ДНК-фингерпринтинг и анализ генетического разнообразия у растений

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

ДНК-фингерпринтинг и анализ генетического разнообразия у растений

Ю.В. Чесноков

На основе анализа последних достижений в области молекулярной биологии рассматриваются методические подходы для выявления полиморфизма и изучения генетического разнообразия у высших растений. Основное внимание уделено методам ДНК-фингерпринтинга и секвенирования ДНК. Представлена сравнительная оценка полиморфизма, выявляемого на уровне ДНК, изоферментов и запасных белков семян растений. Перечислены основные свойства, которыми должны обладать молекулярные маркеры, применяемые для анализа генетического разнообразия у растений. Обсуждаются перспективы использования молекулярных маркеров в генетике и селекции растений.

DNA-fingerprinting and analysis of genetic diversity in plants

Yu. V. Chesnokov

On the basis of an analysis of last achievements in molecular biology the author considers the methodical approaches to investigation of genetic diversity in high plants. The great attention was devoted to the DNA-fingerprinting and sequencing methods. The comparative estimation of polymorphism revealed on DNA level, isoenzymes and storage proteins in plants seeds was presented. The main properties of molecular markers used for the analysis of genetic diversity in plants were listed. The further trends for use of molecular markers in genetics and plant selection were discussed.

Введение

Анализ биологического разнообразия и исследование взаимоотношений между и/или внутри различных видов, популяций, так же как и между отдельными генотипами (особями), является одной из основных задач генетики и селекции растений. На протяжении последних десятилетий классическая стратегия оценки генетической изменчивости на основе методических подходов, используемых в сравнительной анатомии, морфологии, эмбриологии, физиологии, биохимии, генетике, и разработанных на их основе междисциплинарных подходов существенно пополнилась молекулярно-биологическими методами с целью выявления и анализа существующего на молекулярном уровне генетического разнообразия. Появление так называемых «молекулярных маркеров», которые применяют для выявления полиморфизма белков или нуклеиновых кислот (прежде всего ДНК), способствовало значительному прогрессу исследований, проводимых в рамках таких биологических дисциплин, как таксономия, филогения, экология, генетика, селекция и др.

Как известно, геномная ДНК является носителем наследственной информации, а изменения в макромолекулах ДНК могут играть существенную роль в наследственной изменчивости. Вот почему выявление изменений, происходящих в геноме на молекулярном уровне, является фундаментальной задачей не только для генетики, но и для любой из биологических дисциплин. В последние годы селекционные центры и компании стали также проявлять повышенный интерес к перестройкам в геноме, вплоть до изменений, происходящих на уровне одного единственного нуклеотида, что позволяет более точно подбирать родительские пары для скрещивания, исходя не только из морфологических признаков, но и из установленных на молекулярном уровне различий между аллелями.

В целом перестройки в геноме могут быть разделены на два условных класса -- «грубые» и «тонкие». К первым относятся изменение числа хромосом, хромосомные транслокации, а также частичные делеции/инсерции. Эти типы геномных перестроек могут быть выявлены довольно простыми методами, например с помощью световой микроскопии. Анализ же «тонких» перестроек (на молекулярном уровне) требует более чувствительных методов исследования (рис. 1). Однако совершенных методов, которые отвечали бы всем необходимым современным критериям и позволяли выявлять все возможные мутации и/или изменения, пока еще не создано.

Полиморфизм белков

Поиск молекулярных маркеров для решения практических задач генетики и селекции растений начался в 60-х годах прошлого столетия. Поскольку ДНК-технологии к тому времени еще отсутствовали, исследователи обратили внимание на белки как потенциальный источник генетического полиморфизма.

Рис. 1. Основные методы, применяемые для выявления и анализа полиморфизма и генетического разнообразия у растений на молекулярном уровне

Разработанные в 60-70-х годах ХХ века основы методических подходов выявления и анализа генетического разнообразия с помощью белков практически не изменились. Так, до сих пор для создания молекулярных маркеров, основанных на полиморфизме белков, наиболее часто используют электрофоретическое разделение последних и окрашивание их специфичными красителями. Для этих целей используют в основном запасные белки семян растений или определяют активность ферментов.

Результатом сотрудничества лаборатории молекулярной биологии и биохимии Всероссийского НИИ растениеводства им. Н.И. Вавилова и ISTA (International Seed Testing Association), начатого в 1972-1973 годах, явились методические подходы сортовой идентификации и селекционной регистрации по электрофоретической подвижности запасных белков семян, рекомендованные в 1980 году на 19-м конгрессе ISTA к использованию в семеноводстве и семенном контроле. В 1983 году эти рекомендации были приняты как стандартные для идентификации сортов пшеницы и ячменя (1). Запасные белки семян успешно применяли для молекулярного картирования гена Rrs14, контролирующего устойчивость к патогену Rhynchosporium secalis у растений ячменя, а также для построения генетических карт Pinus pinaster (2-5). Однако в связи с тем, что не все группы сцепления могут быть охвачены этими маркерами, метод не получил широкого распространения в мире и имеет, как правило, ограниченное для молекулярно-генетической идентификации растительных генотипов применение (например, в качестве дешевого и простого экспресс-анализа больших количеств семян торговых и семеноводческих партий либо при изучении исходного материала в семеноводстве и решении некоторых задач генетических ресурсов растений) (2, 6). Кроме того, в 70-80-х годах ХХ века появились новые методы молекулярного генотипирования организмов на основе ДНК-фингерпринтинга, которые оказались более адекватными в реализации поставленных генетико-селекционных задач и в большей степени соответствовали тем требованиям, которым должен отвечать молекулярный маркер, особенно если требуются высокоточные методы генетической (а не семеноводческой) идентификации генотипов (а не семян). Более подробно эти методы будут описаны ниже.

Электрофоретический анализ аллоферментов с 60-х годов прошлого столетия успешно применяли для исследования многих организмов -- от бактерий до целого ряда видов животных и растений (7). Подобные исследования проводили для решения различных по своим целям задач: изучение структуры популяций и полиплоидии, при гибридизации и анализе гибридов, в систематике и др. (8, 9). Аллоферментный анализ относительно прост в исполнении и позволяет определять генные локусы и группы сцепления.

