Секретируемые щелочные рибонуклеазы микромицетов

Размещено на http://www.allbest.ru/

Секретируемые щелочные рибонуклеазы микромицетов

В.В. Ульянова, П.Ю. Ваньков, П.В. Зеленихин, Р. Шах Махмуд, А.И. Колпаков, О.Н. Ильинская, Казанский (Приволжский) федеральный университет

Аннотация

Многие рибонуклеазы (РНКазы) обладают избирательным цитотоксическим действием по отношению к опухолевым клеткам. Особый интерес представляют ферменты, филогенетически далекие от РНКаз млекопитающих, такие как РНКазы амфибий, грибов и бактерий, нечувствительные к действию ингибитора РНКаз млекопитающих. В настоящей работе проведен скрининг 15 изолятов микромицетов на наличие секретируемой щелочной рибонуклеазы. Наибольшей рибонуклеолитической активностью обладали 7 изолятов, самый активный из которых на основе филогенетического анализа был определен как Fusarium sporotrichioides.

Максимальный уровень активности (19000 ед./мл) в культуральной жидкости F. sporotrichioides был зарегистрирован на третьи сутки роста гриба. Полученные данные о термостабильности секретируемой РНКазы F. sporotrichioides, ее молекулярного веса (11 кДа) и биосинтезе на среде с низким содержанием фосфата позволяют полагать, что фермент относится к семейству РНКаз T1/N1/U2. Культуральная жидкость F. sporotrichioides, выращенного на дефицитной по фосфату среде, снижала жизнеспособность клеток аденокарциномы легкого человека А549 на 16.3%; при росте микромицета на среде с высоким содержанием фосфата токсичность культуральной жидкости не обнаружена. Таким образом, в цитотоксичность вносит вклад секретируемая РНКаза. Всестороннее изучение свойств новой РНКазы поможет установить механизмы ее цитотоксичности и обозначить области применения фермента.

Ключевые слова: микромицеты, Fusarium, рибонуклеаза, термостабильность, цитотоксичность, клетки аденокарциномы легких А549

Abstract

Secreted Alkaline Ribonucleases of Micromycetes

V.V. Ulyanova, P. Yu. Vankov, P.V. Zelenikhin, R. Shah Mahmud , A.I. Kolpakov , O.N. Ilinskaya Kazan Federal University

Many ribonucleases (RNases) have a selective cytotoxic effect on tumor cells. Of particular interest are enzymes that are phylogenetically distant from mammalian RNases, such as amphibian, fungal, and bacterial RNases, all insensitive to the action of the mammalian RNAse inhibitor. We screened 15 micromycete isolates for the presence of secreted alkaline ribonuclease. Seven isolates demonstrated the highest ribonucleolytic activity. Based on the phylogenetic analysis, the most active of them were identified as Fusarium sporotrichioides. The maximum level of activity (19000 units/mL) in the culture fluid of F. sporotrichioides was recorded on the third day of growth of the fungus.

The obtained data on the thermal stability of the secreted F. sporotrichioides RNase, its molecular weight (11 kDa), and biosynthesis on a medium with a low phosphate content suggest that the enzyme belongs to the RNase T1/N1/U2 family. The culture fluid of F. sporotrichioides grown on the phosphate-deficient medium reduced the viability of A549 human lung adenocarcinoma cells by 16.3%; if the micromycete was grown on a medium with a high phosphate content, no toxicity of the culture fluid was detected. Thus, the secreted RNAse contributes to cytotoxicity. Further description and comprehensive study of the properties of the new RNase will help to establish the mechanisms of its cytotoxicity and identify the areas of application of the enzyme.

Keywords: micromycetes, Fusarium, ribonuclease, thermostability, cytotoxicity, A549 lung adenocarcinoma cells

микромицет рибонуклеаза опухолевый цитотоксичность

Введение

Среди секретируемых микромицетами рибонуклеаз (РНКаз) обширного семейства N1/T1/U2 наиболее известны риботоксины аспергиллов - узкоспецифичные катионные ферменты c молекулярной массой (мМ) около 17 кД - рестриктоцин, а-сарцин, митогиллин, Aspfl и пр. [1]. Их мишенью является высоко консервативная последовательность 23-28S субъединицы рибосомной РНК, так называемая сарцинрициновая петля, в которой они расщепляют единственную фосфодиэфирную связь, нарушая процесс белкового синтеза. Область потенциального применения риботоксинов охватывает структурно-функциональные исследования рибосом, создание инсектицидных препаратов и противоопухолевых иммунотоксинов [2, 3]. Однако риботоксины, например Aspfl из Aspergillus fumigatus, известны как сильнейшие аллергены, вовлеченные в патогенез пульмонарного аспергиллеза [4].

