Экспрессия гена капсидного белка Х-вируса шалота в различных органах растений Allium cepa var. Aggregatum

Размещено на http://www.allbest.ru/

Экспрессия гена капсидного белка Х-вируса шалота в различных органах растений Allium cepa var. Aggregatum

В.К. Вишниченко

Д.Ю. Рязанцев

С.К. Завриев

EXPRESSION OF CAPSID PROTEIN GENE OF SHALLOT

X-VIRUS IN DIFFERENT ORGANS OF Allium cepa var. aggregatum

V.K. Vishnichenko, D.Yu. Ryazantsev, S.K. Zavriev

S u m m a r y

By the method of immunoblotting the synthesis of two forms of capsid protein of shallot X-virus in the shallot roots and leaves was investigated. The mechanism of alternative expression of ХВШ capsid protein gene was described. It was shown, that 28K-form is synthesized and taken part in virus formation only in the roots of infected plants, but 37K-form of capsid protein -- only in juvenile and mature leaves. It was suggested, that phenomenon of alternative expression of capsid protein of shallot X-virus is due to different mechanisms of viral genome RNA transcription functioning in roots and leaves of infected plants with formation of two different form of subgenome RNA as matrix for synthesis of capsid protein.

Методом иммуноблоттинга исследовали синтез двух форм капсидного белка Х-вируса шалота (ХВШ) в корнях и листьях растений шалота. Обсуждается механизм феномена альтернативной экспрессии гена капсидного белка ХВШ.

Х-вирус шалота (ХВШ) был открыт в лаборатории молекулярной вирусологии Всероссийского НИИ сельскохозяйственной биотехнологии в 1991 году и в дальнейшем послужил прототипом нового рода Allexivirus семейства Flexiviridae (1-3). Следует отметить, что распространенное название «шалот» относится к двум различным видам рода Allium (4): A. oschaninii O. Fedtsch -- встречается в диком состоянии и распространен как овощная культура в Центральной и Юго-Западной Азии (Монголия, Афганистан), послужил исходной формой при селекции различных сортов знаменитого французского серого шалота («настоящий» шалот, или «гризелла»); A. cepa var. aggregatum -- распространен в основном в странах средиземноморского бассейна, в диком состоянии не встречается. Первоначально ХВШ был выявлен в растениях шалота A. cepa var. aggregatum селекции Всероссийского НИИ селекции и семеноводства овощных культур (сортообразец № 803), механически инокулированных экстрактами растений шалота A. oschaninii (сорт Тагар, Монголия), в которых присутствовали гибкие вирусные частицы, предположительно (и, как оказалось, ошибочно) идентифицированные как потивирус (1). По данным Черемушкиной с соавт., сортообразец № 803 был свободен от известных и наиболее распространенных вирусов, поражающих Allium spp., -- латентного вируса шалота (карлавирус) и двух потивирусов (желтой карликовости лука и желтой штриховатости лука-порея) (5).

Таким образом, в этих экспериментах был выделен изолят вируса, который на основании результатов определения полной нуклеотидной последовательности его геномной РНК был идентифицирован нами как новый ранее неизвестный фитовирус, названный Х-вирусом шалота, природным хозяином которого служили растения шалота A. oschaninii (1, 6). В дальнейшем вирус поддерживали посредством репродукции в вегетативно размножаемых растениях шалота A. cepa var. aggregatum, по данным серологического анализа, свободных от карла- и потивирусов, встречающихся в растениях рода Allium (7). При этом следует отметить, что изоляты ХВШ, природными хозяевами которых могут служить растения различных сортов A. cepa var. aggregatum, до настоящего времени не идентифицированы и не исследованы.

Все аллексивирусы передаются эриофидами Aceria tulipae и характеризуются чрезвычайно узким спектром восприимчивых растений-хозяев (8-10). В частности ХВШ, по-видимому, продуктивно репродуцируется только в своем природном хозяине -- растениях шалота; в растениях других видов в невысоких концентрациях были обнаружены серологически родственные ХВШ вирусные частицы, однако строгая идентификация этих изолятов до сих пор не осуществлена (11, 12). Экспериментальную работу с аллексивирусами затрудняет также то обстоятельство, что различные виды рода Allium, включая шалот, инфицированы, как правило, комплексом вирусов и растения, которые могли бы служить дифференциирующими хозяевами, пока не найдены.