В ряде случаев для анализа можно применять изоферменты. Например, в ряде работ на томате изоферменты использовали не только для анализа генетического разнообразия, но и при локализации экономически важных генов, мониторинге чистоты гибридных семян, выявлении интрогрессии генов и хромосом диких видов растений, пыльцевой селекции, а также скрининге гаплоидных генотипов, регенерированных в культуре клеток и тканей in vitro (10-16). Однако существует несколько ограничений, не позволяющих широко использовать изоферменты в качестве молекулярных маркеров (17). Для того чтобы молекулярный маркер стал таковым (особенно при составлении молекулярно-генетических карт), строго обязательно выполнение следующих условий: для наиболее полного маркирования каждой хромосомы (группы сцепления) в геноме должно быть достаточное количество маркерных локусов, которые располагались бы друг от друга на расстоянии не более чем 15-20 сМ; маркерный локус должен быть достаточно полиморфным с таким расчетом, чтобы любое проводимое скрещивание позволяло выявить расщепление по интересующему маркеру (18). Это как раз и есть те два основных предъявляемых молекулярным маркерам требования, которым изоферменты не могут отвечать. Кроме того, при использовании изоферментов в качестве маркеров чисто техническим ограничением является невозможность детекции ферментативной активности из-за отсутствия соответствующих красителей. Так, на сегодня в различных организмах идентифицировано более 3500 ферментов, а в исследованиях используют всего лишь около 100 красителей, причем менее половины из них пригодны для анализа изоферментов растений (19).

Следует подчеркнуть, что иногда термины «изоферменты» и «аллоферменты» взаимозаменяют, что некорректно. Изоферменты -- это ферменты, которые распознают и расщепляют одни и те же субстраты, но не обязательно являются продуктами одного и того же гена. Изоферменты могут быть активными на различных стадиях жизни организма или в разных клетках, тканях и/или органеллах. Аллоферменты -- это изоферменты, которые являются продуктами ортологичных генов и вследствие наличия неодинаковых аллелей кодирующих их генов различаются по одной или нескольким аминокислотам.

Однако как бы ни были хороши белковые маркеры, они имеют целый ряд ограничений. Прежде всего следует отметить, что белки не являются первичными носителями генетической информации, а представляют собой продукт транскрипции и трансляции кодирующих их генов. Вырожденность генетического кода также служит ограничительным фактором, так как значительно сужает спектр, а значит и возможности, полиморфизма, выявляемого на уровне аминокислотных последовательностей, по сравнению с полиморфизмом, который можно выявить на уровне первичных нуклеотидных последовательностей. Кроме того, как известно, не весь геном, а всего лишь его треть или даже меньше, кодирует и экспрессирует какие-либо белки. Все это приводит к тому, что изменения в некодирующей части генома или регуляторных районах генов (а это более 70 % генома) выпадают из поля зрения исследователей.

С появлением методологий, позволяющих оперировать с ДНК (основным носителем генетической информации на молекулярном уровне), внимание исследователей в значительной степени переключилось на нуклеиновые кислоты как источник информативного полиморфизма. Это связано с тем, что каждая отдельно взятая нуклеотидная последовательность уникальна по своей структуре и может быть использована для любых исследований генетического разнообразия и взаимодействия между организмами. В последние десятилетия были разработаны молекулярные методы исследования организмов с использованием ДНК-маркеров. Совокупность этих методов, получившая название ДНК-фингерпринтинг, довольно широко используют для решения разнообразных задач в различных областях биологии. Однако мы не будем рассматривать все известные на сегодня методы молекулярного маркирования, а остановимся лишь на идентификации генотипов с помощью некоторых методов ДНК-фингерпринтинга и технологиях ДНК-секвенирования.

ДНК-фингерпринтинги свойства молекулярных маркеров

фингерпринтинг генетическое разнообразие растение

Существующие на сегодня методические подходы для выявления тонких изменений нуклеотидных последовательностей могут быть разделены на три группы. Первая группа включает в себя методы, известные как сканирующие, которые используют для поиска неизвестных мутаций в заранее известных последовательностях. Во вторую группу входят диагностические методы для анализа мутаций и изменений в определенных позициях: секвенирование «горячих точек» мутаций; полиморфизм на уровне единичных нуклеотидов (ПЕН, SNP -- single nucleotide polymorphism). Поскольку ПЕН встречается гораздо чаще, чем мутации в «горячих точках» генома, то усилия сосредоточены в основном на определении изменений на уровне единичных нуклеотидов. Третья группа методов объединяет технологии секвенирования, которые могут быть использованы для выявления всех видов изменчивости, происходящих на молекулярном уровне, вне зависимости от того, идентифицированы и/или локализованы в геноме эти молекулярные изменения или нет. Совокупность методических подходов по идентификации генетического разнообразия получила название ДНК-фингерпринтинг (DNA fingerprinting). Этот термин был введен Jeffreys с соавт. при описании метода по одновременной идентификации множественных высоковариабельных локусов геномной ДНК посредством молекулярной гибридизации специфичных мультилокусных проб (или зондов) с электрофоретически разделенными рестрикционными фрагментами ДНК (20).

