Это предположение подтверждается и тем, что в обработанных трефланом корешках было выявлено значительное количество многоядерных интерфазных клеток -- 11-36 % (табл. 2).

2. Количество многоядерных клеток в меристеме корешков проростков ячменя сорта Визит разного возраста под влиянием обработки трефланом (%)

При визуальной оценке отмечено, что корешки проростков в опыте имели меньшую длину и бульшую толщину, чем в контроле (рис. 1, а и б). По данным анализа полутонких срезов корешков, обработанных гербицидом, примерно в 1 мм от кончика корешок утолщался (см. рис. 1, в), в области меристемы, прилежащей к утолщению, выявлялись крупные клетки с аномальными клеточными стенками, которые не делили клетку пополам, как это имеет место при нормальном митозе, а либо вдавались в цитоплазу в виде длинных (как правило, ветвящихся) тяжей, либо располагались в виде коротких (иногда ветвящихся) фрагментов, не контактирующих со стенкой материнской клетки. В ряде клеток стенка разделяла материнскую клетку на несколько фрагментов; некоторые из них имели очень небольшой размер и не содержали ядер. Непосредственный район утолщения корешка был образован крупными клетками неправильной формы, сильно вакуолизированными и содержащими мелкие базофильные гранулы. Сразу же за этой зоной корешок становился тоньше, а снаружи появлялись одиночные слущивающиеся клетки .

Более детальный морфологический анализ клеток меристемы корешков проростков ячменя был проведен на ультраструктурном уровне. При этом основные патологические изменения касались структуры клеточной стенки: не до конца сформировавшиеся стенки многоядерных клеток; образование выростов, имеющих сложную (подчас ветвящуюся) форму, в составе которых иногда встречались плазмодесмы, однако их число было невелико В клеточной стенке нами выявлены и нормальные плазмодесмы. Ядра клеток соответствовали фазам клеточного цикла G1 либо S (G2).

Ультраструктурный анализ показал, что в клетках из зоны утолщения корешка изменения затронули в основном форму, в то время как структура ядер и цитоплазмы не отличались от нормальных. Снаружи корешка, в зоне дифференциации, наблюдалось слущивание клеток, как это происходит в корневом чехлике. Среди слущенных клеток выявлены единичные, имеющие нормальную ультраструктуру. Это косвенно свидетельствует о том, что слущивание начиналось до гибели клеток. У подавляющего большинства клеток этой зоны ядра и цитоплазма были уплотнены, в последней содержались многочисленные митохондрии, амилопласты и диктиосомы, морфология которых была типичной для этих органелл растений ячменя; отмечено расширение цистерн шероховатого эндоплазматического ретикулума. Погибающие клетки имели сжатую цитоплазму, образованную полуразрушенными мембранными и немембранными структурами.

При анализе полутонких срезов в меристематической области регулярно выявлялись клетки, в которых стенка отделяла небольшие не содержащие ядер (возможно, нежизнеспособные) фрагменты цитоплазмы. При электронно-микроскопическом анализе мы обнаружили небольшие фрагменты клеток неправильной формы, которые имели уплотненную цитоплазму и вакуоль в центральной области. Кроме того, наблюдалось появление клеточных фрагментов, имеющих электронно-плотную неструктурированную цитоплазму, вероятно, погибшие клетки .

Представленные в настоящей работе данные свидетельствуют о том, что трефлан способен вызывать целый спектр нарушений в структуре и функционировании клеток растений. Основные изменения касались структуры многоядерных клеток, появление которых связано, по-видимому, с тем, что трифлуралин (действующее начало трефлана) эффективно деполимеризует микротрубочки цитоскелета растений (6). Хотя в препаратах, окрашенных ацетоорсеином, мы и наблюдали единичные многополюсные митозы, однако, принимая во внимание выявленный блок митоза на стадии метафазы, более вероятным представляется, что многоядерные клетки возникают в результате образования ядер из разбросанных по цитоплазме хромосом.