Геном ХВШ представлен одноцепочечной РНК положительной полярности длиной 8890 нуклеотидов и содержит шесть открытых рамок считывания (ОРС), одна из которых (ОРС4) кодирует белок с молекулярной массой 42 кД. Гомологи этого белка за пределами рода Allexivirus до настоящего времени не обнаружены. Структура остальной части генома ХВШ свидетельствует о том, что филогенетически аллексивирусы занимают близкую позицию к карла- и потексвирусам (3, 5).

Ген капсидного белка ХВШ (ОРС5) кодирует белок с молекулярной массой 28 кД (6). Однако в экстрактах листьев растений шалота, инфицированных ХВШ, а также в соответствующих очищенных вирусных препаратах присутствуют два типа серологически родственных капсидных белков с молекулярной массой 28 и 37 кД (1, 7). Механизмы синтеза и функциональная активность этих двух форм капсидного белка ХВШ неизвестны. Одним из экспериментальных подходов к решению этих проблем может служить исследование распределения той или иной формы капсидного белка ХВШ в клеточных структурах различных органов инфицированных растений, в частности в корнях. Имеются веские основания полагать, что вирусная инвазия корневой системы растения-хозяина представляет собой перспективную модель, позволяющую исследовать как молекулярные механизмы ингибирования вирусной инфекции по типу «умолчания генов», так и идентифицировать клеточные сигналы/факторы, индуцирующие защитные реакции и вирусспецифические супрессоры этого процесса (13).

В задачу нашего исследования входила локализация 28К- и 37К- форм капсидного белка ХВШ в различных компартментах клеток корней и листьев инфицированных растений шалота A. cepa var. aggregatum с целью выявления молекулярных механизмов образования вирионов ХВШ, различающихся по морфологическим признакам, а также оценки экспрессии и роли различных форм капсидного белка ХВШ в процессе вирусной инфекции.

Методика. Инфицированные ХВШ луковицы шалота высаживали в почву и выращивали в течение 1-3 нед. Для прямого серологического анализа экстрактов различных частей растений использовали свежие образцы листьев (ювенильные и зрелые) или корней. Очищенные вирусные препараты выделяли с помощью ранее описанного нами метода, предварительно разрушая ткани в ступке в присутствии жидкого азота (1). Разрушенные в жидком азоте ткани корней или листьев гомогенизировали в ступке (масса:объем -- 1:5) с буфером следующего состава: 15 мМ MOPS (pH 7,4), 450 мМ сахароза, 1,5 мМ ЭДТА, 0,2 % бычий сывороточный альбумин, 10 мM дитиотреотол, 0,2 мМ фенилметилсульфонилфлюорид и 0,6 % поливинилпирролидон (14). Этот гомогенат фильтровали через мираклот (Miracloth, Calbiochem), фильтрат центрифугировали при 3000 g в течение 10 мин. Осадок, содержащий клеточные стенки, сохраняли, надосадочную жидкость декантировали и центрифугировали при 10000 g в течение 30 мин. Полученный осадок сохраняли, надосадочную жидкость центрифугировали при 30000 g в течение 30 мин. Осадок сохраняли, а фракцию микросом выделяли центрифугированием надосадочной жидкости при 100000 g в течение 30 мин. Все осадки, содержащие тот или иной исследуемый материал (клеточные стенки, митохондрии, пероксисомы или микросомы), суспендировали в воде. Серологический анализ вирусных белков в экстрактах различных частей растений, очищенных вирусных препаратах и исследуемых клеточных фракциях проводили методом иммуноблоттинга с использованием антисыворотки против рекомбинантного капсидного белка ХВШ, обладающей очевидным преимуществом перед антисыворотками, полученными посредством иммунизации животных вирусными препаратами. Детекцию белковых фракций осуществляли либо с помощью конъюгата антител с пероксидазой и соответствующего субстрата (TMB, Fermentas), либо прямым флюоресцентным методом с использованием антикроличьих иммуноглобулинов, конъюгированных с флюоресцентным красителем Cy3 (15). В последнем случае мембраны сканировали на лазерном сканере Typhoon 9200 ( = 532 нм, эмиссионный фильтр 580BP30, Amersham).