В последние годы появились некоторые модификации этого метода, к наиболее важной из которых можно отнести модификацию, основанную на применении полимеразной цепной реакции (ПЦР). Некоторые вновь появившиеся и модифицированные старые методические подходы по-прежнему называются ДНК-фингерпринтингом, но возникали и другие определения, такие как ДНК-типирование (DNA typing) или ДНК-профайлинг (DNA profiling), которые отражают специфичные методологические особенности того или иного подхода. Но так или иначе мультилокусный анализ с визуализацией полиморфизма ДНК, как и ДНК-фингерпринтинг, основывается либо на молекулярной гибридизации фрагментов ДНК, либо на изучении полиморфизма с помощью ПЦР. Согласно этому определению, в ДНК-фингерпринтинге предусматриваются две основные стратегии: I -- «классический» фингерпринтинг, основанный на ДНК-гибридизации, включающей гидролитическое расщепление геномной ДНК ферментами-эндонуклеазами, электрофоретическое разделение полученных ДНК-фрагментов по их молекулярной массе и размерам и, наконец, гибридизацию ДНК-фрагментов с комплементарной последовательностью ДНК, так называемой «пробой», или «зондом»; II -- ПЦР-анализ, заключающийся в амплификации специфичных ДНК-последовательностей in vitro с помощью специфичных или неспецифичных олигонуклеотидов (праймеров) и термостабильной ДНК-полимеразы с последующим электрофоретическим разделением амплифицированных фрагментов и определением молекулярного полиморфизма посредством различных методов окрашивания полученных ДНК-фрагментов. Обе стратегии претерпевали и претерпевают разнообразные технические модификации, изменения используемых праймеров и проб. Поэтому совершенно необходимо определить основные свойства, которыми должны обладать молекулярные маркеры: высокая полиморфность; кодоминантное наследование (что позволяло бы выявлять гомо- и гетерозиготное состояние у диплоидных организмов); относительно высокая частота встречаемости в геноме исследуемого генотипа; равномерное распределение по геному и селективно-нейтральное поведение (то есть не проявлять, например, плейотропного эффекта); доступность в применении (например, легко амплифицируемый и выделяемый или доступный для свободной купли/продажи маркер); простота и удобство проведения анализа; высокая воспроизводимость результатов; возможность обмениваться воспроизводимыми результатами между лабораториями. К сожалению, на сегодня нет ни одного молекулярного маркера, отвечающего всем перечисленным выше критериям. Однако среди существующих маркеров и подходов можно выбрать оптимальные для достижения поставленных перед исследователем задач. При этом можно добиться такой комбинации методов и маркеров, при которой их совместное использование позволит полностью «перекрыть» все образующиеся нестыковки.

Определение хромосомных и других крупных геномных перестроек (более 1^.10⁶ п.н.). Изменение числа хромосом или хромосомные транслокации могут быть сравнительно легко выявлены методами цитогенетики. Чувствительность цитогенетического анализа можно повысить использованием флуоресцентных методов анализа, таких как флуоресцентная гибридизация in situ (fluorescent in situ hybridization -- FISH). В FISH-методологии применяют флуоресцентномеченную ДНК-пробу, которая гибридизуется с определенным гомологичным ей районом хромосомы (21). Анализ фрагментов ДНК, основанный на гель-электрофоретическом разделении районов или частей хромосом, получивший название пульс-электрофорез, -- совершенно другая техника, которую можно применять для анализа и выявления как маленьких, так и больших делеций и инсерций (22). Анализ же небольших фрагментов ДНК (как правило, от нескольких десятков до нескольких тысяч пар нуклеотидов) обычно включает использование рестрикционных ферментов (экзонуклеаз и/или микросателлитов) для выявления различий между генетическими вариантами генотипов.

Рис. 2. Схема проведения ПДРФ-анализа на основе метода блот-гибридизации по Саузерну: А и Б -- генотипы, содержащие соответственно три и два сайта для расщепления гидролитическими эндонуклеазами; L -- фрагмент ДНК, гомологичный участку геномной ДНК генотипов. Черными стрелками обозначены места гидролитического расщепления геномной ДНК эндонуклеазами.

Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов

В конце 60-х годов прошлого столетия Linn с соавт. обнаружили, что рестрикционные эндонуклеазы расщепляют неметилированную ДНК (23). Вскоре был идентифицирован целый ряд специфичных рестрикционных эндонуклеаз, которые расщепляли ДНК в определенных для конкретных нуклеаз сайтах рестрикции (24). C тех пор рестрикционные эндонуклеазы, которые расщепляют специфичные последовательности ДНК, были выделены из нескольких сотен бактериальных штаммов. Эти специфичные эндонуклеазы узнают строго определенные последовательности нуклеиновых кислот размером от четырех до восьми пар оснований. Открытие рестрикционных эндонуклеаз и ДНК-лигаз дало импульс к развитию технологий клонирования ДНК, что в свою очередь во второй половине 70-х годов ХХ века послужило предпосылкой появления техники ДНК-секвенирования. Сайты, которые распознаются рестрикционными эндонуклеазами, могут быть полиморфными. Если один или более нуклеотидов в таком сайте изменены, то фермент распознает лищь неизмененные аллельные варианты, что выразится в появлении различных по молекулярной массе и размерам ДНК-фрагментов. На основе этой методологии, получившей название «полиморфизм длин рестрикционных фрагментов» (ПДРФ), можно анализировать сцепление генов (рис. 2) (25). Метод ПДРФ используют также для оценки ПЕН.

Существуют два различия между обычной ПДРФ-методологией и основанным на ПДРФ ДНК-фингерпринтингом. В ДНК-фингерприн-тинге (в том смысле, который мы употребляем) обычно используют мультилокусные пробы, дающие при блот-гибридизации по Саузерну комплекс множественных полос (или зон) на радиоавтографе, в то время как при проведении обыкновенного ПДРФ-анализа применяют, как правило, локус-специфичные пробы, позволяющие получать сравнительно легко скринируемые кодоминантные маркеры или зоны. ДНК-фингерпринтинг проводят в основном с неспецифичными для какого-либо биологического вида пробами, которые гомологичны распределенным по геному последовательностям, таким, например, как микросателлиты, в то время как пробы, использующиеся при проведении обычного ПДРФ-анализа, как правило, видоспецифичны. Таким образом, для того чтобы получить типичный ДНК-фингерпринт, используют пробу, гомологичную множественным геномным локусам ДНК. Каждый из этих локусов обычно характеризуется более или менее регулярно расположенными тандемными ДНК-мотивами, распределенными по геному в различном числе и порядке.