Многие микромицеты не являются продуцентами риботоксинов, но выделяют в среду неспецифичные кислые РНКазы, как то Phya и Phyb (Мм около 20 кД), секретируемые Fusarium polycephalum [5], кислые РНКазы с Мм 24 кД и выше, секретируемые некоторыми другими грибами [6], или щелочные гуанил предпочитающие РНКазы, выделяемые Penicillium chrysogenum [7]. На сегодня сведений о таких РНКазах очень мало. В то же время щелочные низкомолекулярные РНКазы бацилл интенсивно изучаются как потенциальные противоопухолевые и противовирусные агенты [8-12], не обладающие иммуннотоксичностью [13]. В связи с этим в настоящей работе был проведен поиск микромицетов - продуцентов секретируемых щелочных низкомолекулярных РНКаз, обладающих цитотоксичностью в отношении опухолевых клеток, с целью дальнейшей характеристики последних как перспективных противоопухолевых агентов селективного действия.

Материалы и методы

Микромицеты и условия культивирования. В работе исследовали следующие штаммы микромицетов: 7 представителей рода Penicillium, 4 из которых были выделены из почв Республики Татарстан, 3 - с внутренней поверхности стен корпусов Военного госпиталя г. Казани; 4 представителя рода Aspergillus (клинические изоляты, выделенные при онхиомикозах); 2 гриба рода Fusarium из пораженных томатов; 1 представитель рода Trichoderma из разлагающейся древесины и 1 представитель рода Mucor, выделенный из испорченной сметаны.

Для поддержания культур использовали агаризованную среду Чапека следующего состава (г/л): сахароза - 30, NaNO₃ - 2, K₂HPO₄ - 1, MgSO₄ - 1, KCl - 0.5, FeSO₄ - 0.01. Культивирование проводили в термостате при температуре 28 °С.

Для последующего определения рибонуклеазной активности и цитотоксического эффекта культуральной жидкости микромицеты культивировали в шейкере-инкубаторе (28 °С, 180 об./мин). Использовали модифицированную среду Огата (г/л): глюкоза - 50, пептон (низкофосфатный или обычный) - 10, соевая мука - 5, MgSO₄-7H₂0 - 0.5, KNO₃ - 2, CaCl₂-2H₂O - 0.1. Стерильный раствор глюкозы добавляли отдельно после автоклавирования. Данная среда применяется для выращивания микроорганизмов с целью выделения внеклеточных РНКаз, поскольку не содержит неорганического фосфора, ингибирующего синтез этих ферментов [14]. Соотношение объема среды к объему колбы составляло 1:5. Засев среды проводили спорами в количестве 10⁵/мл среды.

Анализ рибонуклеолитической активности. Для первичного определения внеклеточных щелочных РНКаз были использованы РНК-содержащие агаризованные пластины, в лунки которых вносили культуральную жидкость микромицетов на 1-е, 2-е и 3-и сутки культивирования (рис. 1). На предметные стекла наносили раствор дрожжевой РНК (5 мг/мл) в 0.2 М трис -HCl буфере (pH 8) с добавлением 2% агара. После затвердевания геля в нем с помощью стеклянной трубочки делали лунки диаметром 4 мм. В лунки заливали 25 мкл культуральной жидкости микромицетов. Стекла помещали в чашки Петри, в которых для создания влажной атмосферы, препятствующей испарению культуральной жидкости, находились пропитанные водой ватные диски. Чашки инкубировали в термостате при 37 °С в течение 30 мин, затем стекла с гелем заливали 1 н HCl. При кислом значении pH высокополимерная РНК выпадает в осадок, а в местах, где произошел ее гидролиз, образуются зоны просветления, по диаметру которых судили об активности РНКаз.