ген белок шалот

Результаты

При инициации вирусной инфекции в прорастающих луковицах шалота вирус может репродуцироваться как в ювенильных листьях, так и в корнях, которые на этой стадии онтогенеза развиваются наиболее интенсивно. На первом этапе работы мы провели серологический анализ нефракционированных экстрактов различных частей растений (рис. 1). В экстрактах корней инфицированных растений 28К-форма капсидного белка присутствовала постоянно и в высокой концентрации, тогда как 37К-форма обнаруживалась только на начальных стадиях инфекции (см. рис. 1, дорожки 1 и 2). При этом остается неизвестным, включается ли 37К-форма в состав вирусных частиц. В ряде экспериментов было показано, что в экстрактах листьев на поздних стадиях инфекции концентрация 37К-формы капсидного белка также может быть низкой (см. рис. 1, дорожка 4). Однако в выделенных из таких листьев вирусных препаратах 37К-форма присутствовала всегда (см. рис. 1, (+)-дорожка).

Методом иммуноблоттинга определяли наличие двух форм капсидного белка ХВШ в очищенных вирусных препаратах и в различных компартментах клеток корней и ювенильных листьев прорастающих луковиц на 5-е сут после высадки в грунт (рис. 2). В очищенных вирусных препаратах и во всех исследованных компартментах клеток ювенильных листьев выявлена в основном (а во многих экспериментах и исключительно) 37К-форма капсидного белка. В соответствующем материале, полученном из корней, напротив, была обнаружена 28К-форма капсидного белка, тогда как 37К-форма присутствовала только во фракции митохондрий (см. рис. 2А, дорожка 2). Аналогичные результаты были получены при анализе экстрактов из корней и зрелых листьев шалота на более поздней стадии инфекции -- на 23-и сут после высадки луковиц в почву (см. рис. 2, В и Г).

Рис. 2. Иммуноблоттинг экстрактов различных компартментов клеток корней (А и В) и листьев (Б и Г) растений шалота на стадии инициации (А и Б) и поздних стадиях (В и Г) ХВШ-инфекции. А, Б и Г: 1 -- очищенный препарат ХВШ; 2, 3 и 4 -- фракция соответственно митохондрий, пероксисом и микросом. В: 1 -- очищенный препарат ХВШ; 2, 3, 4 и 5 -- фракция соответственно клеточных стенок, митохондрий, пероксисом и микросом. Детекцию белковых фракций осуществляли прямым флюоресцентным методом с использованием антикроличьих иммуноглобулинов, конъюгированных с флюоресцентным красителем Cy3.

Представленные данные свидетельствуют о том, что в корнях и листьях шалота функционируют альтернативные механизмы экспрессии гена капсидного белка ХВШ. В листьях имеет место интенсивный синтез 37К-формы капсидного белка, который присутствует во всех исследованных компартментах инфицированных клеток и входит в состав вирусных частиц. В корнях вирионы формируются при участии 28К-формы капсидного белка, тогда как 37К-форма накапливается в митохондриях и не включается в состав вирусных частиц. Тонкая структура образующихся в корнях вирионов не исследована, и остается неясным, к какому из двух описанных нами ранее морфологических классов вирионов ХВШ относятся образующиеся в корнях шалота вирусные частицы (7).

Детали молекулярных альтернативных механизмов синтеза двух форм капсидного белка ХВШ в различных органах растений шалота неизвестны. Не исключено, что в корнях и листьях инфицированных растений механизмы транскрипции вирусной геномной РНК различаются, в результате чего образуется две формы субгеномных РНК, служащих матрицами для синтеза капсидного белка. Ключевую роль в этих процессах могут играть растительные белки, обладающие функцией органоспецифических факторов транскрипции (16). Показано, что процесс репродукции вируса табачной мозаики в корнях Nicotiana benthamiana ингибируется в результате действия защитного механизма по типу «умолчания генов», запускаемого мобильным сигналом в клетках корневой меристемы и активирующемся вновь в результате действия супрессора вируса погремковости табака (13). Представленные нами данные позволяют предположить, что 37К-форма капсидного белка ХВШ в процессе вирусной инфекции обладает бинарной функцией и в корнях функционирует не как собственно капсидный белок (вирионы с участием 37К-формы в корнях не формируются), а как фактор, связывающий образующийся в клетках корневой меристемы мобильный сигнал, выяснение природы которого требует дополнительных экспериментов.