При ДНК-фингерпринтинге обычно используют две категории мультилокусных проб. В пробы первой категории входят клонированные фрагменты ДНК или олигонуклеотиды, комплементарные так называемым минисателлитам, то есть тандемным повторам с основным (или коровым) мотивом от 10 до 60 п.н. Пробы второй категории -- это олигонуклеотиды, комплементарные простым последовательностям, или микросателлитам, то есть тандемным повторам с очень короткими мотивами -- от 1 до 5 п.н. (20, 26, 27)

Мини- и микросателлиты

Повторяющиеся последовательности ДНК являются неотъемлемой частью эукариотических геномов и могут составлять до 90 % общей ДНК некоторых растительных геномов. Согласно характеру их организации, повторяющиеся последовательности ДНК могут быть классифицированы либо как распределенные по геному, либо как тандемно организованные. В первом случае повторяющиеся в ДНК мотивы обнаруживаются во множестве сайтах, которые практически равномерно распределены по всему геному. Во втором случае тандемные повторы содержат от двух до нескольких тысяч коровых мотивов, выстроенных в ряд по принципу «голова к хвосту». И хотя такой же принцип построения присущ и некоторым генам (например транскрипционным единицам гистонов и рибосомальной РНК), большинство тандемных повторов в геноме содержит некодирующую ДНК.

Тандемные повторы могут быть классифицированы как по длине и числу копий повторяющегося корового элемента, так и по локализации в геноме. Рассмотрим некоторые из них.

-- Сателлитная ДНК была описана около 35 лет назад после выделения в качестве сателлитной зоны из высокомолекулярной фракции тотальной ДНК с помощью градиентного ультрацентрифугирования (28). Сателлиты содержат очень большие нуклеотидные повторы (обычно от 1000 до 100000 копий) корового мотива и образуют в ДНК длинные (часто гетерохроматиновые) отрезки. Длина единицы повтора может варьировать от двух до нескольких тысяч пар нуклеотидов, но чаще всего обнаруживают единицу повтора размером от 100 до 300 п.н. Сателлиты обычно находятся всего лишь в нескольких локусах генома (29, 30).

-- Термин «минисателлиты» был предложен в 1985 году для описания группы тандемно организованных повторов (20). ДНК этого класса содержит короткие мотивы (от 10 до 60 п.н.), характеризующиеся низкой частотой повторяемости в конкретном локусе генома. Минисателлиты могут формировать «семейства» со схожими (или прилежащими) последовательностями во многих локусах генома (до нескольких десятков или сотен тысяч).

-- Тандемные повторы образуют также очень короткие (от 1 до 10 п.н.) мотивы, именуемые «простые последовательности» (26). Позднее эти последовательности стали называть «микросателлиты» (27). Микросателлиты характеризуются короткими геномными повторами со сравнительно низкой частотой коровой повторяемости и распределены во многих, в том числе генных, локусах генома. Необходимо отметить, что подавляющее число генных локусов содержит наиболее короткие повторы микросателлитов.

-- В 1987 году Nikamura с соавт. предложили термин «мидисателлиты» для ДНК, характеризующейся типичными свойствами сателлитов (длинный ряд повторов в одном генном локусе) и минисателлитов (варьирующее число тандемных повторов -- примерно по 40 п.н.) (31). Этим они дополнили классификацию различных по размерам тандемных повторов. Более полный обзор определений и номенклатуры тандемно организованных повторов ДНК можно найти у Tautz (32).

Во многих работах показано, что сложность оценки уровня полиморфизма, выявляемого блот-гибридизационным ДНК-фингерпринтингом, в котором в качестве проб используют минисателлиты и/или простые олигонуклеотидные повторы, зависит от исследуемого биологического вида (иногда популяции), мотива повторяющейся нуклеотидной последовательности, которая служит в качестве пробы, а в некоторых случаях от применяемых рестрикционных эндонуклеаз (33). Однако до сих пор неясно, какие свойства (если их несколько) существенны для фингерпринтинг-пробы при выявлении уровня полиморфизма. Оптимальную комбинацию «исследуемый биологический вид», «проба» и «рестрикционная эндонуклеаза» подбирают в каждом отдельном случае эмпирически. Это справедливо особенно для различных проб, комплементарных к простым последовательностям, где видо-, разновидность- или генотип-специфичный полиморфизм может быть обнаружен внутри одного и того же биологического рода (34).

Следует отметить, что генотип-специфичный полиморфизм наблюдается чаще у животных, чем у растений, что, возможно, обусловлено различными репродуктивными стратегиями. Если половое размножение и гетеросексуальность -- основное правило жизнеобеспечения подавляющего большинства животных, то самооплодотворение и вегетативное размножение -- наиболее характерный способ размножения растений. Более того, многие виды растений, исследованные с помощью ДНК-фингерпринтинга, являются доместицированными и поддерживаются человеком в таком состоянии на протяжении нескольких тысяч лет (например посредством инбридинга). Поэтому у растений таких видов наблюдается уменьшение генетического разнообразия, в том числе и на молекулярном уровне. Однако повышение степени инбридинга проявляется в снижении уровня изменчивости в мультилокусных ДНК-фингерпринтах не только у растений, но и у животных (35).

Суммируя вышесказанное, можно отметить, что уровень блот-гибридизационного полиморфизма, полученный с помощью специфичной пробы для определенного биологического вида, очевидно, зависит как минимум от трех факторов: стратегии репродуктивного воспроизводства (самоопыление, скрещивание, вегетативное размножение, инбридинг в изолированной или естественной популяции); молекулярных свойств (например частота мутаций) нуклеотидной последовательности ДНК, используемой в качестве «мишени» для фингерпринтинга; выбора рестрикционной эндонуклеазы при проведении блот-гибридизационного ДНК-фингерпринтинга (в меньшей степени).

Стратегия методов ПЦР

ПЦР-методология, основанная на ферментативной амплификации ДНК in vitro, была предложена в середине 80-х годов прошлого столетия (36). Использование в качестве матрицы небольшого количества исходной ДНК (десятки нанограммов) позволяет амплифицировать миллионы копий одного или нескольких ДНК-фрагментов (рис. 3). Амплифицированные фрагменты обычно разделяют электрофорезом в агарозном или полиакриламидном геле и затем окрашивают специальным красителем или подвергают радиоавтографии. Метод ПЦР характеризуется высокой скоростью, селективностью и достаточно высокой чувствительностью; его применение в различных вариантах и для самых разных целей открыло новые возможности для решения разнообразных задач молекулярной биологии, генетики и селекции.