Количественно РНКазную активность оценивали модифицированным методом Анфинсена [15]. За единицу активности принимали количество фермента, вызывающее увеличение оптической плотности на одну оптическую единицу при 260 нм в пересчете на 1 мл раствора фермента за 1 ч инкубации при 37 °С.

Определение таксономической принадлежности. Для определение таксономической принадлежности наиболее активных в отношении синтеза внеклеточных РНКаз микромицетов секвенировали последовательности внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS) методом Сэнгера с использованием стандартных праймеров ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3') и ITS4 (5'- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'). Полученные последовательности сравнивали с таковыми типовых штаммов. Референсные последовательности были получены из баз данных MycoBank и GenBank. Биоинформатический анализ производили в программе MEGA 7 (выравнивание осуществляли с помощью ClustalW, филогенетические деревья строили методом ближайшего соседа с поддержкой бутстрап в 1000 реплик).

Определение цитотоксичности культуральной жидкости микромицетов

Влияние культуральной жидкости микромицетов, проявивших наибольшую рибонуклеазную активность, на жизнеспособность клеток аденокарциномы легкого человека A549 осуществляли с помощью МТТ-теста, регистрирующего переход формазана в окрашенное производное под действием митохондриальных дегидрогеназ. Снижение активности последних свидетельствовало о токсическом действии исследуемых образцов. К клеткам, выращенным на среде HamF12K (Invitrogen, США) с добавлением 10%-ной телячьей сыворотки и пенициллина/стрептомицина (по 100 ед.) при 37 °С в атмосфере 5%-ного СО₂ до монослоя, добавляли культуральную жидкость микромицета в количестве 10% от объема среды. Через 48 ч дальнейшего роста клеток измеряли их жизнеспособность. Тест проводили в пяти повторностях, достоверность результатов оценивали с помощью дисперсионного анализа. Обработку результатов проводили в программах Rstudio и Excel.

Электрофорез в 15%-ном полиакриламидном геле проводили согласно стандартной методике. Оценку каталитической активности фермента проводили путем разделения белков в 15%-ном полиакриламидном геле по модифицированной методике Лэммли [16], в качестве субстрата в разделяющий гель добавляли дрожжевую РНК (Sigma-Aldrich, США) в концентрации 7 мг/мл. После электрофоретического разделения белков, гель отмывали по 10 мин в буфере I (10 nM Tрис-HCl, 20 % изопропанол, pH 7.5), буфере II (10 nM Tрис-HCl, pH 7.5) и буфере III (100 nM Tрис-HCl, pH 7.5). Окрашивание гелей проводили в 0.2%-ном растворе толуидинового синего.

Результаты

Обнаружено, что из 15 выделенных штаммов микромицетов 7 изолятов обладали внеклеточной щелочной РНКазой, которая регистрировалась в культуральной жидкости спустя 2-3 сут культивирования. Визуализация активности РНКаз на 3-и сутки культивирования представлена на рис. 1.

Рис. 1. Рибонуклеазная активность культуральной жидкости семи микромицетов на 3-и сутки культивирования: (1) - Fusarium sp. изолят 1; (2) - Pйnicillium sp. изолят 1; (3) - Mucor sp.; (4) - Pйnicillium sp. изолят 2; (5) - Pйnicillium sp. изолят 3; (6) - Fusarium sp. изолят 2, (7) - контрольная лунка с 25 мкл стерильной среды Огато; (8) - Pйnicillium sp. изолят 4; (9) - контрольная лунка с 25 мкл воды. Наиболее активный в отношении синтеза внеклеточной рибонуклеазы изолят отмечен кружком

Результаты количественного измерения активности секретируемых РНКаз соответствовали первичным данным луночного теста. Наибольший уровень РНКазы выявлен у грибов рода Fusarium, при этом самым активным оказался изолят № 2. Высокий уровень активности проявил также Mucor sp. Изолят Pйnicillium sp. 4 был выбракован из дальнейших исследований вследствие низкой активности секретируемой РНКазы (табл. 1).