Литература

V i s h n i c h e n k o V.K., K o n a r e v a T.N., Z a v r i e v S.K. A new filamentous virus in shallot. Plant Pathology, 1993, 42: 121-126.

Z a v r i e v S.K., V i s h n i c h e n k o V.K. Genus Allexivirus. In Virus Taxonomy. Classification and Nomenclature of Viruses. Seventh Report of the ICTV. San Diego, 2002.

A d a m s M.J., A n t o n i w J.F., B a r - J o s e p h M. e.a. The new plant virus family Flexiviridae and assessment of molecular criteria for species demarcation. Archives of Virology, 2004, 149: 1213-1217.

Allium Crop Science: Recent Advances /Eds. H.D. Rabinowitch, L. Currah. Israel, 2002.

Ч е р е м у ш к и н а Н.П., Ш и ш к и н а М.С., Л у к о н и н а Е.И. Использование листовых луков в селекции устойчивых к заболеваниям сортов шалота. Докл. РАСХН, 1989, 3: 41-44.

K a n y u k a K.V., V i s h n i c h e m k o V.K., L e v a y K.E. e.a. Nucleotide sequence of shallot virus X RNA reveals a 5'-proximal cistrons closely related to those of potexviruses and a unique arrangement of 3'-proximal cistrons. J. Gen. Virol., 1992, 73: 2553-2560.

В и ш н и ч е н к о В.К., С т е л ь м а щ у к В.Я., З а в р и е в С.К. Исследование морфологической гетерогенности частиц Х вируса шалота в условиях моновирусной инфекции. Мол. биол., 1996, 30: 959-968.

V a n D i j k P., V e r b e e k M., B o s L. Mite-borne virus isolates from cultivated Allium species, and their classification into two new rymoviruses in thq family Potyviridae. Netherland J. of Plant Pathol., 1991, 97: 381-399.

V a n D i j k P., V a n der V l u g t R.A.A. New mite-borne virus isolates from rakkyo, shallot and wild leek species. European J. of Plant Pathol., 1994, 100: 269-277.

S u m i S-I., T s u n e y o s h i T., F u r u t a n i H. Novel rod-shaped virus isolated from garlic, Allium sativum, possessing a unique genome organization. J. of General Virol., 1993, 74: 1879-1885.

В и ш н и ч е н к о В.К., А р у ш а н о в а Е.С., К е л д ы ш М.А. и др. Серологически родственный Х вирусу шалота (ХВШ) гибкий нитевидный вирус в растениях, не принадлежащих к роду Allium. Докл. РАСХН, 1999, 2: 23-25.

Б а й к а л о в а О.С., В и ш н и ч е н к о В.К., К е л д ы ш М.А. и др. Обнаружение аллексивирусов в составе вирусных комплексов, поражающих декоративные луковичные растения. Докл. РАСХН, 2002, 1: 11-13.

V a l e n t i n e T.A., R o b e r t s I.M., O p a r k a K.J. Inhibition of tobacco mosaic virus replication in lateral roots is dependent on an activated meristem-derived signal. Protoplasma, 2002, 219: 184-196.

G u a l b e r t o J.M., H a n d a H., G r i e n e n b e r g e r J.M. Isolaton and fractionation of plant mitochondria and chloroplasts: specific examples. Methods in Cell Biology, 1995, 50: 161-175.

Fluorescent Western Blotting. Application Note 63-0043-05 2001: 1-4.

G u t i e r r e z R.A., G r e e n P.J., K e e g s t r a K. e.a. Phylogenetic profiling of the Arabidopsis thaliana proteome: what proteins distinguish plants from other organisms?. Genome Biology, 2004, 5, R53: 1-16.

Размещено на Allbest.ru