После появления ПЦР-анализа необходимость в рестрикционных эндонуклеазах отпала, так как олигонуклеотидные праймеры, фланкирующие микросателлитную последовательность, позволяют проводить локус-специфичную ПЦР-амплификацию микросателлитных последовательностей. В результате электрофоретического разделения ПЦР-продуктов, различающихся по числу повторяющихся единиц, появилась возможность определять полиморфизм у конкретных генотипов или внутри популяции. Преимущество этого метода по сравнению с ПДРФ при исследовании групп сцепления и картировании генов заключается в том, что микросателлиты весьма широко распространены по геному и ПЦР-анализ позволяет более адекватно выявлять степень генетической изменчивости.

Рис. 3. Схема проведения полимеразной цепной реакции: I-III -- циклы; 1, 2 -- праймеры.

Одним из основных достоинств ПЦР-методологии является то, что в зависимости от целей исследования можно выбрать любую разновидность праймеров. С одной стороны, специфичную последовательность ДНК можно амплифицировать с помощью пары специфичных праймеров, последовательность которых выбирают на основе и в соответствии с известной последовательностью, которую предстоит амплифицировать. Такая стратегия наиболее приемлема для выделения генов или анализа трансгенов у модифицированных организмов. Специфичные праймеры, уникальные по своей последовательности, фланкирующие (прилежащие) простые тандемные повторы (микросателлиты) все в большей степени используют для геномного картирования и в популяционной генетике. С другой стороны, неизвестная последовательность ДНК может быть амплифицирована с помощью случайных, неспецифичных (или произвольных) праймеров. Несмотря на произвольный выбор нуклеотидной последовательности пары праймеров, определенные фрагменты матричной ДНК обычно амплифицируются в соответствующих условиях проведения ПЦР. Эту стратегию применяют при геномном картировании и ДНК-фингерпринтинге.

Между этими двумя крайними случаями выбора ПЦР-праймеров существует несколько возможностей создания, выбора и использования полуспецифичных праймеров. Например, в некоторых стратегиях применяют праймеры, комплементарные известным повторяющимся последовательностям ДНК. Эти последовательности включают разбросанные по геному ДНК-повторы, такие как гены, кодирующие 5S РНК (37) и тРНК (38, 39), участки интрон-экзонного соединения (40), гены белка «цинкового пальца» (41) и ряд других. Использование последовательностей коротких тандемных повторов в качестве праймеров также подпадает под эту категорию ПЦР. И поскольку специфичные, полуспецифичные и неспецифичные праймеры могут применяться в любых комбинациях, их потенциал и возможности ПЦР-анализа становятся практически безграничными.

Ввиду того, что в настоящей статье мы не останавливаемся на методологиях анализа генотипов (видов, популяций), которые требуют молекулярного клонирования или точной информации о геномной ДНК-последовательности, не будет рассматриваться и методология ПЦР ДНК-фингерпринтинга, основанная на специфичных и полуспецифичных праймерах, за исключением тех методов, где в качестве праймеров используют простые тандемные повторы или микросателлиты, а также методов амплификации микросателлитных последовательностей с помощью специфичных фланкирующих праймеров. Для ознакомления же с методологией ПЦР-амплификации с (полу)специфичными праймерами следует обратиться к практическим руководствам и пособиям, включая обзорные статьи, где эти подходы и методики описаны достаточно подробно и последовательно (42-46).

Методы ПЦР ДНК-фингерпринтинга

Олигонуклеотиды, содержащие простые повторяющиеся последовательности или коровую последовательность минисателлитных повторов, традиционно использовали при проведении общепринятого ДНК-фингерпринтинга, основанного на блот-гибридизации по Саузерну. Применение олигонуклеотидов в качестве ПЦР-праймеров для проведения ДНК-фингерпринтинга впервые было описано Lieckfeldt с соавт. и Meyer с соавт. (47, 48). В этих работах коровая последовательность фага дикого типа М13 (GAGGTGGUGGUTCT) так же, как и простые повторяющиеся последовательности (CA)₈; (CT)₈; (CAC)₅; (GTG)₅; (GACA)₄ и (GATA)₄, были использованы в качестве ПЦР-праймеров для идентификации различных изолятов Cryptococcus neoformans -- патогенного грибка человека. Этот подход, основанный на относительно простой идее использования олигонуклеотидов в качестве праймеров, позволил выявить своеобразные многофрагментарные профили, полученные в результате ПЦР-амплификации, для различных видов грибов и растений (48-50). Однако, несмотря на выявленный полиморфизм между исследуемыми видами, внутривидовой полиморфизм обнаружен не был. Относительно недавно Zietkiewicz с соавт., используя в качестве праймера 5- или 3-специфичную простую повторяющуюся последовательность (олигонуклеотид), описали новую модификацию этого метода (51). В использованных ими олигонуклеотидных праймерах повторы (TG)_n или (CA)_n следовали за двумя-четырьмя случайно выбранными нуклеотидами, которые осуществляли сайт-специфичное прикрепление праймеров. При электрофоретическом разделении радиоактивно меченных ПЦР-продуктов, амплифицированных у различных представителей эукариотических таксонов, авторам удалось выявить не только межвидовой, но и внутривидовой полиморфизм.

Рис. 4. Схема проведения ПДСАФ-анализа (random amplified polymorphic DNA-RAPD): А, Б и В -- генотипы; -- амплификация со случайными неспецифичными праймерами.

