалаза и термолизин эффективно расщеплял P-LQ, а в оптимизированных условиях эти ферменты расщепляли a- LA. Казеин считается основным источником белка для получения гипоаллергенных белковых гидролизатов. Гидролиз казеинов проводился в 2 этапах: гидролиз протеазами штаммами МКБ и гидролиз пепсином. В результате при ферментации молочных белков некоторыми МКБ образуются биологически активные пептиды, которые являются актуальными при разработке и органолептическими, гипоаллергенными свойствами ферментированных молочных продуктов.

Ключевые слова: молочнокислые бактерии, гидролиз молочных белков, протеазы МКБ, оптимизация гидролиза белков, гипоаллергенность молочных белков

Полноценная пища должна содержать белки, жиры, углеводы, витамины и должна быть разнообразной. Жиры и углеводы считаются источниками энергии и в определенных пределах они взаимозаменяемы. Их можно заменить белками, но белки ничем заменить нельза.

Белки входящие в состав молока по строению, физико-химическим свойствам и биологическим функциям разнообразны и в молоке в среднем содержится около 3,2% белка. Кроме белка в молоке содержится азотистые соединения небелкового характера: свободные аминокислоты, пептиды, мочевина, аммиак, мочевая кислота [1, с. 384]. Исследователи используя современные способы разделения и выделения белков установили, что в состав молока входит три группы белков. Первая основная группа эта казеин, содержащий 4 фракции: asi, as2, в и к казеин и их фрагменты. Вторая группа состоит из сывороточных белков в-лактоглобулин и a-лактоальбумина, иммуноглобулинов и альбуминов сыворотки крови [18, с. 105-112]. Кроме того, в эту группу входит лактоферрин и так называемые минорные белки. Третья группа эта белки оболочек жировых шариков. Они составляют всего 1 % всех белков молока. Изучение вторичной и третичной структур белков молока показало что, казеин в отличии от обычных глобулярных белков почти не содержит a-спиралей, а a-лактоальбумина, а в-лак- тоглобулин содержит большее количество спира- лизованных участков. Структура казеина обеспечивает хорошую расщепляемость казеина протеолитическими ферментами при переваривании в нативном состоянии без предварительной денатурации [7, с.217-246; 12, с. 587-592; 13, с. 3472-3478].

Продукты с низким аллергенным потенциалом и высокой питательной ценностью можно получить при ферментативном гидролизе белкового компонента молока [3, с. 35; 10, с. 331-334]. При потреблении гидролизованных белков достигается положительный физиологический эффект. Этот эффект по сравнению с нативными белками и аминокислотами достигается за счет лучшего усвоения короткоцепочечных пептидов в кишечном тракте [2, с 263-272; 10, с. 331-344].

Для пищевой и фармацевтической промышленности получение гипотензивных, антимикробных, иммуностимулирующих, антифунгальных и с другими эффектами биологически активных пептидов, представляет особый интерес [16, с. 31013106]. Протеолиз является важным биохимическим процессом при получении различных ферментированных продуктов. Протеолитическая система, участвующая в распаде казеина, обеспечивает клетки незаменимыми аминокислотами во время роста в молоке и также имеет промышленное значение за счет развитие органолептических свойств в ферментированных молочных продуктах [12, с. 587-592]. Протеолитическая система состоит из внеклеточной серин-протеиназы и транспортных систем, специфичных для ди-трипептидов и олигопептидов. Модель протеолитического пути состоит из: -(I) протеиназы имеющую широкую специфичность и способность высвобождать большое количество различных олигопептидов, -(II) транспорта олигопептидов являющихся основным путем поступления азота в клетку; -(III) всех пептидаз расположенных внутриклеточно. Для полного распада накопленных пептидов требуется действие всех пептидаз [14, с. 105-110; 15, с. 187-221; 17, с. 109115]. Изучение физиолого-биохимических и промышленно ценных свойств молочнокислых бактерий в частности Lb.helveticusA7, Lb.paracaseiA582, E. faecalis AN1, E. faecalis A121 и др. является актуальным направлением исследований прикладной биотехнологии, что связано с широким применением микроорганизмов в различных отраслях молочной промышленности, в частности сыроделии, при изготовлении йогуртов и заквасок [22, с. 969973]. Как известно бактерии нуждаются в экзогенном источнике пептидов и аминокислот, которые образуются из основного белка молока - путем гидролиза казеина. Казеин расщепляется бактериальной протеазой, которая связана с клеточной стенкой. Образовавшиеся олигопептиды поглощаются посредством специфического пептидного транспорта и в дальнейшем под действием различных внутриклеточных пептидаз расщепляются на короткоцепочечные пептиды и аминокислоты [13, с. 3472-3478; 20, с 1395-1410; 21, с. 139-155]. При ферментации казеина некоторыми МКБ образуются биологически активные пептиды. Эти пептиды являются актуальными при разработке продуктов функциональной направленности (таблица1). Так пептидный и аминокислотный профиль гидролизованного белка молока определяет биологически активные, органолептические и гипоаллергенные свойства ферментированных продуктов [6, с. 207228; 19, с. 16-20].