Два микромицета с наибольшими значениями активности внеклеточных РНКаз были определены до вида с помощью филогенетического анализа на основе секвенирования области ITS (внутренний транскрибируемый спейсер), содержащей вариабельные последовательности ITS1 и ITS2, расположенные между последовательностями малой (SSU) и большой (LSU) субъединиц в рибосомном опероне и окружающие ген 5.8S рРНК. Сконструированное филогенетическое дерево подтвердило принадлежность штаммов родам Fusarium и Mucor: изолят Fusarium sp. 2 кластеризовался с Fusarium sporotrichioidйs, в то время как Mucor sp. с Mucor circinйlloidйs (рис. 2).

Табл. 1. Уровень рибонуклеолитической активности семи наиболее активных микромицетов - продуцентов внеклеточных щелочных РНКаз

Рис. 2. Таксономическая принадлежность двух микромицетов - Fusarium sp. 2 (а) и Mucor (б), проявивших наибольшую рибонуклеазную активность. Неукорененное филогенетическое дерево было построено на основе области ITS1-ITS4 методом ближайшего соседа. Числа в узлах дерева указывают значения бутстрап, полученные на основе 1000 реплик, масштаб - количество замен на нуклеотидную позицию

Поскольку для разработки перспективных биотехнологических и медицинских препаратов особенное значение имеет термостабильность РНКаз, был проверен уровень их активности после прогревания при температуре от 30 °C до 100 °C в течение 5 мин. Выявлено, что РНКаза Mucor circinelloides инактивировалась уже при 50 °C. РНКазы пенициллов различались по устойчивости к нагреванию, однако только один изолят № 3 обладал РНКазой, активность которой сохранялась при 55 °C. Дальнейшее повышение температуры вплоть до 100 °C выдерживали только РНКазы обоих изолятов Fusarium (табл. 2).

Табл. 2. Активность РНКаз культуральной жидкости микромицетов после прогревания

Увеличение времени культивирования наиболее активных продуцентов РНКаз на среде Огата с фосфатом показало, что F. sporotrichioides накапливает максимальное количество РНКазы на четвертые сутки культивирования; затем ее уровень снижается. Активность РНКазы M. circinelloides возрастала пропорционально времени культивирования (рис. 3). В целом уровень активности РНКаз на такой среде невысок и не превышает 800 ед./мл (рис. 3).

На основании полученных данных самым перспективным продуцентом оказался F. sporotrichioides, в связи с чем была предпринята попытка повысить уровень его секретируемой РНКазы за счет модификаций среды культивирования.

Известно, что основным фактором, влияющим на синтез микроорганизмами внеклеточных РНКаз, является количество доступного неорганического фосфора в среде [14]. Кроме того, в некоторых случаях положительное влияние на активность оказывает дефицит азота и присутствие Ca2+ [17]. Мы модифицировали среду Огата тремя способами: 1) заменили обычный пептон на низкофосфатный, 2) уменьшили концентрацию нитратов в 5 раз, 3) добавили 0.1 г/л CaCO ₃. Анализ РНКазной активности F. sporotrichioides при выращивании на указанных средах показал, что замена обычного пептона низкофосфатным позволила многократно увеличить экспрессию РНКазы. Уменьшение количества азота в среде также способствовало увеличению ее активности, но в значительно меньшей степени. Добавление карбоната кальция не оказало стимулирующего эффекта (рис. 4).

Рис. 3. Динамика уровня рибонуклеолитической активности в культуральной жидкости Fusarium sporotrichioides и Mucor circinelloides на среде Огата без модификаций

Рис. 4. Изменение активности РНКазы культуральной жидкости Fusarium sporotrichioides, выращенного на среде Огата с модификациями: Условные обозначения: 1 - среда Огата, 2 - среда Огата с добавлением 0.1 г/л CaCO₃, 3 - среда Огата с уменьшением количества нитратов в 5 раз, 4 - среда Огата с заменой обычного пептона на низкофосфатный

Культуральную жидкость F. sporotrichioides, выращенного в течение трех суток на среде Огата с заменой обычного пептона на низкофосфатный, проверили на возможность ингибирования жизнеспособности клеток аденокарциномы легких А549. Для обнаружения концентрационной зависимости культуральную жидкость разводили средой Огата в 5, 2.5, 1.7 и 1.25 раз, сохраняя общий объем добавленного образца на уровне 10% от объема ростовой среды клеток. Установлено, что добавление 10% среды Огата к клеткам А549 не изменяет их жизнеспособности, в то время как с увеличением концентрации культуральной жидкости F. sporotrichioides с 4% до 10% от объема среды жизнеспособность клеток снижалась, вплоть до 80% в присутствии неразбавленной культуральной жидкости (рис. 5).