Следовательно, как и в случае ПДРФ, проведение ПЦР ДНК-фингерпринтинга с помощью праймеров, созданных на основе простых повторяющихся повторов, или микросателлитов, представляет собой удобный метод идентификации генотипа и оценки генетического разнообразия у растений на различных уровнях ранжирования: от разнообразных биологических видов до отдельно взятых особей. Поскольку молекулярная основа вышеупомянутого полиморфизма до конца еще не исследована, то использование олигонуклеотидов в качестве праймеров для ПЦР взамен блот-гибридизационных проб при проведении ПДРФ-анализа является одним из важнейших преимуществ, значительно дополняющих и расширяющих методологическую базу. ПЦР ДНК-фингерпринтинг совмещает в себе высокую степень оценки ДНК-полиморфизма, выявляемого обычными мультилокусными пробами при проведении блот-гибридизационного анализа, с технической простотой и скоростью метода ПЦР-идентификации, позволяющего проводить крупномасштабные эксперименты и анализы.

В свое время было предложено несколько названий для ПЦР, в которых участвовали неспецифичные случайные праймеры. При этом каждая из таких ПЦР-методик имела свой собственный протокол проведения анализа (52, 53). На сегодняшний день можно выделить три основные разновидности ПЦР-анализа: со случайными (неспецифичными) праймерами (СП-ПЦР) (38) или полиморфизм длин случайным образом амплифицированных фрагментов ДНК (ПДСАФ -- random amplified polymorphic DNA-RAPD) (рис. 4) (54, 55); ДНК-амплифицированный фингерпринтинг (ДАФ) (52) (не путать с ПЦР ДНК-фингерпринтингом); полиморфизм длин амплифицированных фрагментов (ПАФ -- amplified fragment length polimorphism -- AFLP). Некоторые исследователи выделяют еще и другие разновидности ПЦР-амплификации, однако, на наш взгляд, это не совсем оправдано. Например, в методологию, носящую название МААР (multiple arbitrary amplicon profiling), входят элементы всех трех вышеназванных методических подходов или их разновидностей. Кроме того, комбинация и совмещение этапов и элементов различных методик и методологий также не могут быть признаны в качестве абсолютно нового методологического подхода.

Теоретические основы ПЦР ДНК-фингерпринтинга

Для получения амплифицированного продукта только лишь с одним случайным (неспецифичным) праймером ДНК должна содержать две идентичные (или высоко гомологичные) последовательности, располагающиеся на разных нитях на небольшом расстоянии и в противоположном направлении друг от друга (не более нескольких тысяч пар оснований), так как короткие фрагменты легче и эффективнее амплифицируются, чем длинные. Число фрагментов, которое можно теоретически ожидать при амплификации с одним праймером, имеющим 100 % гомологию к сайтам на подлежащей амплификации ДНК, можно рассчитать, исходя из длины праймера и сложности матричного (амплифицируемого) генома. Допуская, что гомологичные праймерам сайты присутствуют в геноме в равных соотношениях, Williams с соавт. предложили уравнение для определения возможного числа амплифицированных ПЦР-фрагментов: b = (2000^.4^-2n)^.C, где b -- ожидаемое число фрагментов на один праймер, n -- длина праймера (п.н.), С -- размер генома в пересчете на гаплоидный геном (п.н.). Например, для растений кукурузы (размер генома 6^.10⁶ тыс. п.н.) при использовании праймера из 10 нуклеотидов и наличии 100 % гомологии между праймером и матричной ДНК b = 10,9, для дрожжей (размер генома 1,6^.10⁴ тыс. п.н.) при тех же условиях b = 0,029. Однако, как следует из результатов многочисленных исследований, число амплифицированных фрагментов на один праймер практически не зависит от сложности и размера генома, а также уровня плоидности растений. Относительная независимость числа фрагментов может быть объяснена несоответствием праймеров геномной нуклеотидной последовательности и их конкуренцией за место (сайт) связывания в геноме.

Достоверность оценки полиморфизма, выявляемого ПЦР ДНК-фингерпринтингом (например при ПДСАФ-анализе), теоретически может быть обусловлена рядом событий: вставка большого (несколько десятков тысяч пар нуклеотидов) фрагмента ДНК между двумя сайтами прикрепления праймеров может послужить причиной амплификации (или, наоборот, невозможности амплификации) фрагмента большего размера, чем того следовало бы ожидать, и как следствие «выпадение» такого фрагмента при электрофоретическом анализе; делеция (всего или части) одного из двух или обоих сайтов прикрепления праймеров в геномной ДНК также сопровождается потерей полиморфного ПЦР-фрагмента; замена нуклеотида может нарушить гомологию между праймером и сайтом его прикрепления, что приведет к появлению/отсутствию полиморфизма и/или изменению размера амплифицированного фрагмента; вставка или делеция небольшого (до нескольких сотен пар нуклеотидов) фрагмента ДНК, расположенного между сайтами прикрепления праймеров, что может сопровождаться изменением размера амплифицированного фрагмента; на практике последнее наблюдается нечасто. Как правило, специфичный ПЦР-фрагмент, выявляемый ПДСАФ-анализом, либо присутствует (АА, Аа), либо отсутствует (аа). Такое распределение аллелей типично для доминантного маркера. В случае кодоминантных маркеров гетерозиготное состояние (АА) может отличаться от обоих гомозиготных состояний (АА и АА). Williams с соавт. показали, что не менее 95 % ПДСАФ-фрагментов ведут себя как доминантные маркеры и не более 5 % проявляют кодоминантное наследование, то есть выявляются как два аллеля различного размера (54).

Во многих исследованиях доминантный характер проявления ПДСАФ-фрагментов является неблагоприятным фактором. Например, в популяционной генетике нельзя определить частоту аллелей, так как гомозигота (АА) не отличается от гетерогизоты (Аа). То же самое можно сказать и в отношении молекулярного картирования расщепляющихся популяций F₂. При исследовании гаплоидных организмов доминантный характер ПДСАФ-фрагментов не является проблемой.

Методы секвенирования ДНК

Среди огромного числа методов анализа генетического разнообразия на молекулярном уровне секвенирование ДНК наиболее аккуратный способ определения точечных и небольших мутаций или позиций (замены) нуклеотидов. Секвенирование ДНК считается основным критерием идентификации или выявления делеций, поэтому мутации, обнаруженные другими методами, следует проверять ДНК-секвенированием. Среди методов ДНК-секвенирования прежде всего следует упомянуть общепринятый, ставший уже классическим, метод секвенирования по Sanger, который с успехом применяется уже на протяжении почти 30 лет. В то же время новые методические подходы ДНК-секвенирования с использованием гибридизации, масс-спектрометрии и пиросеквенирования, появившиеся сравнительно недавно, находят все большее применение в оценке генетической изменчивости между генотипами на уровне первичной нуклеотидной последовательности ДНК.