Материалы и методы

Оптимизация гидролиза белков молока различными протеазами. Расщепление белков-аллергенов осуществляют с использованием широкого спектра протеаз - ферментов класса гидролаз. Гидролазы катализируют гидролитический разрыв пептидных связей. Среди них известны ферменты микробного -алкалаза, нейтраза, термолизин, животного -пепсин, трипсин, химотрипсин и растительного происхождения -папаин, бромелаин, фицин [5, с. 159-203]. У этих ферментов различные механизмы каталитического действия. Изучение особенностей гидролиза белков молока специфическими протеазами, а также при совместном их воздействии направлено на установление оптимальных параметров. Этими параметрами являются получения частичного гидролизата с заданным пептидным составом, а также иммунохимическими свойствами как компонента продуктов специализированного питания [4, с. 209-223; 11, с. 4772-4778].

Белки коровьего молока представляют собой первый источник антигенов, встречающихся в больших количествах в младенчестве. Среди этих антигенов р-лактоглобулин (P-LG), a-лактальбумин (а- LA) и казеины являются основными аллергенами в коровьем молоке [12, с. 587-592].

Согласно исследованиям по оптимизации условий гидролиза основных сывороточных белков сериновыми (алкалаза и трипсин), аспарагиновой (пепсин) и цистеиновой (папаин) протеазами, металлопротеазами (термолизин) комплексными ферментными препаратами представлена сравнительная характеристика соответствующих частичных гидролизатов (таблица 1).

Таб: 1Количество частичных гидролизатов сывороточных белков полученных с применением различ-ных протеаз

Ферментативный гидролиз белков молока как путь их гипоаллергенности

Под действием различных технологических приемов может быть сниженааллергенность молочных продуктов. Для молекулярного изменения аллергенного потенциала белков, разрушается область антигенных эпитопов или формируются новые. В результате денатурации аллергена облегчается доступ к ранее скрытым эпитопам [5, с. 159203].

Один из путей снижения аллергенности молочных продуктов- это ферментативный гидролиз.

Механизм ферментативного катализа состоит из трех последовательных реакций. Во первых образуется комплекс Михаэлиса из белка (субстрата) и фермента. Вторая реакция это разрыв пептидной связи и высвобождения одного пептида. На последней стадии оставщийся пептид отделяется от фермента после нуклеофильной атаки, которую осуществляет молекула воды [5, с.159-203].

Казеин считают основным источником белка для получения гипоаллергенныхбелковыхгидролизатов. При протеолизе казеина основным недостатком является неприятный вкус и запах. Для изготовления гипоаллергенных молочных смесей также используют гидролизаты сывороточных белков. При введении в состав молочных смесей сывороточных белков необходимо уменьшить содержание ароматических аминокислот [8, с. 254-258].

Протеолиз казеинов проводили по методике, описанной Mouecoucou и соавт. [15, с. 187-221]. Гидролизат казеинов штаммом, а также нативный субстрат, подвергали дальнейшему гидролизу пепсином. Гидролиз пепсином проводили в течении 1 часа при рН 2.0 и температуре 37 °С.

Результаты и их обсуждение

Папаин, трипсин, алкалаза, термолизин эффективно расщепляет р-лактоглобулин в нейтральных и щелочных средах. В оптимизированных условиях эти ферменты расщепляют а-лактоальбумин.

При гидролизе Р-лактоглобулина и а-лактоаль-буминатермолизином предподчительным является рН 8. При 70⁰С была показана максимальная степень протеолиза. Была показана высокая эффективность гидролиза сывороточных белков при использовании трипсина и алкалазы. Для получения белкового компонента с низким антигенным потенциалом является выбор таких ферментов как термолизин, трипсин и алкалаза [3, с.35-39; 4, с. 209-233].

Гидролиз казеинов проводился в два этапа: гидролиз протеазами штаммами молочнокислых бактерий и гидролиз пепсином. Профиль протеолиза на этапах гидролиза протеазами штамма молочнокислых бактерий и гидролиза пепсином было показана на рис:1. 1 2 3 4

I-этап II- этап

Рис. 1 Протеолиз казеинов протеазами штамма молочнокислых бактерии и пепсином. Линии 1, 3, соответствуют контролям, линии 2, 4 гидролизатам казеинов штаммом молочнокислых бактерий. I этап - гидролиз штаммами молочнокислых бактерий, II этап - гидролиз пепсином.