? Жизнеспособность ¦ Содержание культуральной жидкости

Рис. 5 Варианты с добавлением культуральной жидкости Fusarium sporotrichoides

Рис. 5. Изменение жизнеспособности клеток А549 в зависимости от количества внесенной культуральной жидкости Fusarium sporotrichioides, выращенного в течение трех суток на низкофосфатной среде Огата. За 100% принят рост клеток с добавлением чистой среды Огата. Доля внесенной культуральной жидкости Fusarium sporotrichioides указана в процентах от общего объема ростовой среды клеток (черные столбики). Заштрихованный столбец - жизнеспособность клеток при добавлении 10%-ной культуральной жидкости микромицета, выращенного на среде Огата с фосфатом. Данные представляют собой средние значения ± стандартное отклонение; * p < 0.05 по сравнению с контрольным вариантом

Если же к клеткам А549 была добавлена в аналогичном объеме культуральная жидкость гриба, выращенного на высокофосфатной среде, то токсический эффект отсутствовал, что свидетельствует о вкладе секретируемой РНКазы в цитотоксичность.

Электрофорез культуральной жидкости F. sporotrichioides выявил значительное количество секретируемых белков в культуральной жидкости гриба, выращенного без фосфата, причем их количество возрастало на 7-е сутки культивирования. Однако анализ РНКазной активности методом зимографии показал, что максимальная активность фермента проявляется именно на 3-е сутки культивирования, как было установлено при определении динамики активности фермента в культуральной жидкости; причем РНКазная активность так высока, что гидролизует содержащуюся в геле РНК на всей «дорожке» пробега белка. Отметим, что в присутствии фосфата в среде F. sporotrichioides РНКазу не синтезирует. Молекулярная масса грибной РНКазы приблизительно равна 11-12 кДа, что сходно с таковой у биназы, секретируемой щелочной РНКазы Bacillus pumilus.

Обсуждение

По сравнению с РНКазами аспергиллов РНКазы фузариумов менее изучены. Данные о цитотоксичности фузариумных РНКаз в литературе отсутствуют. Цитотоксичность секретируемых грибных низкомолекулярных РНКаз семейства Т1 была установлена только при включении РНКазы гриба Aspergillus oryzae в специфический вектор оболочки гемоагглютинирующего японского вируса (hemagglutinating virus of Japan envelope vector, HVJ), что позволило конструкции приникнуть в опухолевую клетку [18].

В настоящей работе установлено, что в условиях дефицита фосфата F. sporotrichioides синтезирует внеклеточную РНКазу с молекулярной массой около 11 кДа. Ранее в чистом виде из фузариумов были выделены гуанилспеци- фичные РНКазы F. lateritium и F. moniliforme - представители семейства РНКаз Т1 [19]. РНКаза F1 F. moniliforme (10.98 кДа) имеет оптимум рН около 7, РНКаза F11

F. lateritium (10.85 кДа) - рН 7.6. РНКаза F1 F. moniliforme была кристаллизована [20]. По сравнению с РНКазой Т1 A. oryzae, у РНКазы F1 имеются различия во вторичной структуре, обусловленные разным расположением цистеиновых остатков, хотя активный центр ферментов консервативен [21].

Табл. 3. Свойства секретируемых рибонуклеаз, закодированных в геноме Fusarium sporotrichioides NRRL 3299

Биоинформатический анализ генома F. sporotrichioides выявил наличие кодирующих последовательностей четырех внеклеточных рибонуклеаз: F1, F12, РНКазы семейства Т2 и РНКазы trv. Сопоставив свойства этих РНКаз (табл. 3), мы пришли к выводу, что нами экспериментально подтверждено наличие секретируемой рибонуклеолитической активности РНКазы f1.