Биохимические методы ДНК-секвенирования. В 1977 году практически одновременно были описаны два метода секвенирования ДНК: в основу первого метода положена оценка биохимической деградации цепочки нуклеотидов ДНК, однако для получения набора секвенированных фрагментов ДНК авторы использовали ядовитые химикаты (56); во втором методе применяли ферментативное ингибирование синтеза цепочки нуклеотидной последовательности ДНК (57). В обоих случаях получали одноцепочечные нити ДНК, которые затем разделяли в полиакриламидном геле (ПААГ) по размерам. Благодаря своим характеристикам второй метод секвенирования (по Sanger) получил наибольшее распространение, и все усилия в дальнейшем были направлены на развитие и оптимизацию стратегии секвенирования именно по этому методу. При этом электрофоретическое разделение олигонуклеотидных цепочек в ПААГ было совмещено с выявлением флуоресцентномеченных фрагментов нуклеиновых кислот после лазерного облучения. Существуют два основных способа автоматического ДНК-секвенирования по Sanger, различающиеся по числу красителей. При использовании одного красителя фрагменты ДНК метят в четырех различных реакциях (ddA, ddC, ddG и ddT), а разделение в ПААГ проводят по четырем различным дорожкам на приборе A.L.F. DNA sequencer^TM («Amerscham Biosciences», Piscataway, NJ, USA) (58). В случае применения четырех разных красителей (по одному для каждого нуклеотида) используют прибор ABI Prism^® 377XL («Applied Biosystems», Foster City, CA, USA); разделение фрагментов ДНК в ПААГ осуществляется на одной дорожке, благодаря чему достигается высокая разрешающая способность и повышается производительность прибора (59). Разработка автоматических методов секвенирования ДНК позволила количественно определять мутации и оценивать полиморфизм на молекулярном уровне с точностью до одного нуклеотида. Однако в том случае, когда соотношение в образце мутантной последовательности ДНК и последовательности дикого типа составляет 1:1, при использовании метода четырех красителей возможно неверное считывание информации и увеличение интенсивности регистрирующего сигнала для фрагмента мутантной ДНК примерно в 2 раза.

Масс-спектрометрия. Хотя методы, основанные на разделении ДНК-последовательностей в ПААГ, являются достаточно чувствительными, они не вполне подходят для выявления ПЕН из-за относительно низкой производительности, высокой себестоимости и получения большей информации, чем требуется. Альтернативой гель-электрофоретическому анализу фрагментов ДНК при секвенировании служит масс-спектрометрия (60). Преимущество этого метода по сравнению с ДНК-секвенированием по Sanger заключается в том, что не требуется какого-либо мечения ДНК-фрагментов и их последующего разделения в ПААГ, что значительно сокращает время проведения анализа. Многообещающие результаты получены при использовании масс-спектрометрии, основанной на матрично-лазерном десорбционно/ионизационном временнум возбуждении (matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight -- MALDI-TOF). При оценке ПЕН этим методом MALDI-TOF-амплифицированные ПЦР-фрагменты улавливаются стрептовидином, прикрепленным к магнитным микрошарикам, с последующей обработкой последних щелочью с целью получения однонитевой ДНК, которую очищают и гибридизуют с праймером, прикрепленным к сайту, ближайшему к единичному нуклеотиду. После этого в реакционную смесь добавляют один или два нуклеотида, которые последовательно присоединяются к праймеру, причем присоединение нуклеотидов строго специфично и зависит от исследуемого ПЕН. Праймеры с присоединенными нуклеотидами отделяют от матричной ДНК и полученный продукт анализируют посредством масс-спектрометрии. Различие по молекулярной массе полученных продуктов ПЦР-реакции может быть очень точно определено. Однако существует и ряд ограничений. Во-первых, для анализа с использованием MALDI-TOF-методики требуются очень чистые продукты амплификации, поэтому необходим целый комплекс очистки ПЦР-фрагментов до начала реакции. Во-вторых, лишь короткие фрагменты (до 100 п.н.) можно проанализировать с необходимой точностью.

Секвенирование методом молекулярной гибридизации. В 1975 году Southern создал очень производительную методику по определению специфичных последовательностей ДНК среди разнородного набора фрагментов ДНК на основе взаимодействия между комплементарными ДНК-последовательностями (61). В 1981 году Wallace с соавт. показали, что иммобилизированный на мембрану геномный материал может быть гибридизован с комплементарными и мутированными олигонуклеотидами, что дает возможность выявлять различия между ними (62). Исследования Southern и Wallace положили начало современным высокоразрешающим молекулярным блот-гибридизационным технологиям, которые использовали вначале для выявления известных мутаций/изменений; эти технологии получили название аллель-специфичной нуклеотидной гибридизации (allele-specific oligonucleotide hybridization -- ASOH). Поскольку ASOH является техникой для определения установленных ранее или известных геномных перестроек, мы обсудим ее возможности чуть ниже в разделе, посвященном ПЕН.

В 1988 году Лысов с соавт. разработали теоретические принципы метода, названного как секвенирование посредством гибридизации (СПГ) (63). Суть метода состоит в том, что набор коротких олигонуклеотидов (проб) мобилизуется на твердом носителе, а меченая матричная ДНК гибридизуется с прикрепленными олигонуклеотидами. Поскольку последовательность прикрепленных к подложке нуклеотидов известна, можно установить нуклеотидную последовательность матричной ДНК. Лысов с соавт. использовали реверс дот-блот формат, названный формат 2. В этом формате прикрепление на твердом носителе полного набора октамеров (4⁸ = = 65536) позволяло определять до нескольких сотен пар оснований в матричной ДНК. Drmanac с соавт. применяли дот-блот формат, обозначенный как формат 1, который включал 95000 одиннадцатимеров, позволявших секвенировать до 1^.10⁶ п.н. (64). Теоретические принципы СПГ были очень привлекательны, так как этот метод не занимал много времени, был сравнительно недорогим и эффективным. Хотя экспериментальные результаты показали, что СПГ не подходит для секвенирования de novo, он может быть весьма полезен при повторном секвенировании и идентификации мутаций. Основные ограничения метода СПГ заключаются в том, что существуют очень небольшие различия при стабилизации образующегося при гибридизации дуплекса как при полной и точной комплементации олигонуклеотид--ДНК, так и в случае дуплекса, где ошибка ограничена одним нуклеотидом.