Наиболее заметной особенностью структуры многоядерных клеток является наличие несформировавшихся клеточных стенок между отдельными ядрами. При нормальном митозе формирование клеточной стенки у растений определяется микротрубочками фрагмопласта. Несформировавшиеся клеточные стенки в большинстве случаев располагались между микроядрами, что косвенно свидетельствует об образовании структур, наподобии фрагмопласта.

Наиболее выраженные патологические изменения были выявлены не в меристеме корешков проростков ячменя, а в зоне дифференциации. Фактически можно говорить о том, что дифференциация в присутствии трефлана блокируется, и индуцируется массовая программируемая клеточная гибель (ПКГ).

При суммировании оценок на основе использования световой и электронной микроскопии морфологические нарушения в клетках корешков проростков ячменя можно описать следующим образом: в начале зоны дифференциации располагаются крупные вакуолизированные клетки, имеющие неровные контуры, при этом форма клеток, возможно, связана с изменением строения клеточной стенки, которое в свою очередь обусловлено нарушением микротрубочек цитоскелета; в дальнейшем эти клетки, по-видимому, слущиваются, а затем погибают. Уплотнение цитоплазмы (при морфологически целостном тонопласте) и сжатие протопласта внутри клеточной стенки наблюдаются в клетках растений, претерпевающих ПКГ (7).

Однако насколько связан цитоскелет с индукцией ПКГ не ясно, хотя высказывались предположения о том, что разрушение микротрубочек может свидетельствовать о ПКГ у растений (8). Индукция ПКГ, возможно, опосредуется формирующимися вакуолями (9). Разрушение вакуолей приводит к быстрой деградации ядерной ДНК и гибели клетки (10). Принципиально важное значение имеет гибель клеточных фрагментов (по-видимому, не содержащих ядер), возникающих в результате обособления цитоплазмы аномально формирующимися клеточными стенками. При этом уплотнение цитоплазмы может свидетельствовать о том, что происходит процесс, сходный с ПКГ (в центральной зоне всех клеточных фрагментов располагались вакуоли).

Таким образом, трефлан в концентрации 1 мг/л вызывает широкий спектр повреждений клеток меристемы корешков проростков ячменя сорта Визит: блок митоза в метафазе, нарушение формирования клеточной стенки, индукция массовой программируемой клеточной гибели в зоне дифференциации.

Л И Т Е Р А Т У Р А

Л у н е в М.И., К р е т о в а Л.Г. Фитотоксическое последействие и побочное действие гербицидов. Защита растений, 1991, 7: 22-23.

К у р и н н ы й А.И. К проблеме предупреждения генетических последствий применения пестицидов: реальность и необходимость. Цит. и ген., 1983, 17: 16-21.

Y e m e t s A.I., B l u m e Ya.B. Resistance to herbicides with antimicrotubular activity: from natural mutants to transgenic plants. Russian J. Plant Physiol., 1999, 46: 789-796.

Д а р л и н г т о н С.Д., Л а К у р Л.Ф. Хромосомы. Методы работы. М, 1990.

П а у ш е в а З.П. Практикум по цитологии растений. М, 1974.

O v i d i E., G a m b e l l i n i G., T a d d e i A.R. e.a. Herbicides and the microtubular apparatus of Nicotiana tabacum pollen tube: immunofluorescence and immunogold labelling studies. Toxicol. in vitro, 2001, 15: 143-151.

V a n y u s h i n B.F., B a k e e v a L.E., Z a m y a t n i n a V.A. e.a. Apoptosis in plants: specific features of plant apoptotic cells and effect of various factors and agents. Int. Rev. Cytol., 2004, 233: 135-179.

B i n e t M.-N., H u m b e r t C., L e c o u r i e u x D. e.a. Disruption of microtubular cytoskeleton induced by cryptogein, an elicitor of hypersensitive response in tobacco cells. Plant Physiol., 2001, 125: 564-572.

K u r i y a m a H. Loss of tonoplast integrity programmed in tracheary element differentiation. Plant Physiol., 1999, 121: 763-774.

O b a r a K., K u r i y a m a H., F u k u d a H. Direct evidence of active and rapid nuclear degradation triggered by vacuole rupture during programmed cell death in Zinnia. Plant Physiol., 2001, 125: 615-626.

Размещено на Allbest.ru