Индукция биосинтеза РНКазы f1 в условиях недостатка фосфата приводит к повышению ее уровня в 3 раза, с 800 до 19000 ед./мл культуральной жидкости (рис. 3, 4). Ранее мы показали, что в таких условиях уровень секретируемой РНКазы Bacillus licheniformis, также относящейся к семейству Т1 (бальназы), в культуральной жидкости изначально составлял 763 ед./мл [22], а уровень гомологичной РНКазы Bacillus altitudinis - 1250 ед./мл [23]. Следовательно, F. sporotrichioides является активным продуцентом секретируемой РНКазы и может быть эффективно использован для дальнейшего выделения и очистки этого фермента.

Не только высокая каталитическая активность, но и установленная устойчивость РНКазы f1 к высоким температурам (фермент сохраняет около 70% активности даже при кипячении в течение 5 мин (табл. 2)) позволяют предполагать, что новая РНКаза перспективна для дальнейшего изучения. Отсутствие термостабильности секретируемых РНКаз других исследованных микромицетов (табл. 2) снижает потенциал их практического применения. Особенно важно, что РНКаза f1 F. sporotrichioides вносит вклад в цитотоксичность по отношению к опухолевым клеткам аденокарциномы легких А549 (рис. 5), хотя классическая грибная РНКаза Т1 из A. oryzae при экзогенном внесении не угнетает рост раковых клеток [18].

Таким образом, на основании вышеописанных свойств РНКаза f1 F. sporotrichioides может претендовать на роль потенциального противоопухолевого агента наряду с известными бациллярными РНКазами семейства Т1 [8, 9, 10, 23]. Дальнейшее исследование свойств этого белка после выделения и очистки позволит установить спектр его действия в отношении различных линий раковых клеток и выявить его возможную избирательную цитотоксичность, необходимую для разработки новых противоопухолевых препаратов направленного действия.

Литература

1. Kao R., Davies J. Single amino acid substitutions affecting the specificity of the fungal ribotoxin mitogillin // FEBS Lett. - 2000. - V. 466, No 1. - P. 87-90

2. Olombrada M., Martmez-del-Pozo A., Medina P., Budia F., Gavilanes J.G., Garca-Ortega L. Fungal ribotoxins: Natural protein-based weapons against insects // Toxicon. - 2014. - V. 83. - P. 69-74.

3. Olombrada M., Lazaro-Gorines R., Lopez-Rodriguez J.C., Martmez-Del-Pozo A., Onaderra M., Maestro-Lopez M., Lacadena J., Gavilanes J.G., Garda-Ortega L. Fungal ribotoxins: A review of potential biotechnological applications // Toxins (Basel). - 2017. - V. 9, No 2. - Art. 71, P. 1-21.

4. Lacadena J., Alvarez-Garc^a E., Carreras-Sangra N., Herrero-Galan E., Alegre- Cebollada J., Garda-Ortega L., Onaderra M., Gavilanes J.G., Martmez del Pozo A.

Fungal ribotoxins: Molecular dissection of a family of natural killers // FEMS Microbiol. Rev. - 2007. - V. 31, No 2. - P. 212-237.

5. Inokuchi N., Koyama T., Sawada F., Irie M. Purification, some properties, and primary structure of base non-specific ribonucleases from Physarum polycephalum // J. Biochem. - 1993. - V. 113, No 4. - P. 425-432.

6. D'Alessio G., Riordan J.F. (eds.) Ribonucleases: Structures and Functions. - San Diego: Acad. Press, 1997. - 670 p.

7. Yakovlev G.I, Karpeisky M.Y., Bezborodova S.I., Beletskaja O.P., Sakharovsky V.G. Guanyl-specific ribonuclease from the fungus Penicillium chrysogenum strain 152 and its complex with guanosine 3'-phosphate studied by nuclear magnetic resonance // Eur. J. Biochem. - 1980. - V. 109, No 1. - P. 75-85.

8. Makarov A.A., Kolchinsky A., Ilinskaya O.N. Binase and other RNases as potential anticancer agents // BioEssays. - 2008. - V. 30, No 8. - P. 781-790.

9. Cabrera-Fuentes H.A., Aslam M., Saffarzadeh M., Kolpakov A., Zelenikhin P., Preiss- nerK.T., Ilinskaya O.N. Internalization of Bacillus intermedius ribonuclease (BINASE) induces human alveolar adenocarcinoma cell death // Toxicon. - 2013. - V. 69. - P. 219-226.