Пиросеквенирование. В 1985 году Melamede описал новый метод секвенирования, основанный на принципе синтеза комплементарной цепи ДНК с помощью ПЦР-реакции и получивший название «пиросеквенирование» (65). Принцип метода заключается в том, что готовится реакционная смесь, которая содержит однонитевую ДНК с прикрепленным к гомологичному сайту коротким праймером, ДНК-полимеразу, АТФ-сульфорилазу, люциферазу и апиразу. Четыре нуклеотида подаются в реакционную смесь в определенной последовательности (например CGAT). Если добавленный нуклеотид находит комплементарную ему пару, то ДНК-полимераза встраивает этот нуклеотид в образующуюся цепочку с высвобождением свободного пирофосфата. Свободный пирофорфат и аденозинфосфосульфат с помощью АТФ-сульфорилазы превращаются в АТФ. При этом люцифераза выделяет видимый свет, который легко улавливают фотонным детектором. Избытки нуклеотида и образованного в ходе реакции АТФ утилизирует апираза, которая разрушает нуклеотиды также и в том случае, когда последние не образуют комплементарных пар; при этом ДНК-полимераза не встраивает нуклеотид в образующуюся цепочку и в результате последующих реакций свет не выделяется. На сегодня пиросеквенирование позволяет очень точно определять последовательности ДНК длиной до 30-40 п.н. Однако при секвенировании последовательностей более 30-40 п.н. могут возникать ошибки, которые практически невозможно устранить. Этот метод позволяет проводить секвенирование неизвестных полиморфных последовательностей, включая мутации или другие изменения на нуклеотидном уровне (66). Если мутация известна, то методом пиросеквенирования можно выявить различия между вариантами аллелей (67). Уникальность пиросеквенирования при анализе на молекулярном уровне заключается в том, что каждая комбинация аллелей (гомо- и гетерозиготы) дает специфичный образец, или шаблон, который можно сравнить с двумя другими вариантами, или шаблонами комбинаций аллелей единичных нуклеотидов.

Наиболее часто на молекулярном уровне встречаются изменения единичных нуклеотидов, частота которых зависит от вида растений и составляет примерно 1 ПЕН на каждые 100-1300 п.н. (68). Как правило, методы для оценки ПЕН основаны на секвенировании генома. В дополнение к описанным выше методам методы ПЕН-фингерпринтинга можно разделить на четыре группы: минисеквенирование, или удлинение единичного нуклеотида (single base extension -- SBE); анализ лигирования олигонуклеотидов; гибридизация коротких нуклеотидов и матричной ДНК (СПГ); аллель-специфичная амплификация и выявление различий с помощью ДНК-полимеразной реакции.

Все вышесказанное свидетельствует о многообразии методов и подходов для оценки генетических изменений и вариаций генотипов на молекулярном уровне. Следует отметить, что методы, основанные на электрофоретическом разделении и анализе (прежде всего белков и аллоферментов), имеют меньшую точность и чувствительность и требуют дальнейшей доработки (за исключением метода секвенирования по Sanger), однако они по-прежнему остаются востребованными благодаря дешевизне. В то же время применение дорогостоящих высокопроизводительных методов позволяет значительно снизить себестоимость в пересчете на единицу анализа.

Морфологические признаки и белки--альтернатива ДНК-маркерам?

Долгое время идентификацию видов, семейств и родов живых организмов проводили на основе морфологических признаков. Более того, морфологические признаки так же, как и онтогенетические свойства, были объектом многочисленных исследований в популяционной генетике и сельскохозяйственной биологии. С помощью методов классической генетики и селекции оценивают генофонд популяций, корреляционные взаимодействия, уровень изменчивости, генетическое разнообразие и др. В отличие от молекулярных маркеров морфологические признаки сильно подвержены воздействию окружающей среды, поэтому, для того чтобы различать генотипическую изменчивость от фенотипической или морфологической, требуются специальные схемы проведения экспериментов. Для целого ряда нецветковых растений (например мхов, водорослей) и грибов часто бывает трудно найти достаточное количество морфологических признаков для всеобъемлющего систематического обследования. Альтернативой этому могут служить молекулярные методы, предоставляющие исследователю практически неограниченное число потенциальных маркеров.

С одной стороны, можно выделить три основных преимущества использования белковых маркеров по сравнению с ДНК-маркерными системами: низкая стоимость химических реагентов и лабораторного оборудования; большое количество образцов может быть проанализировано за сравнительно короткое время; аллоферментные маркеры, как правило, кодоминантны (чего нельзя сказать об остальных белковых маркерах). С другой стороны, существует целый ряд ограничений использования аллоферментных маркеров (как, впрочем, и любого белкового маркера) при выявлении генетической изменчивости. Например, новый аллель может быть оценен как полиморфный только в том случае, если замена нуклеотида в ДНК приведет к замене аминокислоты в белке и изменению электрофоретической подвижности молекул последнего. Не при каждой замене аминокислоты может измениться заряд или молекулярная масса белка, поэтому всего 30 % всех нуклеотидных замен выявляются электрофорезом, что обусловлено также вырожденностью генетического кода. Другим ограничением является полиплоидность многих видов растений, что существенно затрудняет анализ аллоферментов (69). Более практический аспект заключается в том, что из растительных тканей следует незамедлительно после сбора выделять аллоферменты или другие белки, характеризующиеся нестабильностью.