10. Ilinskaya O.N., Singh I., Dudkina E., Ulyanova V., Kayumov A., Barreto G. Direct inhibition of oncogenic KRAS by Bacillus pumilus ribonuclease (binase) // Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res. - 2016. - V. 1863, No 7, Pt. A. - P. 1559-1567.

11. Shah Mahmud R., Ilinskaya O.N. Antiviral activity of binase against the pandemic influenza A (H1N1) virus // Acta Nat. - 2013. - V. 5, No 4. - P. 44-51.

12. Shah Mahmud R., Mьller C., Romanova Y., Mostafa A., Ulyanova V., Pleschka S., Ilin- skaya O. Ribonuclease from Bacillus acts as an antiviral agent against negative- and positive-sense single stranded human respiratory RNA viruses // Biomed. Res. Int. - 2017. - V. 2017. - Art. 5279065, P. 1-11.

13. Ilinskaya O.N., Zelenikhin P.V., Petrushanko I.Yu., Mitkevich V.A., Prassolov V.S., Makarov A.A. Binase induces apoptosis of transformed myeloid cells and does not induce T-cell immune response // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2007. - V. 361, No 4. - P. 1000-1005.

14. Ежов ВА., Санцевич Н.И., Безбородова С.И. Влияние ортофосфата на биосинтез внеклеточных фосфогидролаз Penicillium brevicompactum // Микробиология. - 1976. - Т. 45, № 2. - P. 253-258.

15. Колпаков А.И., Ильинская О.Н. Оптимизация метода определения активности РНКазы с использованием высокополимерной РНК // Клиническая лабораторная диагностика. - 1999. - № 5. - С. 14-16.

16. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. - 1970. - V. 227. - P. 680-685.

17. Hasunuma K., Ishikowa T. Control of the production and partial characterization of re- pressible extracellular 5'-nucleotidase and alkaline phosphatase in Neurospora crassa // Biochim. Biophys. Acta. - Enzymol. - 1977. - V. 480, No 1. - P. 178-193.

18. Yuki S., Kondo Y., Kato F., Kato M., Matsuo N. Noncytotoxic ribonuclease, RNase T1, induces tumor cell death via hemagglutinating virus of Japan envelope vector // Eur. J. Biochem. - 2004. - V. 271, No 17. - P. 3567-3572.

19. Shliapnikov S.V., Bezborodova S.I., Chepurnova N.K., Dement'ev A.A. A new isoform of intracellular RNAase of Fl2 Fusarium lateritium. Characteristics and determining the primary structure // Dokl. Akad. Nauk SSSR. - 1989. - V. 30, No 6. - Р. 1496-1499.

20. Vassylyev D.G., Katayanagi K., Ishikawa K., Tsujimoto-Hirano M., Danno M., Pдhler A., Matsumoto O., Matsushima M., Yoshida H., Morikawa K. Crystal structures of ribonuclease F1 of Fusarium moniliforme in its free form and in complex with 2'GMP // J. Mol. Biol. - 1993. - V. 230, No 3. - P. 979-996.

21. Takeuchi H., Harada I., Yoshida H. Raman spectroscopic study on the structure of ribonuclease Fi and the binding mode of inhibitor // Biochim. Biophys. Acta. . - Protein Struct. Mol. Enzymol. - 1991. - V. 1078, No 3. - P. 307-312.

22. Sokurenko Y., Nadyrova A., Ulyanova V., Ilinskaya O. Extracellular ribonuclease from Bacillus licheniformis (Balifase), a new member of the N1/T1 RNase superfamily // Bi- oMed Res. Int. - 2016. - V. 2016. - Art. 4239375, P. 1-9.

23. Dudkina E., Ulyanova V., Shah Mahmud R., Khodzhaeva V., Dao L., Vershinina V., Kolpakov A., Ilinskaya O. Three-step procedure for preparation of pure Bacillus altitudi- nis ribonuclease // FEBS Open Bio. - 2016. - V. 6, No 1. - P. 24-32.

24. Makarov A.A. Ilinskaya O.N. Cytotoxic ribonucleases: Molecular weapons and their targets (review) // FEBS Lett. - 2003. - V. 540, No 1-3. - P. 15-20.

Размещено на Allbest.ru